石水琴， 蔣 雯， 袁 林， 祁克宗， 涂 健， 宋祥軍

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，安徽合肥 230036； 2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽合肥 230036； 3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽合肥 230036)

嗜熱微生物是一類可以在45 ℃以上環(huán)境中生長繁殖的極端微生物，因其細(xì)胞和蛋白質(zhì)具有獨(dú)特的耐熱性，已引起廣泛關(guān)注，并且逐漸成為人們開發(fā)利用的重要微生物資源。世界各國科學(xué)家不斷從各種自然高溫生態(tài)環(huán)境、地?zé)岘h(huán)境中篩選和分離出不同屬、種的嗜熱菌[1]。嗜熱菌在實(shí)際應(yīng)用中表現(xiàn)出顯著的作用效果和潛在的應(yīng)用前景。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的肥料、飼料及環(huán)境保護(hù)中常用的微生物活菌制劑包括多種微生物，其中芽孢桿菌是一類需氧或兼性厭氧菌，菌體本身含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)，隨著它們在動物消化道內(nèi)的繁衍、代謝，可產(chǎn)生維生素、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)和未知生長因子等，參與機(jī)體新陳代謝，同時還具有生物拮抗功能，可以減少動物腸道有害菌的數(shù)量，維持消化道菌群平衡[2-5]，在實(shí)際生產(chǎn)中得到了廣泛的應(yīng)用。

目前我國允許作為生態(tài)制劑的微生物有乳酸菌制劑、糞腸球菌制劑、芽孢桿菌制劑、酵母菌制劑和復(fù)合微生態(tài)制劑等。但通常使用的益生菌菌株的抗逆性較差，不耐熱，在飼料加工過程中損失較大，不能像芽孢桿菌可以直接加到配合飼料中，因此嗜熱芽孢桿菌作為益生菌的一種，具有其特有的生物特性。與其他微生物活菌制劑相比，芽孢桿菌具有在條件不利的環(huán)境下形成芽孢將自己保護(hù)起來的特點(diǎn)，且復(fù)活率高。同時芽孢桿菌還具有耐酸、耐鹽、耐高溫及耐積壓等優(yōu)點(diǎn)[6-8]，因此在飼料、肥料的生產(chǎn)中具有較高的穩(wěn)定性。目前在肥料、飼料工業(yè)及環(huán)保中應(yīng)用的主要有地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)等，在使用時多制成休眠狀態(tài)的活菌制劑或與乳酸菌混合使用[9]，有益的芽孢桿菌能促進(jìn)機(jī)體免疫器官及組織的成熟，使這些器官、組織處于高度準(zhǔn)備狀態(tài)，可促進(jìn)T-淋巴細(xì)胞、B-淋巴細(xì)胞數(shù)量增加，從而提高機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫水平，因此，芽孢桿菌在動物和人體的微生態(tài)調(diào)節(jié)中也得到了高度的重視和廣泛的應(yīng)用。

本研究以水產(chǎn)飼料為材料，采用常規(guī)細(xì)菌分離鑒定法結(jié)合分子生物學(xué)法從水產(chǎn)飼料中分離鑒定出4株嗜熱芽孢桿菌，并對菌株的耐高溫、耐酸、耐膽鹽及對大腸桿菌、沙門氏菌抑菌性等一系列生物學(xué)特性進(jìn)行研究，為后續(xù)試驗(yàn)以及微生態(tài)飼料添加劑的開發(fā)及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為水產(chǎn)飼料蛋白粉，購自當(dāng)?shù)厥袌觥?/p>

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 搖瓶培養(yǎng)基 稱取2.5 g LB培養(yǎng)基溶于100 mL蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌15 min，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 產(chǎn)蛋白酶初篩選擇性培養(yǎng)基 干酪素8 g，磷酸氫二鈉(Na2HPO4)1 g，磷酸氫二鉀(K2HPO4)0.36 g，瓊脂20 g，氯化鈉(NaCl)5 g，加入1 000 mL蒸餾水，加熱攪拌，pH值7.4±0.2，121 ℃高壓滅菌15 min，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 產(chǎn)淀粉酶初篩選擇性培養(yǎng)基 牛肉浸膏5 g，酪蛋白水解物17.5 g，淀粉1.5 g，瓊脂13.5 g，加入1 000 mL蒸餾水，加熱攪拌，pH值7.2±0.2，121 ℃高壓滅菌15 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 芽孢桿菌的分離、純化

取2 g樣品溶解到20 mL無菌水中，振蕩溶解。取混合液接種到20 mL LB液體培養(yǎng)基中，于45 ℃振蕩(150 r/min)培養(yǎng)24～48 h，待培養(yǎng)基變得混濁后，取1 mL培養(yǎng)液按一定的稀釋度稀釋，涂布于LB固體培養(yǎng)基上，置于50 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，挑取單菌落，接于新鮮培養(yǎng)基上，重復(fù)多次直至菌落純化。選取生長較好的A2、A3、A4、A5菌株進(jìn)行理化性質(zhì)的研究。

