趙婷婷

【摘要】乳腺癌被認為是世界上比較嚴重的惡性腫瘤，對女性健康造成了嚴重的威脅。借助多種特征性腫瘤轉移模型、乳腺癌細胞模型乳腺癌生長轉移階段PRR11的作用，能夠更好的反映出乳腺癌細胞生長轉移的調控機制，本文將會對PRR11在乳腺癌細胞中的表達及意義、PRR11對乳腺癌細胞增殖和凋亡所產生的影響、PRR11對乳腺癌遷移和侵襲所產生的影響、PRR11對乳腺癌細胞生長轉移的調控機制等進行探究，以期為乳腺癌的診斷和治療提高參考和借鑒。

【關鍵詞】PRR11;乳腺癌;細胞生長轉移;調控機制

乳腺癌是臨床上的常見病和多發(fā)病，對于早期患者通過手術的方法給予切除，但是對于晚期患者則需要給予內分泌治療或化學藥物治療。通過對乳腺癌的分子病理分型進行分析和研究，不僅可以為其診斷和治療提供參考和借鑒，而且還可以提高患者的預后效果。近些年來，富含脯氨酸的蛋白（PRRII）是新發(fā)現(xiàn)的一類基因，其分布在染色體17q22上，主要包括了9個內含子和10個外顯子，并且mRNA具有多個轉錄本，能夠編碼360個氨基酸（約40kD），開放讀碼框長度達到了1083bp。臨床研究發(fā)現(xiàn)，PRR11在胃癌、膽管癌、肺癌、胰腺癌等疾病中具有非常高的表達，而且參與了腫瘤細胞的轉移和增殖等行為，被公認為促癌基因，因此對PRR11在乳腺癌中的表達及其對乳腺癌細胞生長轉移的調控機制進行分析尤為重要。

1 PRR11在乳腺癌細胞中的表達及意義

借助實時熒光定量PCR、免疫熒光和免疫印跡來對乳腺癌細胞SK-BR3、MCF-7、MDA-MB-231以及正常乳腺上皮細胞MCF-10A中PRR11的表達情況進行檢測。同時選擇免疫印跡、實時熒光定量PCR和免疫組織化學法來對正常組織與乳腺癌組織中PRR11的表達差異進行檢測，進一步明確乳腺癌組織中PRR11的表達與增殖指數(shù)、分子分型、腫瘤分期、組織分級等臨床病理特征之間的聯(lián)系。此外，還可以通過Cox風險比例回歸模型和生存分析來對PRRII對乳腺癌細胞患者預后的影響進行預測和分析。

通常情況下，免疫熒光檢測結果顯示PRR11主要在乳腺癌細胞漿內表達，而且免疫印跡和實時熒光定量PCR檢測結果顯示，在乳腺癌細胞系中PRR11的蛋白質和mRNA的表達要超過正常乳腺組織和細胞。免疫組化檢測結果顯示，PRR11高表達的乳腺癌組織所存在的增殖標志物Ki67的表達要超過PRR11低表達的乳腺癌細胞，并且隨著乳腺癌分期的提高PRR11的表達增加。實際上，PRRII的表達與腫瘤大小、病理分期、遠處轉移、孕激素受體狀態(tài)等保持著非常密切的聯(lián)系，但是其與淋巴結狀態(tài)和年齡無明顯聯(lián)系。生存分析結果顯示與PRR11低表達患者相比，高表達患者生存期明顯縮短，該指標可以作為乳腺癌患者預后效果的預測指標。

