劉玲燕， 黃天鵬， 郝家樂， 陳 然， 范小芳， 龔永生， 毛孫忠

(溫州醫(yī)科大學(xué)低氧醫(yī)學(xué)研究所， 浙江 溫州 325035)

本課題組前期的研究表明：脂質(zhì)代謝異常參與單純低氧誘導(dǎo)的小鼠肺動(dòng)脈高壓的形成[1]。載脂蛋白E(apolipoprotein E，apoE)是脂質(zhì)代謝過程中非常重要的一種載脂蛋白，對血漿膽固醇水平的維持發(fā)揮重要作用。研究表明，apoE主要在肝中合成，血管平滑肌細(xì)胞也能合成和分泌apoE，apoE能抑制血小板源性生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)介導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞增殖和遷移進(jìn)而延緩動(dòng)脈粥樣硬化形成[2-3]，已知肺血管平滑肌細(xì)胞異常增殖是低氧性肺動(dòng)脈高壓重要的病理學(xué)特征[4]，尚不清楚單純低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓形成過程中是否存在apoE表達(dá)異常。

本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制野生型(wild type，WT)小鼠和apoE基因敲除(apoE gene knockout，apoE-KO)小鼠低氧性肺動(dòng)脈高壓模型，觀察血漿脂質(zhì)含量、肺組織apoE和過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptor gamma，PPARγ)蛋白表達(dá)的變化，旨在探討低氧性肺動(dòng)脈高壓形成過程中apoE蛋白表達(dá)的變化及可能的意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

SPF級WT雄性C57BL/6小鼠，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物許可證號SCXK(滬2017-0063)，SPF級雄性apoE-KO小鼠(以C57BL/6為背景)由美國Feinstein研究所shu fang liu實(shí)驗(yàn)室惠贈。小鼠血漿高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、總膽固醇(total cholesterol，TC)等ELISA試劑盒購自美國Phoenix Pharm Inc.；apoE、PPARγ抗體購自Abcam公司。

1.2 動(dòng)物模型的制備

SPF級WT雄性C57BL/6小鼠和雄性apoE基因敲除(apoE-KO)小鼠各20只，各隨機(jī)再分為2組(n=10)：常氧組和低氧組，共4組。低氧組小鼠置于常壓低氧艙內(nèi)(9%～11% O2，CO2<3%，23 h/d)，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，連續(xù)3周；常氧組自由呼吸空氣，其它飼養(yǎng)條件與低氧組相同。

1.3 動(dòng)物處理與標(biāo)本留取

3周后，稱量動(dòng)物體重，采用異氟烷吸入法麻醉動(dòng)物，從右側(cè)頸外靜脈插管至右心室，經(jīng)PowerLab生理信號處理系統(tǒng)(AD Instruments Inc.，Australia)記錄右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure，RVSP)，用RVSP來間接反映小鼠肺動(dòng)脈壓。腹動(dòng)脈取血，裝入預(yù)冷含肝素的EP管中，離心后取上清，-70℃保存待測血脂含量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后放血處死動(dòng)物，立即取出心臟，分別稱取左心室加室間隔(left ventricle plus septum，LV+S)和右心室(right ventricle，RV)的重量，以RV/(LV+S)的重量比來反映右心室肥大情況。每組隨機(jī)取6只小鼠右肺組織、右肝組織各約100 mg用于提取總蛋白，待測apoE、PPARγ蛋白的表達(dá)。

1.4 血漿膽固醇含量檢測

ELISA試劑盒檢測血漿TC、LDL、HDL含量，按照試劑盒說明書操作。

1.5 組織蛋白表達(dá)檢測

肺組織或肝組織加RIPA裂解液1 ml，經(jīng)玻璃勻漿器研磨制備勻漿。經(jīng)SDS- PAGE Bio-Rad電泳分離(上樣總蛋白量為30 μg)，4℃電轉(zhuǎn)膜過夜，封閉后依次加入apoE(1∶200)一抗或PPARγ(1∶400)一抗，二抗，采用超敏型化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，Bio-Rad成像儀拍照成像，用Image Lab 4.0圖像分析軟件分析處理。以GAPDH為內(nèi)參照物，計(jì)算待測條帶吸光度與GAPDH吸光度的相對比值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 低氧對小鼠RVSP和RV/(LV+S)的影響

低氧組WT小鼠RVSP和RV/(LV+S)較常氧組分別高68%和59%(P均<0.05)，低氧組apoE-KO小鼠RVSP和RV/(LV+S)較常氧組分別高96%和86%(P均<0.05)；常氧組apoE-KO小鼠RVSP和RV/(LV+S)與常氧組WT小鼠相比均無顯著性差異(P均>0.05)；而低氧組apoE-KO小鼠較低氧組WT小鼠分別高 29%和24%(P均< 0.05，表1)。

