黃 玲， 屈小虎， 陳 慧， 謝克儉， 肖 敏

(溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院， 浙江 溫州 325035)

胰島素敏感性降低即胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)病機(jī)制的重要環(huán)節(jié)。胰島素敏感組織的葡萄糖攝取量減少和胰島β細(xì)胞功能降低是2型糖尿病的特征性病理生理學(xué)改變。目前發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素受體激動劑(AdipoRon)具有抗糖尿病的生物學(xué)活性：研究[1]表明，AdipoRon通過多條信號通路，加快肌肉組織中游離脂肪酸的氧化和葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，實現(xiàn)增加脂肪酸的β氧化、改善胰島素抵抗[2]和抗炎等生物學(xué)作用。同時，增強(qiáng)腎臟組織中脂肪氧化，從而降低脂質(zhì)合成，發(fā)揮抗氧化作用。研究發(fā)現(xiàn)， 在小鼠骨骼肌組織中AdipoRon 通過結(jié)合 AdipoR1/2，可抑制體內(nèi)糖異生過程，促進(jìn)脂肪代謝[3，4]。本研究在2型糖尿病小鼠模型上通過檢測小鼠血糖，觀察腎組織HE染色形態(tài)，實時定量熒光PCR 分析腎組織血管內(nèi)皮生長因子 PDX-1和insulin mRNA 等基因產(chǎn)物表達(dá)，Western blot檢測小鼠腎臟IRS-1的表達(dá)，ELISA試劑盒檢測小鼠血清胰島受體和胰島素受體底物-1含量。旨在探究 AdipoRon 對腎臟組織抗損作用的影響，為臨床治療 2 型糖尿病提供新的方案。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性C57/BL6小鼠40只，8～9周齡，購自上海史萊克公司。

1.1.2 實驗試劑 AdipoRon(MCE)，鏈脲佐菌素(Sigma)，蛋白裂解液(碧云天)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(諾維贊)，SYBR Premix Ex Taq II(TaKaRa)，PDX-1，insulin與actin引物(上海生工設(shè)計)。

1.1.3 實驗儀器 血糖測試儀A-3型(三諾)，小型臺式高速冷凍離心機(jī)(Thermo)，CFX Connect TM熒光定量PCR儀(Bio-Rad)。

1.2 方法

40只SPF級雄性C57/BL6小鼠，經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常對照組(NC)(n=10)和實驗組(n=30)。NC組喂養(yǎng)普通飼料，實驗組喂養(yǎng)高糖高脂飼料。喂養(yǎng)35 d后，將小鼠禁食6 h，使用腹腔注射法注射40 mg/kg 1%鏈脲佐菌素，72 h后再禁食6 h，斷尾取血測空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，F(xiàn)BG>11.6 mmol/L且小鼠出現(xiàn)三多(多飲、多食、多尿)癥狀，則成功構(gòu)建糖尿病小鼠模型。NC組腹腔注射等量檸檬酸鈉緩沖液。 建模成功后，將模型小鼠隨機(jī)分為3組(n=10)：模型對照(DM)組、低劑量AdipoRon治療(DM+L)組、高劑量AdipoRon治療(DM+H)組。

使用去離子水溶解AdipoRon，DM+L組小鼠灌胃20 mg/kg·d AdipoRon，DM+H組小鼠灌胃50 mg/kg·d AdipoRon，NC、DM組則灌胃等量去離子水。10 d后，將小鼠禁食6 h，斷尾取血測FBG。眼眶后靜脈叢取血0.75 ml，靜置過夜后離心取上清，保存于4℃。取各組腎臟標(biāo)本并編號，部分組織使用4%多聚甲醛固定用于組織包埋，部分組織液氮速凍后保存于-80℃。ELISA試劑盒檢測小鼠血胰島素受體和胰島素底物-1的含量。腎組織切片后進(jìn)行HE染色，鏡下觀察并拍照各組腎臟組織形態(tài)。用Western blot方法檢測小鼠腎臟p-IRS-1蛋白質(zhì)的表達(dá)，使用Image I軟件進(jìn)行灰度分析，各組樣本灰度值比上內(nèi)參β-actin灰度值，再進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。使用Trizol一步法提取小鼠腎組織總RNA，并測定RNA的濃度和純度，然后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，操作遵照試劑盒說明書，用實時熒光定量PCR測定腎組織胰島素啟動因子(PDX-1)和胰島素(insulin)mRNA的表達(dá)，擴(kuò)增結(jié)果以△CT值表示，各樣本mRNA 表達(dá)結(jié)果以樣本中β-actin的△Ct值為基準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化計算，得到相對表達(dá)量，結(jié)果用2-△△Ct表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組血清中INSR、IRS-1、TNF-α的蛋白質(zhì)含量以及血糖含量的比較