2 PRR11對乳腺癌細胞增殖和凋亡所產生的影響

要想更好的了解和掌握PRR11表達對乳腺癌細胞增殖和凋亡所產生的影響，則需要構建空載體對照（RNAi-Vector）和慢病毒介導的下調體系（RNAi-PRRll），然后借助免疫印跡就可以準確的檢測出下調效果，從而得到PRR11穩(wěn)定下調的MCF-7和MDA-MB-231細胞，同時還開展了EdU、MTT、TUNEL（凋亡檢測）和平板克隆實驗，結果發(fā)現(xiàn)PRRIl-shRNA能夠對乳腺癌細胞的PRR11蛋白表達水平進行下調，而且MTT實驗結果發(fā)現(xiàn)，PRR11表達下調后，乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞活力出現(xiàn)了不同程度的降低，并且在MTT實驗第72小時，MCF-7和MDA-MB-231細胞的活力基本上下降到了51.0%和40.1%。EdU實驗結果發(fā)現(xiàn)，PRR11表達下調后，MCF-7和MDA-MB-231細胞的EdU陽性細胞所占百分比分別從最好是的21.0±1.5%和28.2±2.2%降至11.5±2.1%和15.5±1.1%，從而反映出細胞DNA合成速率不同程度上受到了抑制。通過進行平板克隆實驗發(fā)現(xiàn)，PRR11表達下調前MCF-7和MDA-MB-231細胞的克隆形成數(shù)是110±11.5和148. 7±14.5，而PRR11表達下調后MCF-7和MDA-MB-231細胞克隆形成數(shù)下降到了40.0±5.6和70±11.6，進而反映出PRR11表達下調能夠對乳腺癌細胞的克隆形成能力起到一定的抑制作用。在含1%血清培養(yǎng)液中，對乳腺癌細胞孵育24h后，借助TUNEL實驗來對PRR11下調后可能對乳腺癌細胞凋亡的影響進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)PRR11表達下調前MCF-7和MDA-MB-231細胞的凋亡率分別是1.0±0.2%和1.4±0.2%，而PRR11表達下調后MCF-7和MDA-MB-231細胞凋亡率分別是12.1±0.9%和13.3土0.8%，因此可以判定PRR11表達下調后能夠有效降低乳腺癌細胞的抗乏血清饑餓能力，進一步加快了細胞的凋亡。

3 PRR11對乳腺癌遷移和侵襲所產生的影響

3.1 PRR11表達上調能夠加快乳腺癌細胞的遷移和侵襲

要想更好的了解和掌握PRRII上調對乳腺癌遷移和侵襲所產生的影響，可以選擇乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞進行細胞劃痕和Transwell侵襲實驗，其中細胞劃痕實驗結果發(fā)現(xiàn)PRRI1表達上調后可以使MCF-7和MDA-MB-231細胞相對遷移距離達到了0.68±0.09和0.87士0.04，而PRR11表達正常時的MCF-7和MDA-MB-231細胞相對遷移距離為0.46±0.04和0.58±0.06。Transwell侵襲實驗結果發(fā)現(xiàn)，PRRII表達上調之前每個視野內平均MCF-7和MDA-MB-231細胞侵襲數(shù)為106±9和146±15，PRR11表達上調后每個視野內平均MCF-7和MDA-MB-231細胞侵襲數(shù)升高至175±13和315±17，從而可以反映PRRII表達上調能夠加快乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力。

3.2 PRR11表達下調能夠阻礙乳腺癌細胞遷移和侵襲

同樣借助細胞劃痕和Transwell侵襲實驗來檢測PRR11表達下調對乳腺癌遷移和侵襲所產生的影響，細胞劃痕結果發(fā)現(xiàn)轉染了Contro-RNAi的MCF-7和MDA-MB-231細胞的相對遷移距離為0.45±0.05和0.58±0.04，而轉染了RNAi-PRRll后MCF-7和MDA-MB-231細胞的相對遷移距離下降至0.2±0.02和0.32±0.04。Transwell侵襲實驗結果發(fā)現(xiàn)，PRR11表達上調之前每個視野內平均MCF-7和MDA-MB-231細胞侵襲數(shù)為104±8和13 7±14，PRR11表達上調后每個視野內平均MCF-7和MDA-MB-231細胞侵襲數(shù)下降至36±4和48±7，從而可以反映IPRRI1表達下調能夠進一步阻礙乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力。

3.3 PRR11表達上調能夠加快乳腺癌MCF-7細胞出現(xiàn)上皮間質轉化

通常情況下，在腫瘤細胞轉移能力方面，上皮間質轉化（EMT）是比較常用的標志，為了研究PRR11是否能夠促進乳腺癌細胞產生EMT，需要開展一系列的實驗進行驗證。如果上調PRR11表達后，將會導致MCF-7細胞的形態(tài)出現(xiàn)明顯的變化，而且使細胞從上皮樣逐漸向間質樣進行轉化。通過免疫印跡實驗結果發(fā)現(xiàn)，PRR11過表達后，可以降低MCF-7細胞中上皮細胞標志物E-cadherin，并且提高間質細胞標志物Vimentm和Fibronectin表達，從而可以說明PRR11表達上調能夠加快乳腺癌MCF-7細胞出現(xiàn)上皮間質轉化。

