黃誠(chéng)梅， 楊翠芳，， 魏源文， 鄧智年， 吳凱朝， 曹輝慶， 李楊瑞，

(1.廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530007； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心/農(nóng)業(yè)部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530007)

甘蔗蔗糖積累過(guò)程是甘蔗最重要的代謝途徑，與甘蔗產(chǎn)量和品質(zhì)形成密切相關(guān)。甘蔗蔗糖積累過(guò)程主要涉及蔗糖合成酶(sucrose synthase，簡(jiǎn)稱SS)、蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase，簡(jiǎn)稱SPS)、可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶(acid invertase，簡(jiǎn)稱AI)和中性轉(zhuǎn)化酶(neutral invertase，簡(jiǎn)稱NI)等，與蔗糖合成和分解反應(yīng)密切相關(guān)[1-2]。SPS在蔗糖代謝中被認(rèn)為是控制蔗糖合成的一個(gè)關(guān)鍵酶，其活性不僅能影響蔗糖的合成能力，還影響光合同化碳的分配和糖分積累[1-6]。Langenk?mper等用生物信息學(xué)方法對(duì)高等植物已知的SPS基因的全長(zhǎng)序列和其保守序列進(jìn)行分析，把SPS基因分為A、B、C這3個(gè)家族[7]。但Castleden等對(duì)小麥等單子葉植物的SPS基因進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，單子葉植物中的SPS基因分為5個(gè)家族，除了存在A(Ⅱ)、B(Ⅴ)、C(Ⅰ)家族外，還包括D(Ⅲ)和D(Ⅳ)家族[8]。目前，從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)上檢索可知，已經(jīng)從玉米[9]、菠菜[10]、甜菜[11]、柑橘[12]、蘋果[13]、水稻[14]、甘蔗[15]、馬鈴薯[16]等作物中克隆到SPS基因。

甘蔗(SaccharumofficinarumL.)是最主要的糖料作物，蔗糖占世界食糖總產(chǎn)量的76%，占我國(guó)食糖總產(chǎn)量的90%以上。作為C4高生物量和高纖維作物，甘蔗是一種理想的能源作物。蔗糖代謝是甘蔗生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中最重要的代謝途徑。甘蔗SPS基因SPSⅡ于1997年被成功克隆[15]，近年來(lái)，甘蔗SPS基因家族的其他成員也先后被成功克隆，如SPSⅡ(EU269038.1)、SPSⅢ(EU278618.1、EU278617.1)、SPSA(HM854011.1)、SPSB(JN584485.1、HQ117935.1)。但到目前為止，對(duì)甘蔗SPS基因家族的功能及表達(dá)特性等方面的研究報(bào)道仍然較少。利用已克隆的甘蔗SPSⅢ cDNA片段，通過(guò)半定量RT-PCR方法對(duì)SPSⅢ在工藝成熟期中甘蔗不同基因型及其不同部位中的表達(dá)差異進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究SPSⅢ的表達(dá)特性及其在甘蔗蔗糖代謝中的作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料與試劑

供試甘蔗材料包括桂糖28號(hào)(GT28)、果蔗Badila、新臺(tái)糖20號(hào)(ROC20)、新臺(tái)糖22號(hào)(ROC22)，均由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室提供。

甘蔗總RNA提取世紀(jì)Trizol購(gòu)自Invitrogen公司；Ex-Taq酶、dNTPs Mixture、DNA Maker、載體pMD-18-T-Vector、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、X-Gal等均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；PCR擴(kuò)增引物由寶生物工程(大連)有限公司合成；所用的菌株為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存的大腸桿菌JM109，小量膠回收試劑盒購(gòu)自上海華禹生物工程有限公司；其他試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 植物材料的種植與取樣

試驗(yàn)在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院溫室大棚進(jìn)行，采用口徑為 35 cm、桶底直徑為28 cm的黑色塑料桶裝沙質(zhì)土壤進(jìn)行桶栽，每桶4～6芽，齊苗后定苗，每桶2～3株，其余管理措施與一般桶栽試驗(yàn)的管理措施相同。于甘蔗生長(zhǎng)后期、工藝成熟初期進(jìn)行取樣，每個(gè)甘蔗基因型選取生長(zhǎng)比較一致的5株植株，取+1、0葉、嫩葉鞘、幼莖(最高可見(jiàn)肥厚帶的第1張完全展開(kāi)葉為+1葉，自下而上位于+1葉之上的為0葉，自上往下數(shù)位于+1葉下面的為+2葉，依此類推[17])。葉片選用距葉環(huán)20～60 cm區(qū)段，去除中脈后立即放于液氮中，混勻分裝保存用于總RNA的提取。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI的GenBank與DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)中的甘蔗SPS基因核酸序列，采用生物學(xué)軟件Primer Premier 5.0分析設(shè)計(jì)半定量RT-PCR的特異性引物，引物序列為SF2：5′-GGGAGGAGAAGGACTAAGGA-3′和SR2：5′-GCAAGACAA TAGGCTGAAGAG-3′。內(nèi)參基因引物參考甘蔗的看家基因25S rRNA的實(shí)時(shí)PCR引物[18]，引物序列為RF2：5′-GCAGCCAAGCGTTCATAGC-3′和RR2：5′-CCTATTGGTGG GTGAACAATCC-3′。

