石水琴， 蔣 雯， 袁 林， 祁克宗， 涂 健， 宋祥軍

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學茶與食品科技學院，安徽合肥 230036； 2.安徽農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，安徽合肥 230036； 3.安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，安徽合肥 230036)

嗜熱微生物是一類可以在45 ℃以上環(huán)境中生長繁殖的極端微生物，因其細胞和蛋白質(zhì)具有獨特的耐熱性，已引起廣泛關(guān)注，并且逐漸成為人們開發(fā)利用的重要微生物資源。世界各國科學家不斷從各種自然高溫生態(tài)環(huán)境、地熱環(huán)境中篩選和分離出不同屬、種的嗜熱菌[1]。嗜熱菌在實際應用中表現(xiàn)出顯著的作用效果和潛在的應用前景。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的肥料、飼料及環(huán)境保護中常用的微生物活菌制劑包括多種微生物，其中芽孢桿菌是一類需氧或兼性厭氧菌，菌體本身含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)，隨著它們在動物消化道內(nèi)的繁衍、代謝，可產(chǎn)生維生素、有機酸、蛋白質(zhì)和未知生長因子等，參與機體新陳代謝，同時還具有生物拮抗功能，可以減少動物腸道有害菌的數(shù)量，維持消化道菌群平衡[2-5]，在實際生產(chǎn)中得到了廣泛的應用。

目前我國允許作為生態(tài)制劑的微生物有乳酸菌制劑、糞腸球菌制劑、芽孢桿菌制劑、酵母菌制劑和復合微生態(tài)制劑等。但通常使用的益生菌菌株的抗逆性較差，不耐熱，在飼料加工過程中損失較大，不能像芽孢桿菌可以直接加到配合飼料中，因此嗜熱芽孢桿菌作為益生菌的一種，具有其特有的生物特性。與其他微生物活菌制劑相比，芽孢桿菌具有在條件不利的環(huán)境下形成芽孢將自己保護起來的特點，且復活率高。同時芽孢桿菌還具有耐酸、耐鹽、耐高溫及耐積壓等優(yōu)點[6-8]，因此在飼料、肥料的生產(chǎn)中具有較高的穩(wěn)定性。目前在肥料、飼料工業(yè)及環(huán)保中應用的主要有地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)等，在使用時多制成休眠狀態(tài)的活菌制劑或與乳酸菌混合使用[9]，有益的芽孢桿菌能促進機體免疫器官及組織的成熟，使這些器官、組織處于高度準備狀態(tài)，可促進T-淋巴細胞、B-淋巴細胞數(shù)量增加，從而提高機體的體液免疫和細胞免疫水平，因此，芽孢桿菌在動物和人體的微生態(tài)調(diào)節(jié)中也得到了高度的重視和廣泛的應用。

本研究以水產(chǎn)飼料為材料，采用常規(guī)細菌分離鑒定法結(jié)合分子生物學法從水產(chǎn)飼料中分離鑒定出4株嗜熱芽孢桿菌，并對菌株的耐高溫、耐酸、耐膽鹽及對大腸桿菌、沙門氏菌抑菌性等一系列生物學特性進行研究，為后續(xù)試驗以及微生態(tài)飼料添加劑的開發(fā)及應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為水產(chǎn)飼料蛋白粉，購自當?shù)厥袌觥?/p>

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 搖瓶培養(yǎng)基 稱取2.5 g LB培養(yǎng)基溶于100 mL蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌15 min，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 產(chǎn)蛋白酶初篩選擇性培養(yǎng)基 干酪素8 g，磷酸氫二鈉(Na2HPO4)1 g，磷酸氫二鉀(K2HPO4)0.36 g，瓊脂20 g，氯化鈉(NaCl)5 g，加入1 000 mL蒸餾水，加熱攪拌，pH值7.4±0.2，121 ℃高壓滅菌15 min，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 產(chǎn)淀粉酶初篩選擇性培養(yǎng)基 牛肉浸膏5 g，酪蛋白水解物17.5 g，淀粉1.5 g，瓊脂13.5 g，加入1 000 mL蒸餾水，加熱攪拌，pH值7.2±0.2，121 ℃高壓滅菌15 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 芽孢桿菌的分離、純化

