蔡培強，邵玉凱，李開雄，彭延剛

(1.四川省宜賓市第一人民醫(yī)院 a.脊柱外科，b.屏山院區(qū)，四川 宜賓 644000；2.湖南省邵陽市中心醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，湖南 邵陽 422000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)多發(fā)于中年女性的疾病，臨床表現(xiàn)為慢性、進行性、對稱性、多發(fā)性的關(guān)節(jié)炎，其病理改變?yōu)殛P(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥、增生、血管翳形成，通過浸潤型炎癥、免疫細胞及成纖維樣滑膜細胞之間的相互作用造成病理損害，病變可侵及關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨、韌帶和肌腱等，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨、骨和關(guān)節(jié)囊的破壞，嚴重時會導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失[1]。有研究指出，RA的患病率為0.5%～1.0%，80%以上的RA回出現(xiàn)中度以上殘疾。RA的發(fā)病機制尚不明確，現(xiàn)主流認為免疫系統(tǒng)功能障礙是主要原因[2]。針對細胞因子指標的研究是目前的熱點，白細胞介素-32(IL-32)是一種重要的具有免疫調(diào)節(jié)功能的細胞因子，但針對RA與IL-32相關(guān)性的研究比較缺乏，基于這一研究現(xiàn)狀，本研究針對RA患者外周血IL-32的表達及臨床意義進行分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料選取2014年2月至2017年1月在醫(yī)院風(fēng)濕科住院或門診就診的152例RA患者，均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會1987年制訂的RA診斷標準。根據(jù)患者活動積分(DAS28)分為高活動組(DAS28>5.1)55例、中低活動組(2.6≤DAS28≤5.1)52例和緩解期組(DAS28<2.6)45例；選取60例非RA結(jié)締組織病患者作為非RA組，其中包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡25例、強直性脊柱炎13例、皮肌炎7例、干燥綜合癥5例、系統(tǒng)性硬化4例、成人Still病4例；選取同期60例健康志愿者作為對照組。以上各組均排除合并心腦卒中、肝腎功能不全、糖尿病、惡性腫瘤、慢性阻塞性肺部疾病、炎癥性腸病及入組時1個月內(nèi)有明顯急性感染性疾病癥狀者，妊娠期或哺乳期婦女。五組年齡、性別、體重等方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)。見表1。

表1 五組一般資料比較

1.2觀察指標和檢測方法采集各組研究對象的空腹靜脈外周靜脈血標本，取3 ml血樣于室溫下靜置2小時后以3000 r/min的速度離心5 min后分離血清，置于-80 ℃冰箱中保存待測，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)對血清中的IL-32和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平進行檢測，ELISA試驗盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司，操作步驟嚴格按照使用說明書進行。取4 ml 血樣經(jīng)EDTA抗凝處理后，加入PBS和淋巴細胞分離液后以1500 r/min的速度離心15 min分離外周血單核細胞(PBMC)層，加入PBS再以1200 r/min的速度離心10 min后洗滌細胞兩次，去上清加入總RNA提取劑充分溶解后置于-80 ℃冰箱中保存待測。應(yīng)用總RNA提取劑提取總RNA后應(yīng)用ReverTra Ace qPCR RT Kit合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系見表2，反應(yīng)條件為37 ℃反應(yīng)15 min，98 ℃反應(yīng)5 min，反應(yīng)產(chǎn)物置于-80 ℃冰箱中保存待測。應(yīng)用實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)法(RT-PCR)對PBMC中的IL-32、TNF-α基因表達水平進行檢測，目標RNA的引物序列及RT-PCR反應(yīng)體系見表3、表4，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃變性15 s，56 ℃復(fù)性15 s，72 ℃延伸45 s，共反應(yīng)40個循環(huán)，72 ℃延伸7 min，將反應(yīng)產(chǎn)物于4 ℃下保存，IL-32、TNF-α基因的相對表達水平以2-ΔΔCt法表示。應(yīng)用全自動物化儀(美國貝克曼庫爾特公司生產(chǎn))對RA患者的紅細胞沉降率(ESR)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、類風(fēng)濕因子(RF)等指標進行檢測和分析。

表2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

表3 RT-PCR擴增反應(yīng)體系

表4 目標RNA的引物序列

1.3統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料比較采用方差分析及LSD法；相關(guān)性分析采用直線相關(guān)分析。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1五組PBMC中IL-32、TNF-αmRNA相對表達量的比較五組PBMC中IL-32、TNF-α mRNA相對表達量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9.126、16.336，P< 0.05)，其中，高活動組PBMC中IL-32、TNF-α mRNA相對表達量顯著高于其它四組，中低活動組PBMC中IL-32、TNF-α mRNA相對表達量高于緩解期、非RA組和對照組(P< 0.05)，緩解期、非RA組和對照組PBMC中IL-32、TNF-α mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)，見表5。