1.4 生長曲線及最適生長條件測定

生長曲線的測定：將菌液按1%的比例接種到100 mL LB培養(yǎng)基中，45 ℃振蕩培養(yǎng)，每2 h測定1次。

菌株最適生長溫度的測定：將處于對數(shù)生長期早期的LB菌株培養(yǎng)液0.5 mL接種到5 mL LB培養(yǎng)基中，分別置于30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 ℃水浴振蕩培養(yǎng)18 h。

最適生長pH值的測定：將處于對數(shù)生長期早期的LB菌株培養(yǎng)液0.5 mL分別接種到pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，置于45 ℃水浴振蕩培養(yǎng)18 h。

以上試驗(yàn)均設(shè)平行。用721型分光光度計(jì)比色測定D600 nm進(jìn)行生長條件的分析。

耐膽鹽試驗(yàn)：菌液按1 ∶50(體積比)的接種量分別接種于膽鹽濃度為0、3、6 g/L的液體培養(yǎng)基中，每組重復(fù)3次，45 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h后測定菌液的D600 nm。

1.5 產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶試驗(yàn)

產(chǎn)淀粉酶試驗(yàn)：首先配制產(chǎn)淀粉酶初篩試驗(yàn)的MH培養(yǎng)基，121 ℃高壓滅菌15 min，制成平板備用；將分離出來的A2、A3、A4、A5菌株分別接種于裝有LB液體培養(yǎng)基的試管中，45 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)(12±2)h；將培養(yǎng)好的A2、A3、A4、A5菌株取5 μL點(diǎn)樣于產(chǎn)淀粉酶培養(yǎng)基上，在(45±1)℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，待長出單菌落，滴入盧戈氏碘液覆蓋菌落，觀察是否產(chǎn)生透明圈。

產(chǎn)蛋白酶試驗(yàn)：首先配制產(chǎn)蛋白酶初篩試驗(yàn)培養(yǎng)基，121 ℃ 高壓滅菌15 min，制成平板備用；將分離出來的A2、A3、A4、A5菌株分別接種于裝有LB液體培養(yǎng)基的試管中，45 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)(12±2)h；將培養(yǎng)好的A2、A3、A4、A5菌株取5 μL點(diǎn)樣于產(chǎn)蛋白酶培養(yǎng)基上，在45 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，待長出單菌落，檢察是否產(chǎn)生蛋白酶水解圈。

1.6 抑菌試驗(yàn)

試驗(yàn)菌株菌液、大腸桿菌(ATCC 44102)及沙門氏菌菌液，分別以體積比1 ∶50(約1×106CFU/mL)的接種量同時接種于 10 mL 肉湯液體培養(yǎng)基中，另以滅菌生理鹽水替代試驗(yàn)菌株作為陽性對照。每組設(shè)3個重復(fù)，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h。采用平板活菌計(jì)數(shù)法，取樣涂布于麥康凱瓊脂平皿，37 ℃過夜，紅色菌落為大腸桿菌，其余為沙門氏菌，記錄大腸桿菌和沙門氏菌菌落數(shù)，計(jì)算各試驗(yàn)菌株對大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌率。

1.7 分子鑒定

用16S rDNA序列進(jìn)行鑒定，以確定其歸屬。PCR產(chǎn)物送上海捷瑞生物工程有限公司測序。分別將獲得的16S rDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast比對，選取相似度95%以上的序列進(jìn)一步分析。然后采用DNAMAN 5.2.9軟件進(jìn)行分析，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.8 透射電鏡觀察

處于對數(shù)生長期早期的細(xì)胞用固定液固定好后，制備超薄切片置于透射電鏡下進(jìn)行結(jié)構(gòu)觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離的菌落及形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

通過稀釋平板涂抹法分離得到4株芽孢桿菌，將其接種到普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，45 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h后觀察，菌落為圓形，邊緣不規(guī)則，表面有皺襞。挑取單個菌落涂片，可見呈革蘭陽性。透射電鏡觀察看到4株芽孢桿菌細(xì)胞呈直桿狀，常以成對或鏈?zhǔn)脚帕?，具圓端，都具有明顯的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，且都能明顯觀察到周圍有菌毛，如圖1所示。

2.2 分離株的生化鑒定

對4株菌株的細(xì)菌形態(tài)特征、革蘭氏染色觀察以及觸酶與發(fā)酵葡萄糖、木糖、甘露醇、木糖、蔗糖等常規(guī)生化試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 4株參試菌的生理生化特征

