張 勇, 李苗苗, 華田苗, 孫慶艷

(安徽師范大學生命科學學院, 蕪湖 241000)

肝臟是一種重要的器官，參與調節(jié)機體的糖代謝、蛋白質代謝和脂肪代謝，其損傷會對機體產生嚴重的影響。酒精濫用會改變自身免疫調節(jié)并導致免疫缺陷，長期大量飲酒會引起全身各臟器的代謝和功能異常，更可能引起一系列的肝損傷，其中包括肝臟脂肪變性、肝纖維化、肝硬化和再生功能減弱等一系列的酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)[1, 2]。茶多酚是一種復合物，具有多種有益的作用。有研究發(fā)現(xiàn)茶多酚對大鼠酒精性肝病有抗氧化與抗纖維化的作用[3]，但是關于茶多酚對慢性酒精中毒肝損傷的具體保護機制尚不明確。本研究建立了慢性酒精誘導的成年大鼠肝損傷動物模型，并進行茶多酚的干預，以脂體比衡量內臟脂肪含量，以肝指數(shù)和油紅O染色結果衡量肝臟的脂質沉積，以超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD)活力與丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量的比值、總抗氧化能力(total antioxidant capacity assay, T-AOC)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活力等氧化應激指標來衡量肝臟的氧化應激狀態(tài)，檢測大鼠肝組織中脂肪酸轉位酶(fatty acid translocase, FAT/CD36)蛋白表達情況，觀察茶多酚的干預對慢性酒精誘導的肝損傷大鼠的防護作用及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級健康7周齡 SD 雄性大鼠36 只，體重180～220 g，由浙江省實驗動物中心提供[scxk[浙]2014-0001]。動物自由進食飲水，環(huán)境相對濕度(55.4±3.0)%，溫度(24±2)C，明暗周期12 h：12 h。

1.2 慢性酒精中毒大鼠模型的建立及茶多酚干預

適應性飼養(yǎng)一周后，將大鼠隨機分為對照組(Control, CON)、酒精損傷組(Ethanol, ETH)和茶多酚干預組(Tea polyphenols intervention, TPI)，每組 12 只，分籠飼養(yǎng)，均在相同環(huán)境下自由攝食和飲水。對照組用0.9%生理鹽水按 7 g/kg 灌胃；酒精組用體積分數(shù)56%的紅星牌酒精(北京紅星)同劑量灌胃；茶多酚組在酒精灌胃同時按照0.25 g/kg劑量灌胃給予茶多酚(上海伊卡)[4]。每天上午 9：00定時進行灌胃，1 次/天，持續(xù) 8 周。

1.3 樣本采集

實驗結束后，所有動物禁食12 h, 保持自由飲水。大鼠稱重后，以10%的水合氯醛按0.3 ml/100 g劑量麻醉大鼠，每組隨機選取5只，直接打開腹腔，取腎周脂肪墊和附睪脂肪墊，稱脂肪濕重，將兩者重量之和作為內臟脂肪重量，并計算腎周脂肪和附睪脂肪重量占體重的百分比即脂體比。取肝臟，稱肝臟濕重，計算肝臟重量占體重的百分比即肝指數(shù)。將肝臟液氮速凍， -80℃存儲備用。

每組其它剩余大鼠(CON，n=7; ETH,n=5; TPI,n=6)打開胸腔，找到心臟，剪開心包膜，剪開左心室，將灌流針插入至主動脈，用止血鉗結扎住剪開口，打開生理鹽水灌注，剪開右心耳，灌注8 min，至肝臟發(fā)白后灌注 4% 多聚甲醛進行預固定，灌注至大鼠身體僵硬后取肝臟，并移入 4% 多聚甲醛固定液中固定至組織沉底，4℃儲存待制作組織切片。

1.4 指標檢測

取固定肝臟組織做冰凍切片，進行油紅O染色。染色后的切片在OlympusBX-51顯微鏡下觀察，用Image-Pro Express6.0圖像分析軟件進行圖像采集，對油紅O染色的肝臟脂質沉積進行積分光密度分析。取大鼠肝臟組織制備勻漿液，測定蛋白質含量，采用超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD)，丙二醛(malondialdehyde, MDA)，總抗氧化能力(total antioxidant capacity assay, T-AOC)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)試劑盒(南京建成)分別測定肝臟中SOD活力，MDA含量，T-AOC能力和GSH-Px活力；采用FAT/CD39免疫組化試劑盒(北京博奧森)和ELISA試劑盒(武漢博士德)對FAT/CD36在肝組織中表達情況進行定位和定量檢測。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 動物一般狀況