取2 g樣品溶解到20 mL無菌水中，振蕩溶解。取混合液接種到20 mL LB液體培養(yǎng)基中，于45 ℃振蕩(150 r/min)培養(yǎng)24～48 h，待培養(yǎng)基變得混濁后，取1 mL培養(yǎng)液按一定的稀釋度稀釋，涂布于LB固體培養(yǎng)基上，置于50 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，挑取單菌落，接于新鮮培養(yǎng)基上，重復多次直至菌落純化。選取生長較好的A2、A3、A4、A5菌株進行理化性質(zhì)的研究。

1.4 生長曲線及最適生長條件測定

生長曲線的測定：將菌液按1%的比例接種到100 mL LB培養(yǎng)基中，45 ℃振蕩培養(yǎng)，每2 h測定1次。

菌株最適生長溫度的測定：將處于對數(shù)生長期早期的LB菌株培養(yǎng)液0.5 mL接種到5 mL LB培養(yǎng)基中，分別置于30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 ℃水浴振蕩培養(yǎng)18 h。

最適生長pH值的測定：將處于對數(shù)生長期早期的LB菌株培養(yǎng)液0.5 mL分別接種到pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，置于45 ℃水浴振蕩培養(yǎng)18 h。

以上試驗均設平行。用721型分光光度計比色測定D600 nm進行生長條件的分析。

耐膽鹽試驗：菌液按1 ∶50(體積比)的接種量分別接種于膽鹽濃度為0、3、6 g/L的液體培養(yǎng)基中，每組重復3次，45 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h后測定菌液的D600 nm。

1.5 產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶試驗

產(chǎn)淀粉酶試驗：首先配制產(chǎn)淀粉酶初篩試驗的MH培養(yǎng)基，121 ℃高壓滅菌15 min，制成平板備用；將分離出來的A2、A3、A4、A5菌株分別接種于裝有LB液體培養(yǎng)基的試管中，45 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)(12±2)h；將培養(yǎng)好的A2、A3、A4、A5菌株取5 μL點樣于產(chǎn)淀粉酶培養(yǎng)基上，在(45±1)℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，待長出單菌落，滴入盧戈氏碘液覆蓋菌落，觀察是否產(chǎn)生透明圈。

產(chǎn)蛋白酶試驗：首先配制產(chǎn)蛋白酶初篩試驗培養(yǎng)基，121 ℃ 高壓滅菌15 min，制成平板備用；將分離出來的A2、A3、A4、A5菌株分別接種于裝有LB液體培養(yǎng)基的試管中，45 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)(12±2)h；將培養(yǎng)好的A2、A3、A4、A5菌株取5 μL點樣于產(chǎn)蛋白酶培養(yǎng)基上，在45 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，待長出單菌落，檢察是否產(chǎn)生蛋白酶水解圈。

1.6 抑菌試驗

試驗菌株菌液、大腸桿菌(ATCC 44102)及沙門氏菌菌液，分別以體積比1 ∶50(約1×106CFU/mL)的接種量同時接種于 10 mL 肉湯液體培養(yǎng)基中，另以滅菌生理鹽水替代試驗菌株作為陽性對照。每組設3個重復，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h。采用平板活菌計數(shù)法，取樣涂布于麥康凱瓊脂平皿，37 ℃過夜，紅色菌落為大腸桿菌，其余為沙門氏菌，記錄大腸桿菌和沙門氏菌菌落數(shù)，計算各試驗菌株對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌率。

1.7 分子鑒定

用16S rDNA序列進行鑒定，以確定其歸屬。PCR產(chǎn)物送上海捷瑞生物工程有限公司測序。分別將獲得的16S rDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對，選取相似度95%以上的序列進一步分析。然后采用DNAMAN 5.2.9軟件進行分析，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.8 透射電鏡觀察