與正常對照組比較，DM組、DM+H組、DM+L組小鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)均升高，小鼠胰島素受體(insulin receptor,INSR)和胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate-1，IRS-1)的蛋白質(zhì)含量均降低(P<0.05)；與DM組比較，DM+H組、DM+L組小鼠血糖和TNF-α下降，INSR和IRS-1 的蛋白質(zhì)含量升高(P<0.05，表1)

Tab. 1 Serum levels of INSR, IRS-1, TNF-α and glucose in the four n=10)

NC: Normal control; DM: Diabetes model control; DM+L: Diabetes model control with low AdipoRon; DM+H: Diabetes model control with high AdipoRon; INSR: Insulin receptor; IRS-1: Insulin receptor substrate-1; TNF-α: Tumor necrosis factor-α

*P<0.05vsNC group；#P<0.05vsDM group

2.2 小鼠腎組織病理學(xué)變化

光鏡下正常對照組小鼠腎小球外形飽滿規(guī)則，腎小囊邊界清晰，腎小管結(jié)構(gòu)正常；模型對照組小鼠腎小球輕微腫大，內(nèi)部充斥細(xì)胞炎癥因子，腎小囊輕微腫脹；灌胃AdipoRon后，各劑量組小鼠腎小球和腎小囊病變較模型對照組明顯減輕，炎癥因子顯著減少，腎小管組織空泡化減弱，其中高劑量組效果明顯優(yōu)于低劑量組，恢復(fù)接近正常(圖1)。

Fig.1Changes of renal tissues in four groups(HE ×400)

NC: Normal control; DM: Diabetes model control; DM+L: Diabetes model control with low AdipoRon; DM+H: Diabetes model control with high AdipoRon

2.3 小鼠腎組織糖代謝相關(guān)基因表達(dá)變化

對小鼠腎臟PDX-1和insulin mRNA表達(dá)量檢測結(jié)果顯示，DM組小鼠PDX-1 mRNA相對表達(dá)量(0.08±0.02)較NC組小鼠(1.02±0.03)顯著下降(P<0.01)，DM組小鼠Insulin mRNA的相對表達(dá)量(0.10±0.01)較NC組小鼠(1.04±0.04)也顯著下降(P<0.01)。與DM組小鼠相比較，DM+H組小鼠PDX-1 mRNA相對表達(dá)量(0.51±0.08)和insulin mRNA的相對表達(dá)量(0.47±0.05)均顯著上升(P<0.01)，DM+L組小鼠PDX-1 mRNA相對表達(dá)量(0.28±0.08)和Insulin mRNA的相對表達(dá)量 (0.12±0.03)也均顯著上升(P<0.05，圖2)。

Fig.2Comparison of PDX-1 and insulin expression in the tissues among the four groups

PDX-1: Pancreatic duodenal homebox-1

**P<0.01vsNC group;#P<0.05,##P<0.01vsDM group

2.4 小鼠胰島素受體底物p-IRS-1蛋白質(zhì)表達(dá)的變化

對小鼠腎臟p-IRS-1蛋白質(zhì)的免疫印跡灰度值統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，DM組小鼠p-IRS-1灰度值(0.51±0.08)，與NC組小鼠(1.22±0.02)存在顯著差異(P<0.01)，DM+H組小鼠p-IRS-1灰度值(0.95±0.09)較DM組小鼠(0.51±0.08)顯著上升(P<0.05)，DM+L組小鼠p-IRS-1灰度值(0.65±0.03)與DM組小鼠(0.51±0.08)無顯著差異(圖3)。