1.4 甘蔗總RNA提取及cDNA第1鏈合成

參照Invitrogen的Trizol方法[19]提取甘蔗各部位的總RNA。取各個(gè)部位的總RNA 500 ng，用TaKaRa公司的AMV Reverse Transcriptase XL反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，反應(yīng)后將cDNA凍置-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 甘蔗SPSⅢ基因半定量RT-PCR分析

以甘蔗工藝成熟期各基因型各個(gè)部位的cDNA第1鏈為模板，以目的基因SPSⅢ引物及內(nèi)參基因25S rRNA的引物進(jìn)行半定量RT-PCR擴(kuò)增，分析SPSⅢ的表達(dá)情況。25 μL PCR反應(yīng)體系為10×Ex-TaqBuffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs Mixture 2.0 μL、10 pmol/μL前引物1.0 μL、10 pmol/μL 后引物1.0 μL，模板cDNA第1鏈1.0 μL，5 U/μL Ex-Taq酶 0.2 μL，ddH2O補(bǔ)足至25.0 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，50～55 ℃退火35 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃下保存。反應(yīng)完成后，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗各個(gè)部位總RNA的提取及其cDNA第1鏈的合成

由圖1可見(jiàn)，4個(gè)甘蔗基因型的+1、0葉、幼嫩葉鞘、幼莖4個(gè)不同部位采用Trizol法提取得到的總RNA經(jīng)電泳檢測(cè)，2條主帶28S與18S清晰完整，沒(méi)有明顯的拖尾現(xiàn)象。RNA濃度及其純度檢測(cè)表明，D260 nm/D230 nm比值大于2.0，D260 nm/D280 nm比值在1.8～1.9之間。以500 ng總RNA進(jìn)行cDNA第1鏈合成，以進(jìn)行下一步的半定量PCR擴(kuò)增。

2.2 甘蔗工藝成熟初期SPSⅢ基因表達(dá)分析

在甘蔗工藝成熟初期，SPSⅢ在4個(gè)甘蔗基因型的+1、0葉、幼嫩葉鞘、幼莖中均已有表達(dá)，但SPSⅢ表達(dá)因甘蔗基因型不同而有所差異(圖2)。GT28的4個(gè)部位中，在+1葉中表達(dá)量較高，0葉、嫩葉鞘和幼莖的表達(dá)量都很低；在果蔗Badila的4個(gè)部位中表達(dá)量差異不大，以0葉的表達(dá)量最高；在ROC20中以嫩葉鞘中的表達(dá)量最高；而在ROC22中以幼莖中表達(dá)量最高。由此可見(jiàn)， 不同基因型的SPSⅢ表達(dá)情況存在差異。

2.3 甘蔗工藝成熟中期SPSⅢ基因表達(dá)分析

由圖3可見(jiàn)，在甘蔗工藝成熟中期，SPSⅢ在4個(gè)甘蔗基因型的+1、0葉、幼嫩葉鞘、幼莖中的表達(dá)量較初期沒(méi)有明顯差異。在果蔗Badila 4個(gè)部位中的表達(dá)量稍高于其他3個(gè)品種，而在GT28的4個(gè)部位中表達(dá)量最低；ROC20與ROC22的4個(gè)部位中均以在嫩葉鞘中的表達(dá)量較高，其次為+1葉。

2.4 甘蔗工藝成熟后期SPSⅢ基因表達(dá)分析

由圖4可見(jiàn)，在甘蔗工藝成熟后期，SPSⅢ在4個(gè)甘蔗基因型的+1、0葉、幼嫩葉鞘、幼莖中的表達(dá)量較前2個(gè)時(shí)期迅速提高，均達(dá)到了較高的表達(dá)水平，尤其是在GT28、果蔗Badila和ROC20中，而在ROC22的0葉、幼嫩葉鞘2個(gè)部位中表達(dá)量較低。其中，SPSⅢ基因在GT28的4個(gè)部位中表達(dá)較前2個(gè)時(shí)期迅速提高，+1葉、0葉、嫩葉鞘、幼莖的表達(dá)水平相當(dāng)；SPSⅢ基因在果蔗Badila的幼莖中表達(dá)量稍弱外，其他3個(gè)部位的表達(dá)水平均較高；SPSⅢ在高糖品種ROC20的幼莖中表達(dá)量較其他3個(gè)部位的高；而在ROC22的+1葉與幼莖中表達(dá)量較0葉與嫩葉鞘高。結(jié)果表明，在甘蔗工藝成熟后期，SPSⅢ基因達(dá)到較高的表達(dá)水平，以利于甘蔗糖分積累進(jìn)入成熟收獲期。