2.2五組血清IL-32、TNF-α水平比較五組血清IL-32、TNF-α水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=69.038、78.156，P< 0.05)，其中，高活動組血清IL-32、TNF-α水平顯著高于其它四組，中低活動組血清IL-32、TNF-α水平高于緩解期、非RA組和對照組，非RA組血清TNF-α水平高于緩解期組和對照組(P< 0.05)，緩解期、非RA組和對照組血清IL-32水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)，緩解期組和對照組血清TNF-α水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05)，見表6。

表5 五組PBMC中IL-32、TNF-α mRNA相對表達量(2-ΔΔCt)比較 (pg/ml)

a與高活動組比較，P< 0.05；b與中低活動組比較，P< 0.05；c與緩解期組比較，P< 0.05；d與非RA組比較，P< 0.05；e與對照組比較，P< 0.05

表6 五組血清IL-32、TNF-α水平比較 (pg/ml)

a與高活動組比較，P< 0.05；b與中低活動組比較，P< 0.05；c與緩解期組比較，P< 0.05；d與非RA組比較，P< 0.05；e與對照組比較，P< 0.05

2.3RA患者血清和PBMC中IL-32、TNF-α水平與病情指標的相關(guān)性分析RA患者血清和PBMC中的IL-32、TNF-α水平與DAS28評分、ESR、CRP、RF等病情指標均具有相關(guān)性(P< 0.05)，見表7。

表7 RA患者血清和PBMC中IL-32、TNF-α水平與病情指標的相關(guān)性分析

3 討論

RA的誘因與免疫細胞、細胞因子、免疫活性物質(zhì)等多種系統(tǒng)相關(guān)，機理復(fù)雜。有研究表明，RA患者存在著Th1/Th2細胞功能、Th17/Treg細胞功能的失衡和B細胞功能亢進，這又導(dǎo)致了TNF-α、干擾素(IFN)和白細胞介素等細胞因子的異常表達，最終成為滑膜損害、血管翳增生、破骨細胞生成、滑膜新生血管生成、骨及軟骨侵蝕等RA病理改變的重要機制[3～6]。其中白細胞介素是最重要的細胞因子，研究表明IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-15、IL-17、IL-23、IL-35、IL-37等在RA病情發(fā)展中有重要作用[7～10]，針對白細胞介素與RA病理過程的相關(guān)性研究已成為熱點領(lǐng)域。

本研究結(jié)果顯示，RA患者的血清和PBMC中的IL-32水平均呈現(xiàn)出顯著的升高，且和活動性呈正相關(guān)，外周血IL-32水平與病情嚴重水平有一定相關(guān)性，表明IL-32在RA的進展和活動性增強過程中具有重要的作用，外周血IL-32水平可作為評價RA病情的輔助指標。IL-32是一種前炎癥反應(yīng)細胞因子，主要功能是誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β、IL-6、核因子、促分裂原活化蛋白激酶和趨化因子的產(chǎn)生和釋放，在炎癥反應(yīng)中有不可替代的作用[11]。IL-32主要存在于NK細胞、T細胞、上皮細胞及PBMC中，可誘導(dǎo)形成炎癥級聯(lián)式反應(yīng)、促進細胞凋亡、誘導(dǎo)細胞分化，對固有性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[12]。相關(guān)研究結(jié)果顯示，IL-32的異常表達與病原體感染、動脈粥樣硬化、慢性阻塞性肺疾病、肺結(jié)核、肝炎、炎癥性腸病、惡性腫瘤等疾病具有密切的相關(guān)性，而且瘢痕組織成纖維細胞中在存在著明顯的IL-32基因缺失，故IL-32還與成纖維細胞過度增生、膠原減少、細胞外基質(zhì)過度沉積等病理過程有關(guān)[13]。在近年來的研究中，高利常等[14]和桂明等[15]的研究均證實了，在RA患者中可觀察到血清和PBMC中IL-32表達水平的升高，而且其水平與RA的病情嚴重和骨質(zhì)破壞程度等均具有相關(guān)性，這提示了IL-32可作為反映RA活動度的輔助指標，但這些研究均存在著樣本量較小的缺陷，本研究同樣存在這一問題，還需要大樣本、多中心、設(shè)計良好的臨床研究予以研究和討論。

綜上所述，RA患者表現(xiàn)為外周血IL-32水平的顯著升高，其水平與其疾病嚴重程度和活動性程度指標具有相關(guān)性，提示了IL-32可能在RA的活動性增強過程中具有重要的作用，可作為評價RA病情的輔助指標。

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