周媛媛，郭爽，王瑩，劉雨新，付蕾，孫延平

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040)

北青龍衣是野生山核桃的未成熟果實(shí)青皮，主要產(chǎn)地有黑龍江東部，吉林、遼寧東部山區(qū)，內(nèi)蒙古等地[1]。其味辛、苦，性平、澀，具有清熱、祛風(fēng)、止痛等功效[2]。尤其在抗腫瘤方面(如肺癌、胃癌及肝癌等)有顯著作用，在民間得到廣泛應(yīng)用[3]，為尋找抗腫瘤新藥提供了新的契機(jī)。本實(shí)驗(yàn)在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用95%乙醇回流提取結(jié)合多種色譜柱分離，成功分離了7個(gè)化合物，分別是熊果酸乙酯(1)，20(R)-24β-羥基-20，25-環(huán)氧-達(dá)瑪烷-3-酮(2)，1，7-二羥基-3，6-二甲氧基蒽醌(3)，反式鄰羥基肉桂酸(4)，4-羥甲基-2-甲氧基苯酚(5)，沒食子酸甲酯(6)，4-甲氧基-5-羥基-1-四氫萘酮(7)。

1 儀器與材料

Q-Tof(ESI)高分辨質(zhì)譜儀(美國WATERS)； Bruker-400型超導(dǎo)核磁共振光譜儀(美國BRUKER)； AB-8型大孔吸附樹脂(南開大學(xué)化工廠)；Waters2414高效液相色譜儀(美國WATERS)；Atlantis Prep T3制備柱(19mm×250mm，10μm)；反相ODS(日本YMC);Sephadex LH-20(Pharmacia 公司)柱色譜;硅膠 (200～300目，青島海洋化工廠)；其它試劑均為分析純。

北青龍衣產(chǎn)地為黑龍江省牡丹江地區(qū)，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物學(xué)教研室蘇連杰教授鑒定為胡桃楸JuglandmandshuricaMaxim的未成熟外果皮。標(biāo)本(20150815)保存于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院。

2 提取分離

青龍衣新鮮藥材，烘干后取5 kg粉粹，95%乙醇冷浸2 d后，加熱回流3次，合并濾液減壓得到浸膏415 g。用適量水混懸后，利用大孔樹脂色譜分段富集，先后用水、30%乙醇、50%乙醇及95%乙醇洗脫，其中95%乙醇洗脫部位42 g，反復(fù)硅膠柱層析(氯仿-甲醇100∶0→0∶100系統(tǒng)梯度洗脫)結(jié)合Sephadex LH-20純化后得到化合物1(8.1 mg)，化合物2(4.0 mg)，化合物3(5.7 mg)，化合物7(4.4 mg)；50%乙醇洗脫部位55 g，反復(fù)硅膠柱層析(氯仿-甲醇100∶0→0∶100系統(tǒng)梯度洗脫)結(jié)合ODS柱色譜、制備型HPLC分離得到化合物4(6.3 mg)，化合物5(3.5 mg)，化合物6(3.9 mg)。結(jié)構(gòu)見圖1。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物 1：白色針狀結(jié)晶(MeOH)，ESI-MS m/z：483 [ M-H ]-，推測分子量為484。1H-NMR(CDCl3，400MHz) δ：5.22(1H，s， H-12)，4.52(1H，t，J=7.6Hz，H-3)，2.05(3H，s，-OAc)，1.26(3H，s，H-23)，1.24(3H，s，H-24)，1.09(3H，s，H-26)，0.93(3H，s，H-27)，0.84(6H，d，J=7.2Hz，H-29，30)，0.73 (2H，m，H-11)，1.75(1H，t，J=10.6Hz，H-5)，1.72(3H，s，H-26)，1.63(3H，s，H-25)。13C-NMR(CDCl3，125MHz) δ：183.2 (C-28)，170.6(C-OAc)，137.8(C-13)，125.5(C-12)，79.2(C-3)，52.6(C-5)，52.5(C-18)，47.6(C-17)，47.2(C-9)，41.8(C-14)，39.4(C-8)，38.8(C-4)，38.7(C-19)，38.4(C-1,20)，37.4(C-10)，36.6(C-22)，33.3(C-7)，30.1(C-21)，28.1(C-2)，27.9(C-23)，27.8(C-15)，24.3(C-16)，23.2(C-11，27)，21.3(C-30)，20.6(C- OAc)，18.5(C-6)，17.2(C-29)，16.8(C-26)，15.5(C-25)，14.3(C-24)。分析以上波譜數(shù)據(jù)并與文獻(xiàn)[4]對(duì)照，鑒定化合物1為熊果酸乙酯。

化合物 2：白色針狀結(jié)晶(EtOAc)，ESI-MS m/z：457 [ M-H ]-，推測分子量為458。1H-NMR(CDCl3，400MHz) δ：1.32(3H，s，H-26)，1.18(3H，s，H-27)，1.15 (3H，s，H-21)，1.09(3H，s，H-28)，1.05(3H，s，H-29)，0.99(3H，s，H-18)，0.95(3H，s，H-28)，0.88(3H，s，H-30)，1.02～2.55(24H，m)。13C-NMR(CDCl3，125MHz) δ：217.9(C-3)，78.6(C-24)，75.6(C-20)，73.0(C-25)，55.1(C-5)，50.6(C-14)，49.6(C-17)，49.9(C-9)，47.5(C-4)，42.3(C-13)，40.4(C-8)，39.6(C-1)，37.0(C-22)，36.5(C-10)，34.3(C-7)，34.1(C-2)，31.2(C-15)，27.5(C-12)，26.5(C-28)，26.4(C-27)，25.5(C-16)，25.4(C-21)， 23.5(C-26)，22.7(C-23)，22.2(C-29)，22.1(C-11)，19.4(C-6)，16.4(C-30)，16.1(C-18)，15.4(C-19)。分析以上波譜數(shù)據(jù)并與文獻(xiàn)[5]對(duì)照，鑒定化合物2為20(R)-24β-羥基-20，25-環(huán)氧-達(dá)瑪烷-3-酮。