8 周的干預結束后，酒精組死亡 2 只，茶多酚組死亡 1 只，對照組全部存活。死亡大鼠解剖結果顯示肺出血，氣管分泌物增多，分析主要原因由于灌胃時酒精誤嗆入肺導致。其它存活大鼠每天灌胃結束后觀察活動狀態(tài)和生命特征，發(fā)現(xiàn)對照組大鼠灌胃后活動能力良好，意識清楚，正常攝食，酒精組和茶多酚組大鼠每次灌胃后逐漸昏迷，呈昏睡狀態(tài)，攝食和運動減少。2 h持續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，酒精組和茶多酚組大鼠逐漸恢復正常活動和攝食，并且茶多酚組大鼠恢復清醒時間較酒精組短。

2.2 茶多酚干預后大鼠體重，脂體比，大鼠肝指數(shù)和脂質沉積變化

8 周喂養(yǎng)后，三組大鼠體重差異無統(tǒng)計學意義。酒精組脂體比顯著低于對照組(P<0.05)，茶多酚組脂體比顯著高于酒精組(P<0.05, 表1)。

酒精組肝指數(shù)顯著高于對照組(P<0.01)，茶多酚組肝指數(shù)顯著低于酒精組(P<0.01)。肝臟油紅O染色結果可見，肝臟細胞的細胞核被染成藍紫色，肝臟細胞中的脂滴被染成紅色。對照組肝臟細胞染色淺淡，酒精組與對照組相比，肝細胞內含大量染成紅色的脂滴沉積。茶多酚組與酒精組相比，肝細胞內脂滴沉積減少 (圖1，表1)。

Fig.1Results of Oil Red O staining (×400)

A： Control group； B： Ethanol group； C： Tea polyphenols intervention group

Tab. 1 Effects of tea polyphenols intervention(TPI)on body weight, visceral fat weight/body weight ratio, liver index, hepatic lipid deposition and FAT/C36

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group;#P<0.05，##P<0.01vsethanol group

2.3 茶多酚干預后大鼠肝臟中SOD/MDA、T-AOC和GSH-Px活性變化

酒精組中SOD/MDA、T-AOC和GSH-Px活性均顯著低于對照組(P<0.01)。茶多酚組SOD/MDA顯著高于酒精組(P<0.01)。茶多酚組T-AOC和GSH-Px活性顯著高于酒精組(P<0.05，表2)。

GroupSOD/MDA(U/nmol)T-AOC(U/mg prot)GSH-Px(U/mg prot)Control0.0200±0.003320.18±1.2120.88±0.95Ethanol0.0110±0.0012?? 14.54±1.07??10.50±1.03??TPI0.0170±0.0014##16.85±1.32#16.70±0.93#

**P<0.01vscontrol group；#P<0.05，##P<0.01vsethanol group

2.4 茶多酚干預后大鼠肝臟中FAT/CD36免疫組織化學染色及ELISA分析結果

免疫組織化學染色結果可見，三組肝臟切片中均有FAT/CD36免疫陽性細胞分布，免疫陽性物質集中在細胞膜上，呈棕黃色或者棕褐色。酒精組FAT/CD36免疫陽性細胞積分光密度顯著高于對照組(P<0.01)，茶多酚干預組顯著低于酒精組(P<0.05，圖2，表1)。

ELISA測定結果顯示酒精組大鼠肝臟中FAT/CD36蛋白水平顯著高于對照組(P<0.01)，茶多酚組顯著低于酒精組(P<0.01，圖3)。

Fig.2The results of FAT/CD36 immunohistochemistry

A： Control group； B： Ethanol group； C： Tea polyphenols intervention group；： Fos-like immunoreactivity

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsethanol group

3 討論

肝臟作為機體以代謝功能為主的重要器官，在機體內起到去氧化，儲存肝糖原和分泌蛋白等主要作用。已有研究發(fā)現(xiàn)長期大量攝入酒精會導致機體內氧化-抗氧化系統(tǒng)失衡，氧自由基增加，肝臟脂質異常積累，從而引起肝細胞損傷，肝細胞壞死，肝硬化等一系列病理反應[5]。研究表明，茶多酚是一種多組分復合物，能夠清除機體氧自由基[6]，對大鼠酒精性肝病有抗纖維化的作用[7, 8]。