處于對數(shù)生長期早期的細胞用固定液固定好后，制備超薄切片置于透射電鏡下進行結(jié)構(gòu)觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離的菌落及形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

通過稀釋平板涂抹法分離得到4株芽孢桿菌，將其接種到普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，45 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h后觀察，菌落為圓形，邊緣不規(guī)則，表面有皺襞。挑取單個菌落涂片，可見呈革蘭陽性。透射電鏡觀察看到4株芽孢桿菌細胞呈直桿狀，常以成對或鏈式排列，具圓端，都具有明顯的細胞壁結(jié)構(gòu)，且都能明顯觀察到周圍有菌毛，如圖1所示。

2.2 分離株的生化鑒定

對4株菌株的細菌形態(tài)特征、革蘭氏染色觀察以及觸酶與發(fā)酵葡萄糖、木糖、甘露醇、木糖、蔗糖等常規(guī)生化試驗結(jié)果如表1所示。

表1 4株參試菌的生理生化特征

注：“+”表示陽性或能利用；“-”表示陰性或不能利用；“+/-”表示同一屬具體不同菌株之間的細微差別。

2.3 最適生長條件

2.3.1 生長曲線的測定 從0 h開始，每2 h測1次D600 nm，直到30 h，4株菌株基本進入穩(wěn)定期。如圖2所示，A2、A3、A4、A5菌株均在12 h達到對數(shù)期，分別在26、20、20、 26 h 達到穩(wěn)定期。

2.3.2 菌株最適生長溫度的測定 將4株菌株置于不同溫度搖床培養(yǎng)，在18 h后同時測定菌液的D600 nm，以空白培養(yǎng)基作為對照，得到的結(jié)果如圖3所示，可見培養(yǎng)溫度對4株菌株的生長有一定的影響。在所選溫度范圍內(nèi)，菌體生物量隨溫度的變化而變化，當培養(yǎng)溫度低于40 ℃時，菌體生長緩慢；A2、A4、A5菌株培養(yǎng)溫度在40～45 ℃之間時，菌體生長情況較好，以45℃最好，之后隨著溫度的升高，生長速度減慢。A3菌株在50 ℃時菌體生物量達到最高值。

2.3.3 菌株最適生長pH值的測定 將4株菌株置于不同pH值條件下，在45 ℃恒溫培養(yǎng)18 h后同時測定菌液的D600 nm，以空白培養(yǎng)基作為對照，測得的結(jié)果如圖4所示：初始pH值對4株菌株生長有明顯的影響，當培養(yǎng)基pH值低于6.0時，菌體生長緩慢，當初始pH值在6.0～7.5之間時，菌體生長情況較好。A2、A3菌株最適pH值為7.5，A4、A5菌株最適pH值為7.0。

2.4 耐膽鹽試驗

由圖5可見，4株菌株各組的生長都受到膽鹽的抑制，D600 nm都低于不含膽鹽組，相比較而言，A2菌株耐受性較好。

2.5 產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶結(jié)果分析

4株菌株產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶結(jié)果如圖6所示，A2、A3菌株產(chǎn)淀粉酶，A4、A5菌株基本不產(chǎn)淀粉酶(圖6左圖)；4株菌株均能產(chǎn)蛋白酶，且A2菌株產(chǎn)蛋白酶能力最強(圖6右圖)。

2.6 抑菌試驗

由表2可見，4株菌株對共同培養(yǎng)24 h的大腸桿菌都沒有抑制作用；A2、A5菌株對共培養(yǎng)的沙門氏菌的抑菌率分別為31.2%、22.9%，其他菌株為0。

表2 各菌株對共培養(yǎng)的大腸桿菌和沙門氏菌的抑制效果

2.7 16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

測序獲得的A2、A3、A4和A5菌株16S rDNA基因片段長度分別為1 277、1 181、1 213和909 bp。利用BLAST(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，將所測菌株A2、A3、A4和A5的16S r DNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知細菌的16S rDNA序列進行比較鑒定，已知A3、A4、A5菌株與Bacilluslicheniformisstrain H37的同源性分別為98%、99%、100%，說明A3、A4和A5菌株屬于嗜熱地衣芽孢桿菌屬(Bacilluslicheniformis)；已知A2與Bacillussubtilisstrain CC2FG1的同源性是97%，說明A2菌株屬于嗜熱枯草芽孢桿菌屬(Bacillussubtilis)。采用DNAMAN 5.2.9軟件繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖7。