3 結(jié)論與討論

SPS已經(jīng)被確認(rèn)是甘蔗蔗糖積累過(guò)程中的主要關(guān)鍵酶之一，SPS活性可直接影響甘蔗的蔗糖合成能力和糖分積累[1-6，20]。SPS基因家族的不同成員在不同植物體內(nèi)的表達(dá)特性不同，所發(fā)揮的功能也不同[21]。由于生產(chǎn)上的甘蔗品種多為異源多倍體，遺傳背景復(fù)雜且差異很大，加上甘蔗SPS基因家族又十分復(fù)雜，由此推斷，甘蔗SPS基因的表達(dá)情況也是十分復(fù)雜的。Gpl等研究發(fā)現(xiàn)，甘蔗SPS基因中的 B(Ⅴ) 和C(Ⅰ)家族主要在葉片中表達(dá)，D家族中的2個(gè)亞家族[D(Ⅲ)和D(Ⅳ)]在各種部位中均表現(xiàn)出較相似的表達(dá)水平[22]；而A(Ⅱ)家族在葉中表達(dá)量最低，從莖尖分生組織往下到第7節(jié)間的表達(dá)量表現(xiàn)為逐漸降低，而從甘蔗頂部葉到下部莖表達(dá)量逐節(jié)增強(qiáng)，在蔗莖中的轉(zhuǎn)錄量占SPS轉(zhuǎn)錄總量的40%。葉冰瑩等研究表明，在糖分積累初期蔗莖中的SPSⅡ相對(duì)表達(dá)量最大，在糖分積累中期蔗葉中的SPSⅡ相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高峰[23]；同組織部位中，糖分積累初期SPSⅡ 相對(duì)表達(dá)量高于糖分積累中、后期。Verma等用半定量PCR對(duì)甘蔗SPSⅡ的表達(dá)進(jìn)行研究，結(jié)果表明，甘蔗SPSⅡ 基因在成熟節(jié)間比未成熟節(jié)間表達(dá)量高，高糖品種比低糖品種表達(dá)量高[24]。

關(guān)于SPSⅢ在甘蔗中的表達(dá)情況仍鮮有報(bào)道，本研究結(jié)果表明，SPSⅢ在GT28、果蔗Badila、ROC20、ROC22這4個(gè)甘蔗基因型的+1、0葉、幼嫩葉鞘、幼莖中均有表達(dá)，其表達(dá)量因基因型不同及測(cè)定部位與時(shí)期不同而異。其中，在工藝成熟初期，4個(gè)甘蔗基因型中，以GT28的4個(gè)部位較其他3個(gè)品種的低，而在果蔗Badila的4個(gè)部位中表達(dá)較穩(wěn)定，在ROC20中以嫩葉鞘中表達(dá)量最高；而ROC22以在幼莖中表達(dá)量最高。在工藝成熟中期，SPSⅢ在4個(gè)甘蔗基因型的+1、0葉、幼嫩葉鞘、幼莖中的表達(dá)量較初期沒(méi)有明顯差異；以在果蔗Badila 4個(gè)部位中的表達(dá)量稍高于其他3個(gè)品種，而在GT28的4個(gè)部位中表達(dá)量最低；在ROC20與ROC22的4個(gè)部位中表達(dá)量變化一致，以+1葉、嫩葉鞘中表達(dá)量明顯高于0葉和幼莖，尤其是在嫩葉鞘中。在工藝成熟后期，SPSⅢ在4個(gè)甘蔗基因型的+1、0葉、幼嫩葉鞘、幼莖中的表達(dá)量較前2個(gè)時(shí)期迅速提高，均達(dá)到了較高的表達(dá)水平，尤其是在GT28、果蔗Badila和ROC20中，而在ROC22的0葉和嫩葉鞘2個(gè)部位中表達(dá)量較低。這表明，在甘蔗工藝成熟后期，SPSⅢ 達(dá)到較高的表達(dá)水平，利于甘蔗糖分積累，利于進(jìn)入成熟收獲期。在本研究的4個(gè)甘蔗材料中，GT28、ROC20、ROC22都是生產(chǎn)上的甘蔗品種，遺傳背景差異很大。而果蔗Badila是甘蔗屬中的熱帶種典型代表之一，遺傳背景較單一[25]。因此，SPSⅢ在這4種不同基因型中的表達(dá)差異可能與甘蔗材料的遺傳背景有關(guān)?；虮磉_(dá)是SPS活性調(diào)控的主要方式之一[3]，因此，為了進(jìn)一步探討SPS基因表達(dá)與甘蔗糖分積累的關(guān)系，對(duì)SPS基因家族中各成員的表達(dá)情況進(jìn)行深入研究是十分必要的。至于SPSⅢ在高、低糖甘蔗基因型及不同成熟度節(jié)間的表達(dá)情況等還有待于繼續(xù)研究，以進(jìn)一步探討SPSⅢ基因表達(dá)對(duì)甘蔗糖分積累的影響。

SPSⅢ在GT28、果蔗Badila、ROC20、ROC22這4個(gè)甘蔗基因型的+1、0葉、幼嫩葉鞘、幼莖中均有表達(dá)，其表達(dá)量因基因型不同及測(cè)定部位與時(shí)期不同而異。在甘蔗工藝成熟后期，SPSⅢ達(dá)到較高的表達(dá)水平，利于甘蔗糖分積累，以利于甘蔗進(jìn)入成熟收獲期，表明該基因很有可能在甘蔗的蔗糖代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

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