化合物 3：橙色針晶(MeOH)。ESI-MS m / z：299 [ M-H]-，推測分子量為300。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ：7.56 (1H，s，H-5)，7.52 (1H，s，H-8)，7.15(1H，d，J=2.2Hz，H-4)，6.82(1H，d，J=2.2Hz，H-2)，3.95(3H，s，6-OMe)，3.92(3H，s，3-OMe)。13C-NMR(CD3OD，125MHz) δ：186.7(C-9)，180.9(C-10)，166.2(C-3)，165.0(C-1)，153.5(C-6)，153.2(C-7)，135.5(C-4b)，127.0(C-4a)，126.8(C-8a)，112.5(C-8)，110.5(C-8b)，110.0(C-5)，107.9(C-4)，106.5(C-2)，56.7(6-OMe)，56.4(3-OMe)。分析以上波譜數(shù)據(jù)與并文獻(xiàn)[6]對(duì)照，鑒定化合物3為1，7-二羥基-3，6-二甲氧基蒽醌。

化合物 4：白色結(jié)晶(MeOH)。ESI-MS給出163 [M-1]-，分子量應(yīng)為164。1H-NMR(CD3OD，400MHz) δ：8.03(1H，d，J=16.8 Hz，H-7)，7.52(1H，d，J=8.0 Hz，H-6)，7.23(1H，t，J=8.0Hz，H-4)，6.90(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，6.89(1H，dd，J=8.0 Hz，H-3)，6.60(1H，dd，J=16.8Hz，H-8)。13C-NMR(CD3OD，125MHz) δ：172.0(-COOH)，158.6(C-2)，142.7(C-7)，132.8(C-4)，129.8(C-6)，123.5(C-1)，121.2(C-5)，119.6(C-8)，117.8(C-3)。分析以上波譜數(shù)據(jù)并與文獻(xiàn)[7]對(duì)照，鑒定化合物4為反式鄰羥基肉桂酸。

圖1 化合物1～7結(jié)構(gòu)

化合物5：淡黃色結(jié)晶(MeOH)。EI-MS m / z：154 [ M ]+，推測分子量為154。1H-NMR(CD3OD，400MHz) δ：7.56(1H，d，J=2.2 Hz，H-3)，7.50(1H，dd，J=8.8，2.2 Hz，H-5)，6.77(1H，d，J=8.8 Hz，H-6)，3.86(3H，s，-OCH3)，3.30(2H，s，-CH2OH)。13C-NMR(CD3OD，125MHz) δ：150.4(C-2)，148.4(C-1)，130.1(C-4)，124.0(C-5)，115.9(C-6)，114.7(C-3)，63.0(4-CH2OH)，56.7(2-OCH3)。分析以上波譜數(shù)據(jù)并與文獻(xiàn)[8]對(duì)照，鑒定化合物5為4-羥甲基-2-甲氧基苯酚。

化合物 6：淺黃色粉末(甲醇)，EI-MS(m/z)：184[M]+，表明相對(duì)分子量為184。1H-NMR(CD3OD，400MHz) δ：7.05(2H，s，H-2，6)，3.88(3H，s，COOCH3)；13C-NMR(CD3OD，125MHz) δ：170.3(COOCH3)，145.8( C-3，5)，140.12(C-4)，122.4(C-1)，109.9(C-6)，109.8(C-2)，54.5(COOCH3)。分析以上波譜數(shù)據(jù)并與文獻(xiàn)[9]對(duì)照，鑒定該化合物6為沒食子酸甲酯。

化合物 7：白色無定形粉末(CHCl3)，EI-MS(m/z)：192[M]+，表明其分子量為192。1H-NMR(400 MHz，CDCl3) δ：8.56(1H，s，5-OH)，7.55 (1H，brd，J=8.2Hz，H-7)，7.36(1H，t，J=8.0Hz，H-8)，7.09(1H，brd，J=8.2Hz，H-6)，5.01(1H，m，H-4)，3.59(3H，s，4-OCH3)，2.84(1H，m，H-2a)，2.65(1H，m，H-2b)，2.29 (1H，m，H-3a)，2.14(1H，m，3b)；13C-NMR(125MHz，CDCl3) δ：196.1(C-1)，156.1(C-5)，132.6(C-9)；129.5(C-7)，126.6(C-10)，122.2(C-6)，119.3(C-8)，80.3(C-4)，55.5 (C-11)，35.8(C-2)，27.6(C-3)。分析以上波譜數(shù)據(jù)并與文獻(xiàn)[10]對(duì)照，鑒定故化合物7為4-甲氧基-5-羥基-1-四氫萘酮。

4 討論

化合物1～4是首次從北青龍衣中分離獲得，分別屬于蒽醌類和三萜類。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道[11-15]，上述類型化合物均具有良好的腫瘤細(xì)胞抑制作用，為進(jìn)一步研究青龍衣中抗腫瘤作用機(jī)理提供了藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。值得注意的是，這些成分是否對(duì)青龍衣中主要成分胡桃醌具有增效減毒的協(xié)同抑制作用還需要進(jìn)一步開展相關(guān)研究。

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