NormoxiaWT apoE-KOHypoxiaWT apoE-KORVSP (mmHg)24.00±6.0026.67±2.4540.41±7.62?52.34±15.36?#RV/(LV+S)0.21±0.030.23±0.030.35±0.04?0.43±0.10?#

RVSP: Right ventricular systolic pressure;

RV/(LV+S): The weight ratio of right ventricle (RV) to left ventricle plus septum (LV+S)

*P<0.05vsnormoxia;#P<0.05vsWT

2.2 低氧對小鼠血脂含量的影響

低氧組WT小鼠血漿中TC、LDL含量與常氧組相比均無顯著性差異(P均>0.05)，而HDL含量及HDL/LDL比值較常氧組分別低17%和40%(P均<0.05)。低氧組apoE-KO小鼠血漿中TC、LDL、HDL含量及HDL/LDL比值與常氧組相比均無顯著性差異(P均>0.05)；常氧組apoE-KO小鼠TC和LDL較WT小鼠分別高6倍、2.4倍(P均<0.05)，而HDL和HDL/LDL比值較WT小鼠分別低23%、 78.8%(P均<0.05，表2)。

NormoxiaWT apoE-KOHypoxiaWT apoE-KOTC (mmol/L)2.17±0.3915.28±1.19#2.20±0.1315.85±1.23#LDL (mg/dl)41.97±5.94142.94±9.89#48.38±4.34 143.68±10.20#HDL (mg/dl)31.03±1.3223.84±4.08#25.63±1.25?25.04±2.11HDL/LDL0.86±0.160.18±0.04#0.52±0.10?0.18±0.02#

TC: Total cholesterol; LDL: Low density lipoprotein; HDL: High density lipoprotein

*P<0.05vsnormoxia;#P<0.05vsWT

2.3 低氧對WT小鼠apoE、PPARγ蛋白表達(dá)的影響

低氧組WT小鼠肺、肝組織中apoE蛋白表達(dá)較常氧組分別下調(diào)48%和52%(P均<0.05，圖1A，1B)，肺組織中PPARγ蛋白表達(dá)較常氧組顯著下調(diào)37%(P<0.05，圖1C)。

Fig.1Effects of hypoxia on relative protein expressions of apoE and PPARγ in WT mice

*P<0.05vsnormoxia

2.4 相關(guān)性分析

Pearson 相關(guān)性分析顯示：WT小鼠RVSP與肺組織中apoE和PPARγ蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析表明：RVSP與apoE(r=-0.723，P=0.008)及PPARγ(r=-0.823，P=0.001)蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(P均<0.01，圖2A，2B)。

Fig.2Correlation analysis of RVSP and apoE, PPARγ protein expression in WT mice

3 討論

近年來脂質(zhì)代謝異常在肺動(dòng)脈高壓中的作用備受關(guān)注，臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：肥胖、高脂血癥、胰島素抵抗與肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5-7]。本課題組前期的研究表明：脂質(zhì)代謝異常參與單純低氧誘導(dǎo)的小鼠肺動(dòng)脈高壓的形成[1]。apoE是血漿脂蛋白的蛋白質(zhì)部分，為LDL受體的配體，通過LDL受體由肝攝取膽固醇酯殘粒，對血漿膽固醇水平的維持起重要作用，是降低血漿中氧化型LDL含量和抑制血管壁動(dòng)脈粥樣硬化斑形成的保護(hù)因子，與高脂血癥和冠心病密切相關(guān)，目前主要應(yīng)用于抗動(dòng)脈粥樣硬化方面的研究[8]。作為一種蛋白質(zhì)因子，apoE還具有抗炎、抗脂質(zhì)氧化以及抗血小板源性生長因子誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞增殖和遷移等作用[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，平滑肌細(xì)胞也能合成和分泌apoE，并且apoE通過結(jié)合LDL受體相關(guān)蛋白和內(nèi)化PDGFR-β[9-10]，抑制PDGF介導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，進(jìn)而延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程[2]，尚不清楚單純低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓形成過程中是否存在apoE表達(dá)異常。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：低氧組小鼠RVSP與RV/(LV+S)較常氧組均顯著升高，提示低氧性肺動(dòng)脈高壓小鼠復(fù)制成功[11]。同時(shí)，低氧組WT小鼠血漿中TC、LDL含量與常氧組相比雖然無顯著性差異，但HDL含量和HDL/LDL比值較常氧組顯著降低，提示低氧誘導(dǎo)的脂質(zhì)代謝異常參與低氧性肺動(dòng)脈高壓的形成[1]。令人感興趣的是，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示：低氧組WT小鼠肺組織和肝組織中的apoE蛋白表達(dá)較常氧組顯著下調(diào)，并且RVSP與肺組織apoE蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，已知apoE是脂質(zhì)代謝過程中非常重要的一種載脂蛋白，對血漿膽固醇水平的維持發(fā)揮重要作用，apoE主要在肝中合成，肝臟產(chǎn)生的apoE約占全身產(chǎn)量的75%，提示肺組織apoE蛋白表達(dá)下調(diào)可能參與低氧性肺動(dòng)脈高壓的形成。低氧誘導(dǎo)肺組織apoE蛋白表達(dá)下調(diào)可能與低氧誘導(dǎo)肺組織PPARγ蛋白表達(dá)下調(diào)有關(guān)[12]，也可能與低氧下調(diào)肝組織apoE蛋白表達(dá)，減少apoE合成有關(guān)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