動物和臨床研究發(fā)現(xiàn)酒精攝入會減少嚙齒動物的內臟脂肪含量，同時也會提高肝臟攝入的脂肪量[9-11]，表明白色脂肪組織(white adipose tissue, WAT)脂質的穩(wěn)態(tài)在肝臟脂質沉積中起重要作用[12]。當白色脂肪組織的脂質貯存出現(xiàn)紊亂，會導致過多的游離脂肪酸流入肝臟，引起肝臟脂質沉積。本研究結果發(fā)現(xiàn) 8 周的茶多酚干預結束時，酒精組脂體比顯著小于對照組，茶多酚干預組顯著高于酒精組；酒精組肝指數(shù)顯著大于對照組，茶多酚干預組顯著低于酒精組，同時油紅 O 染色結果顯示酒精組肝臟細胞中脂滴較對照組增加，茶多酚干預組較酒精組減少。這些結果說明 8 周的酒精攝入引起大鼠內臟脂肪減少，肝臟脂質沉積增加，這與過去的研究一致，而茶多酚干預引起內臟脂肪含量增加，同時伴隨著肝臟脂質沉積減少。這可能是由于茶多酚干預減弱脂肪組織中脂肪水解酶對脂肪的分解作用，從而減少流入肝臟的脂肪酸。

FAT/CD36是一種跨膜糖蛋白，在體內分布廣泛，能夠參與脂質的代謝，是肝臟攝取游離脂肪酸的重要轉運體[13, 14]。過去的研究發(fā)現(xiàn)，減弱 FAT/CD36 介導的脂肪酸攝取，將可以避免肝細胞脂毒性的發(fā)生[15]。通過藥理學手段或 cDNA 轉導技術誘導肝臟 FAT/CD36 的過量表達，將會引起脂肪肝的發(fā)生，進一步會導致機體出現(xiàn)代謝紊亂[16]。Zhong W 等發(fā)現(xiàn) 8 周的酒精攝入會引起小鼠肝臟中甘油三酯和膽固醇積累增加，并檢測到 FAT/CD36 在 mRNA 和蛋白水平表達的增加[17]。本研究通過免疫組織化學和酶聯(lián)免疫吸附試驗發(fā)現(xiàn)酒精組大鼠肝臟 FAT/CD36 蛋白表達量顯著大于對照組，茶多酚干預組顯著小于酒精組。說明 8 周的茶多酚干預能引起肝細胞膜上 FAT/CD36 蛋白表達量減少，從而減少肝臟對游離脂肪酸的攝入量。

發(fā)生肝臟脂質沉積時，大量脂滴占據細胞質的空間，將會影響肝細胞的正常功能，使其容易受到毒性物質和應激因素的作用。超氧化物歧化酶(SOD)是一種在生物體內廣泛表達的活性物質，能夠清除機體氧自由基，組織內丙二醛(MDA)含量直接反應脂質過氧化的速率和強度。總抗氧化能力(T-AOC)是整體衡量機體抗氧化能力的指標。谷胱甘肽過氧化物酶(GHS-Px)是一種重要的分解過氧化物的催化酶。本研究以 SOD/MDA、T-AOC 和 GSH-Px 來較全面地衡量機體的氧化應激狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn) 8 周的酒精攝入使酒精組肝臟中 SOD/MDA、T-AOC 和 GSH-Px活性均顯著小于對照組，說明酒精使大鼠肝臟出現(xiàn)氧化應激狀態(tài)，這一結果與過去的研究發(fā)現(xiàn)一致[18]。茶多酚干預使大鼠肝臟 SOD/MDA，T-AOC 和 GSH-Px 活性顯著大于酒精組，說明茶多酚干預能夠緩解酒精攝入引起的大鼠肝臟中的氧化應激狀態(tài)。

綜上所述，茶多酚干預能夠減少慢性酒精中毒大鼠內臟脂肪的分解，從而減少隨血液循環(huán)系統(tǒng)流向肝臟的脂肪酸，同時肝細胞膜上負責脂肪酸攝入的 FAT/CD36 含量降低，減少肝細胞對脂肪酸的攝取，從而減少脂質在肝臟的積累。同時，茶多酚干預還能夠緩解肝臟的氧化應激狀態(tài)，從而減輕肝損傷。

肝細胞除了通過 FAT/CD36 攝取游離脂肪酸以外，還可以通過脂肪酸轉運蛋白-1 (fatty acid transport protein-1, FATP-1)和肝臟脂肪酸結合蛋白 (fatty acid binding protein, L-FABP) 等轉運體來進行游離脂肪酸的攝取[19]。茶多酚對 FAT/CD36的表達有干預效應，是否對 FATP-1 和 L-FABP 同樣具有干預效應有待進一步研究。