Fig.3Comparison of p-IRS-1 expression in the tissues among the four groups

p-IRS-1: Phosphated insulin receptor substrate-1

**P<0.01vsNC group；#P<0.05vsDM group

3 討論

2型糖尿病作為一種慢性代謝性疾病，胰島素抵抗是其重要特征，表現(xiàn)為機(jī)體靶組織對胰島素生理作用的敏感性降低，使得生理劑量的胰島素產(chǎn)生低于正常的生理效應(yīng)，機(jī)體為滿足機(jī)體需要，代償性分泌更多的胰島素，產(chǎn)生高胰島素血癥，引起一系列病理生理的改變，誘導(dǎo)各種代謝性疾病的發(fā)生和發(fā)展[5，6]。AdipoRon作為一種新型的脂聯(lián)素受體激動劑，通過與AdipoR1/2結(jié)合，激活A(yù)MPK通路，緩解胰島素抵抗。日本東京大學(xué)的研究人員經(jīng)過初步探討認(rèn)為50 mg/kg AdipoRon能夠促進(jìn)激活A(yù)MPK受體從而發(fā)揮其治療作用[7]。本課題組前期細(xì)胞實驗探索了更低劑量的 AdipoRon能增加細(xì)胞的耗糖量[8]，故設(shè)計低劑量藥物組20 mg/kg和高劑量藥物組50 mg/kg，選取高糖高脂飼料喂養(yǎng)并注射STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病小鼠模型進(jìn)行動物水平研究。給予AdipoRon灌胃治療，觀察2型糖尿病小鼠腎臟病理形態(tài)改變及腎組織部分蛋白質(zhì)和基因的表達(dá)改變情況，進(jìn)而探討AdipoRon對2型糖尿病小鼠腎臟損傷的治療作用。

研究報道[9]，2型糖尿病會對小鼠腎臟病理形態(tài)產(chǎn)生影響，本實驗DM組小鼠腎小球輕微腫大；灌胃AdipoRon后，各劑量組小鼠腎小球病變較DM組有所減輕，其中高劑量組效果明顯優(yōu)于低劑量組，與正常組幾乎無差異。提示AdipoRon對于2型糖尿病引起的腎組織損傷具有改善作用。

IRS-1是胰島素受體的底物之一，IRS-1中絲氨酸的磷酸化對胰島素抵抗的發(fā)生至關(guān)重要。文獻(xiàn)報道[10]，IRS-1為一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，可用于調(diào)節(jié)胰島素和IGF信號通路[11]，通過胰島素與胰島素受體結(jié)合而激活，發(fā)生自身磷酸化，生成它的活性形式p-IRS-1，從而激活PI3K/AKT通路，調(diào)節(jié)生長、代謝和下游存活PI3K，PI3K使機(jī)體內(nèi)的葡萄糖發(fā)生改變[12]。有研究表明[13]，脂聯(lián)素干預(yù)可以使2型糖尿病模型小鼠體內(nèi)IRS-1酪氨酸磷酸化水平增加，促進(jìn)胰島素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、改善胰島素抵抗。本課題中給藥組小鼠INSR、IRS-1表達(dá)和p-IRS-1含量均顯著上升，血糖降低。表明AdipoRon作為脂聯(lián)素受體激動劑，作用于IRS-1，通過胰島素與胰島素受體結(jié)合，IRS-1磷酸化增強(qiáng)，使p-IRS-1含量上升，降低血糖，改善胰島素抵抗。

近年來多有研究[14]，PDX-1(胰島素啟動因子)通過調(diào)控胰島素及胰島素相關(guān)基因表達(dá),促進(jìn)胰島素分泌，維持胰島β細(xì)胞的正常功能。研究報道[15]，當(dāng)胰島β細(xì)胞PDX-1 mRNA的表達(dá)增多，胰島細(xì)胞功能得到改善，胰島素抵抗情況得到改善，從而使機(jī)體內(nèi)的葡萄糖含量降低。本實驗結(jié)果提示，口服AdipoRon通過上調(diào)腎臟PDX-1和insulin mRNA的表達(dá)，對維持糖尿病小鼠胰島β細(xì)胞正常功能有一定作用。

綜上所述，本研究構(gòu)建2型糖尿病小鼠模型，通過給予藥物AdipoRon治療，觀察給藥組和模型組小鼠腎臟中相關(guān)指標(biāo)的變化。結(jié)果顯示，AdipoRon對糖尿病小鼠腎臟組織損傷有一定的干預(yù)作用。