為進(jìn)一步說明apoE在單純低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓形成過程中的意義，我們同時(shí)選用apoE-KO小鼠復(fù)制低氧性肺動(dòng)脈高壓，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：低氧組apoE-KO小鼠RVSP與RV/(LV+S)較常氧組均顯著升高，同時(shí)低氧誘導(dǎo)apoE-KO小鼠肺動(dòng)脈高壓和右心室肥厚程度較低氧誘導(dǎo)WT小鼠的更為明顯，表明apoE基因缺陷促進(jìn)單純低氧誘導(dǎo)小鼠肺動(dòng)脈高壓的形成，進(jìn)一步提示低氧性肺動(dòng)脈高壓形成與肺組織apoE蛋白表達(dá)下調(diào)有關(guān)。有關(guān)外源性apoE是否具有防治低氧性肺動(dòng)脈高壓的作用，apoE防治低氧性肺動(dòng)脈高壓具體的分子機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，低氧組WT小鼠肺組織PPARγ蛋白表達(dá)較常氧組顯著下調(diào)，且RVSP與肺組織PPARγ蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，這與Gong等[12]的研究結(jié)果相符，提示低氧性肺動(dòng)脈高壓形成與肺組織中PPARγ表達(dá)下調(diào)有關(guān)。PPARγ是一類配體活化的核轉(zhuǎn)錄因子，主要參與調(diào)節(jié)糖脂質(zhì)代謝，在脂肪細(xì)胞分化、動(dòng)脈粥樣硬化、肺動(dòng)脈高壓等中發(fā)揮重要作用。研究表明，PPARγ激動(dòng)劑——羅格列酮可改善低氧誘導(dǎo)的野生型小鼠肺動(dòng)脈高壓和右心室肥厚[13]，血管平滑肌細(xì)胞特異性PPARγ基因缺陷小鼠更容易自發(fā)形成肺動(dòng)脈高壓和右心室肥厚，已知apoE編碼基因APOE是PPARγ的靶基因之一，羅格列酮可刺激肺血管平滑肌細(xì)胞分泌apoE進(jìn)而發(fā)揮抑制PDGF介導(dǎo)的肺平滑肌細(xì)胞增殖作用[14]，提示肺動(dòng)脈高壓的形成與PPARγ/apoE通路異常有關(guān)；而有研究表明，羅格列酮可改善高膽固醇膳食喂養(yǎng)誘導(dǎo)的apoE-KO小鼠肺動(dòng)脈高壓和右心室肥厚[6]，我們前期的實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)，低氧可上調(diào)apoE-KO小鼠肺組織PPARγ蛋白表達(dá)，apelin改善低氧誘導(dǎo)的apoE-KO小鼠肺動(dòng)脈高壓和右心室肥厚作用可能與上調(diào)肺組織PPARγ蛋白表達(dá)有關(guān)[11]，提示PPARγ激動(dòng)劑改善肺動(dòng)脈高壓與PPARγ/apoE通路無關(guān)，這可能與所選的動(dòng)物品系、實(shí)驗(yàn)條件不同有關(guān)。由于高脂膳食喂養(yǎng)可引起血脂、apoE代謝異常，且apoE-KO小鼠本身就存在apoE基因表達(dá)缺陷、血脂異常(實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示apoE-KO小鼠TC和LDL較WT小鼠顯著升高，而HDL和HDL/LDL比值顯著降低)，并不能真實(shí)反映PPARγ/apoE通路在低氧性肺動(dòng)脈高壓形成中的作用，低氧誘導(dǎo)apo-KO小鼠肺組織PPARγ表達(dá)上調(diào)可能是一種代償反應(yīng)，PPARγ/apoE通路在單純低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓形成中的作用有待進(jìn)一步闡明。

綜上所述，低氧誘導(dǎo)肺組織apoE蛋白表達(dá)下調(diào)，肺組織apoE蛋白表達(dá)下調(diào)參與低氧性肺動(dòng)脈高壓的形成。