注：“+”表示陽性或能利用；“-”表示陰性或不能利用；“+/-”表示同一屬具體不同菌株之間的細(xì)微差別。

2.3 最適生長條件

2.3.1 生長曲線的測定 從0 h開始，每2 h測1次D600 nm，直到30 h，4株菌株基本進(jìn)入穩(wěn)定期。如圖2所示，A2、A3、A4、A5菌株均在12 h達(dá)到對數(shù)期，分別在26、20、20、 26 h 達(dá)到穩(wěn)定期。

2.3.2 菌株最適生長溫度的測定 將4株菌株置于不同溫度搖床培養(yǎng)，在18 h后同時測定菌液的D600 nm，以空白培養(yǎng)基作為對照，得到的結(jié)果如圖3所示，可見培養(yǎng)溫度對4株菌株的生長有一定的影響。在所選溫度范圍內(nèi)，菌體生物量隨溫度的變化而變化，當(dāng)培養(yǎng)溫度低于40 ℃時，菌體生長緩慢；A2、A4、A5菌株培養(yǎng)溫度在40～45 ℃之間時，菌體生長情況較好，以45℃最好，之后隨著溫度的升高，生長速度減慢。A3菌株在50 ℃時菌體生物量達(dá)到最高值。

2.3.3 菌株最適生長pH值的測定 將4株菌株置于不同pH值條件下，在45 ℃恒溫培養(yǎng)18 h后同時測定菌液的D600 nm，以空白培養(yǎng)基作為對照，測得的結(jié)果如圖4所示：初始pH值對4株菌株生長有明顯的影響，當(dāng)培養(yǎng)基pH值低于6.0時，菌體生長緩慢，當(dāng)初始pH值在6.0～7.5之間時，菌體生長情況較好。A2、A3菌株最適pH值為7.5，A4、A5菌株最適pH值為7.0。

2.4 耐膽鹽試驗(yàn)

由圖5可見，4株菌株各組的生長都受到膽鹽的抑制，D600 nm都低于不含膽鹽組，相比較而言，A2菌株耐受性較好。

2.5 產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶結(jié)果分析

4株菌株產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶結(jié)果如圖6所示，A2、A3菌株產(chǎn)淀粉酶，A4、A5菌株基本不產(chǎn)淀粉酶(圖6左圖)；4株菌株均能產(chǎn)蛋白酶，且A2菌株產(chǎn)蛋白酶能力最強(qiáng)(圖6右圖)。

2.6 抑菌試驗(yàn)

由表2可見，4株菌株對共同培養(yǎng)24 h的大腸桿菌都沒有抑制作用；A2、A5菌株對共培養(yǎng)的沙門氏菌的抑菌率分別為31.2%、22.9%，其他菌株為0。

表2 各菌株對共培養(yǎng)的大腸桿菌和沙門氏菌的抑制效果

2.7 16S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

測序獲得的A2、A3、A4和A5菌株16S rDNA基因片段長度分別為1 277、1 181、1 213和909 bp。利用BLAST(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，將所測菌株A2、A3、A4和A5的16S r DNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知細(xì)菌的16S rDNA序列進(jìn)行比較鑒定，已知A3、A4、A5菌株與Bacilluslicheniformisstrain H37的同源性分別為98%、99%、100%，說明A3、A4和A5菌株屬于嗜熱地衣芽孢桿菌屬(Bacilluslicheniformis)；已知A2與Bacillussubtilisstrain CC2FG1的同源性是97%，說明A2菌株屬于嗜熱枯草芽孢桿菌屬(Bacillussubtilis)。采用DNAMAN 5.2.9軟件繪制的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖7。

3 討論

從水產(chǎn)飼料中分離獲得4株菌株，細(xì)菌形態(tài)特征、革蘭氏染色等鑒定結(jié)果顯示，4株菌株與芽孢桿菌相似。由于芽孢細(xì)菌形態(tài)特征及其生理生化特性極其相似，因此僅通過形態(tài)特征及其生理生化特性只能初步確定這4株菌株為芽孢桿菌?；?6S rDNA特異性PCR擴(kuò)增的檢測等多種方法結(jié)合使用，經(jīng)鑒定，A2菌株與Bacillussubtilisstrain CC2FG1的同源性是97%，說明A2菌株屬于嗜熱枯草芽孢桿菌；A3、A4、A5菌株與Bacilluslicheniformisstrain H37的同源性分別是 98%、99%、100%，說明A3、A4和A5菌株屬于嗜熱地衣芽孢桿菌。

本研究以水產(chǎn)飼料為材料，分離篩選優(yōu)良的芽孢桿菌菌株并對其進(jìn)行初步鑒定，以此大致了解水產(chǎn)飼料中芽孢桿菌的菌相構(gòu)成。在此基礎(chǔ)上探究了芽孢桿菌對常見致病菌大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌作用，以期研究結(jié)果能為畜牧農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及微生態(tài)調(diào)節(jié)劑的制備提供前期理論依據(jù)和優(yōu)良的微生物資源。

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