3 討論

從水產(chǎn)飼料中分離獲得4株菌株，細菌形態(tài)特征、革蘭氏染色等鑒定結(jié)果顯示，4株菌株與芽孢桿菌相似。由于芽孢細菌形態(tài)特征及其生理生化特性極其相似，因此僅通過形態(tài)特征及其生理生化特性只能初步確定這4株菌株為芽孢桿菌。基于16S rDNA特異性PCR擴增的檢測等多種方法結(jié)合使用，經(jīng)鑒定，A2菌株與Bacillussubtilisstrain CC2FG1的同源性是97%，說明A2菌株屬于嗜熱枯草芽孢桿菌；A3、A4、A5菌株與Bacilluslicheniformisstrain H37的同源性分別是 98%、99%、100%，說明A3、A4和A5菌株屬于嗜熱地衣芽孢桿菌。

本研究以水產(chǎn)飼料為材料，分離篩選優(yōu)良的芽孢桿菌菌株并對其進行初步鑒定，以此大致了解水產(chǎn)飼料中芽孢桿菌的菌相構(gòu)成。在此基礎上探究了芽孢桿菌對常見致病菌大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌作用，以期研究結(jié)果能為畜牧農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及微生態(tài)調(diào)節(jié)劑的制備提供前期理論依據(jù)和優(yōu)良的微生物資源。

[1]Munster M J，Munster A P，Woodmw J R，et al. Isolation and preliminary taxonomic studies of thermus strains isolated from Yellowstone National Park[J]. Journal of General Microbiology，1986，132(6)：1677-1683.

[2]黃 怡，王士長，崔艷紅，等. 多菌種復合益生素對三黃雞的生產(chǎn)性能及腸道主要菌群的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2006，34(3)：485-486.

[3]黃少文，李紹章，劉金銀，等. 益生素對仔豬生產(chǎn)性能和血液生化指標的影響[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學，2002(4)：76-78.

[4]楊玉榮，鄭世民，劉 晶，等. 雛雞服用益生素后免疫器官指數(shù)及局部體液免疫球蛋白相對含量的動態(tài)變化[J]. 畜牧獸醫(yī)學報，2005，36(4)：352-356.

[5]蔣正宇，周巖民，許 毅，等. 低聚木糖、益生菌及抗生素對肉雞腸道菌群和生產(chǎn)性能的影響[J]. 家畜生態(tài)學報，2005，26(2)：11-15.

[6]高書鋒，劉惠知，周映華，等. 1株豬源腸道益生菌的分離鑒定及其生物學特性研究[J]. 畜牧與獸醫(yī)，2012，44(1)：19-23.

[7]林躍鑫，江勝滔，盧龍娣. 一株益生芽孢菌株的分子鑒定及其藥敏分析[J]. 龍巖學院學報，2011，29(5)：35-38.

[8]寧豫昌，趙緒永，鄭 鳴. 豬源芽孢桿菌的分離鑒定及生物學特性研究[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2012，39(9)：65-68.

[9]陳志偉，姜成英，劉雙江，等. 云南和廣東部分熱泉Alieyelobacilus分布及系統(tǒng)發(fā)育[J]. 微生物學通報，2004，31(4)：50-54.

[10]Ran C，Carrias A，Williams M A，et al. Identification ofBacillusstrains for biological control of catfish pathogens[J]. PLoS One，2012，7(9)：e45793.

[11]Lee K W，Li G，L I H，et al.Bacillussubtilis-based direct-fed microbials augument macrophage function in broiler chickens[J]. Research in Veterinary Science，2011，91(3)：e87-e91.