4 PRR11對乳腺癌細胞生長轉移的調控機制

4.1 對PRR11潛在調控的重要信號轉導通路進行篩選

通常情況下，PI3-K/Akt通路、Ras通路、Notch通路及Wnt/β-catenin通路被認為是調控細胞生長轉移的主要通路，此時可以選擇乳腺癌MCF-7細胞，并通過對PRR11上調前后對PI3 -K/Akt通路、Ras通路、Notch通路及Wnt/β-catenin通路所產生的影響進行分析，通過開展PI3-K激酶活性實驗，可以得知PRR11表達增加與PI3 -K激酶活性之間不存在必然的聯(lián)系，并且Ras活性實驗同樣顯示PRR11對Ras通路不會產生調控作用，但是Realtime PCR實驗結果發(fā)現(xiàn)，如果PRR11表達上調后，將會導致乳腺癌MCF-7細胞中p-catenin表達升高，但是Notchl、Notch2、DLIA等分子并未出現(xiàn)比較明顯的變化，此時就可以分析PRRI1是否可以通過對Wnt/p-catenin通路進行調控來實現(xiàn)對乳腺癌細胞增殖和轉移產生影響。

4.2 PRR11通過B-catenin信號通路可以完成對乳腺癌細胞增殖和轉移的調控

本次研究過程中選擇了乳腺癌MCF-7細胞，并分析了在PRRI1調控乳腺癌增殖轉移階段，β-catenin信號通路所起到的作用，通過進行免疫印跡實驗可以發(fā)現(xiàn)，如果PRR11表達上調后，將會導致乳腺癌MCF-7細胞中核內表達量和β-catenin信號總表達量出現(xiàn)升高現(xiàn)象，并且調控的下游基因c-myc、cyclinDl、Vimentin和E-cadherin表達同樣也會出現(xiàn)升高現(xiàn)象。反之，如果PRR11表達下調后，將會導致上述指標也隨之下降。該研究結果可以反映PRRI1升高可能促進p-catenin表達，并逐漸其向核內轉位，這樣一來就可以推動下游基因的轉錄。為此可以借助雙熒光素酶報告基因實驗來對其進行驗證，結果發(fā)現(xiàn)，如果PRR11上調后，將會激活p-catenin轉錄，并提高質粒熒光強度（TOPIFOP），反之如果PRR11表達下調，將會減弱熒光強度，從而反映出PRR11的確可以促進β-catenin轉錄因子的活性。

4.3 阻斷β-caterun信號通路能夠抑制PRR11對細胞增殖和遷移

為了更好的了解和掌握PRR11可以借助β-catenin信號通路來實現(xiàn)對乳腺癌生長與轉移的調控作用，可以對乳腺癌MCF-7中PRR11表達給予上調，并通過siRNA下調了β-catenin的表達，隨后就可以開展細胞功能實驗和相關分子檢測。通過蛋白印跡檢測后發(fā)現(xiàn)，β-catenin表達下調后，如果對PRR11表達進行上調將會導致c-myc、cyclinDl、Vimentm表達增加被抵消，但是E-cadherin表達將會逐漸恢復。通過雙熒光素酶報告基因實驗發(fā)現(xiàn)，β-catenin表達下調，同時PRR11上調將會導致質粒熒光強度升高被抵消。這些實驗結果都可以說明PRR11可以有效的作用于p-catenin信號通路，并通過β-catenin信號通路來實現(xiàn)對乳腺癌細胞生長和轉移的有效調控。

5 結束語

綜上所述，乳腺癌對人類的身體健康和生命安全造成了較大的威脅，而誘病因素比較多，而且確?；颊叩牟∏榈玫接行У脑\斷和治療，則需要分析和探究PRR11在乳腺癌中的表達及其對乳腺癌細胞生長轉移的調控機制，以便對乳腺癌病情有個全方位的了解和掌握，進而提高其治療效果。

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