張 寧 張馨允 范學(xué)輝 張清安

(陜西師范大學(xué)食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119)

苦杏仁苷是苦杏仁中重要的組成成分，在與其共存的β-葡萄糖甙酶的作用下會(huì)分解(水解)產(chǎn)生苯甲醛和氫氰酸(HCN)。當(dāng)人食入過(guò)量HCN后會(huì)出現(xiàn)焦慮、頭痛、頭暈、癱瘓、昏迷及意識(shí)下降等中毒癥狀，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致死亡[1-2]。因此，在苦杏仁加工過(guò)程中，脫苦是必不可少的環(huán)節(jié)，即通過(guò)對(duì)苦杏仁的適當(dāng)處理，使其苦杏仁苷含量降至苦味閾值范圍以內(nèi)。

目前，常用的苦杏仁脫苦方法有：冷水脫苦法[3]、熱水脫苦法[4]、酸溶液脫苦法[5-6]、酸-堿交替脫苦法[7]、真空脫苦法[6]和微波脫苦法[8]等，但以上幾種方法都存在能耗高(水、電消耗大)、耗時(shí)長(zhǎng)(短則6～7 h，長(zhǎng)則需要6～7 d)等問(wèn)題。據(jù)估算[9]，加工1 t苦杏仁需排放20 t廢水，其中含有250 kg左右的苦杏仁苷、蛋白質(zhì)、黃酮、碳水化合物和膳食纖維等物質(zhì)，不僅營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失嚴(yán)重，還導(dǎo)致資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。因此，苦杏仁的快速、節(jié)能、高效脫苦成了苦杏仁加工領(lǐng)域亟待解決的瓶頸問(wèn)題。超聲波技術(shù)作為一種新的食品加工手段，近年來(lái)已被廣泛應(yīng)用于食品[10-12]及醫(yī)藥[13-14]等領(lǐng)域，并有良好的效果。如關(guān)于超聲波在加速酒類(lèi)陳化方面，結(jié)果顯示超聲波能夠有效地加速紅酒[11]、白酒[15]及果醋[16]等的熟化。在苦杏仁加工方面，呂真真等[17]和謝朝暉等[18]研究表明，超聲波可加快其中苦杏仁苷的萃取速率，但這些研究均是基于先破碎苦杏仁然后進(jìn)行提取。本課題組[19]前期研究發(fā)現(xiàn)，超聲波可以促進(jìn)整?？嘈尤手锌嘈尤受盏目焖偃艹?，不僅可以達(dá)到快速脫苦的目的，還減少了因傳統(tǒng)破碎處理而對(duì)后續(xù)加工產(chǎn)品種類(lèi)的限制。

因此，本研究擬在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)影響超聲波脫苦效率的頻率、功率和超聲溫度進(jìn)行優(yōu)化，并以苦杏仁苷的溶出率為響應(yīng)值，進(jìn)而篩選出最優(yōu)脫苦條件，以便使其更加有效地應(yīng)用于苦杏仁加工脫苦領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

苦杏仁：購(gòu)于陜西省西安市西北藥材市場(chǎng)；

甲醇(99.9%)：色譜純，美國(guó)Fisher Scientific公司；

苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)品(98.42%)：色譜純，成都普菲德生物技術(shù)有限公司；

純凈水：成都娃哈哈昌盛飲料有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)儀器設(shè)備

電子天平：HANGPING JA 2003型，上海儀器儀表廠；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：101型，北京科偉永興儀器有限公司；

高效液相色譜儀：P230II分析型，大連依利特分析儀器有限公司；

色譜柱：TC-C18型(250 mm×4.6 mm，5 μm)，安捷倫科技有限公司；

超聲波多頻清洗機(jī)：SB-500DTY型，江蘇省昆山市超聲儀器有限公司；

九陽(yáng)料理機(jī)：JYL-C020E型，九陽(yáng)股份有限公司；

循環(huán)水式多用真空泵：SHZ-D(III)型，鄭州科豐儀器設(shè)備有限公司；

數(shù)顯電熱恒溫水溫箱：HH·W21·600S型，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 選取顆粒飽滿、無(wú)損壞的苦杏仁，用天平精準(zhǔn)稱量，按1∶1 (g/mL)加水浸泡5 h后去皮，為避免苦杏仁中內(nèi)源酶對(duì)苦杏仁苷含量的影響，將所得脫皮苦杏仁按料液比1∶5 (g/mL)置于100 ℃水中煮沸10 min，再進(jìn)行滅酶處理[20]，即得待測(cè)的苦杏仁樣品，貯藏備用。

1.2.2 超聲脫苦及苦杏仁中苦杏仁苷的測(cè)定 精密稱取25.000 0 g 苦杏仁樣品，按照一定的料液比加入水，在一定的溫度、超聲頻率和超聲功率下進(jìn)行脫苦，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的超聲處理后取出苦杏仁，將其置于70 ℃條件下干燥后粉碎。精密稱取1.000 0 g苦杏仁粉末，加入100 mL甲醇，于超聲功率300 W、超聲頻率59 kHz條件下提取45 min，冷卻過(guò)濾即得苦杏仁中殘留苦杏仁苷的提取液，供高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)使用。

色譜柱為T(mén)C-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為水∶甲醇=72∶28 (mL/mL)，柱溫35 ℃，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm，進(jìn)樣量20 μL，所有樣品均需經(jīng)0.45 μm濾膜，苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)曲線及液相色譜圖如圖1所示。

1.2.3 苦杏仁苷溶出率 按式(1)的計(jì)算：

(1)

式中：

Y——苦杏仁苷溶出率，%；

A0——未經(jīng)超聲處理苦杏仁中苦杏仁苷提取液的色譜峰面積；

A1——經(jīng)超聲處理后苦杏仁中苦杏仁苷提取液的色譜峰面積。

圖1 苦杏仁苷標(biāo)準(zhǔn)曲線及液相色譜圖Figure 1 Standard curve and liquid chromatogram of amygdalin

1.2.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1) 超聲時(shí)間：固定料液比為1∶10 (g/mL)，超聲溫度為50 ℃，超聲功率為250 W，超聲頻率為28 kHz，分別在超聲時(shí)間為20，30，40，50，60 min條件下，研究超聲時(shí)間對(duì)苦杏仁中苦杏仁苷溶出率的影響。

(2) 超聲溫度：固定料液比為1∶10 (g/mL)，超聲時(shí)間為40 min，超聲功率為250 W，超聲頻率為28 kHz，分別在超聲溫度為30，40，50，60，70 ℃條件下，研究超聲溫度對(duì)苦杏仁中苦杏仁苷溶出率的影響。

(3) 料液比：固定超聲時(shí)間為40 min，超聲溫度為50 ℃，超聲功率為250 W，超聲頻率為28 kHz，分別在料液比為1∶6，1∶8，1∶10，1∶12，1∶14 (g/mL)條件下，研究料液比對(duì)苦杏仁中苦杏仁苷溶出率的影響。

(4) 超聲功率：固定料液比為1∶10 (g/mL)，超聲時(shí)間為40 min，超聲溫度為50 ℃，超聲頻率為28 kHz，分別在超聲功率為150，200，250，300，350 W條件下，研究超聲功率對(duì)苦杏仁中苦杏仁苷溶出率的影響。

(5) 超聲頻率：固定料液比為1∶10 (g/mL)，超聲時(shí)間為40 min，超聲溫度為50 ℃，超聲功率為250 W，分別在超聲頻率為25，28，40，59 kHz條件下，研究超聲頻率對(duì)苦杏仁中苦杏仁苷溶出率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，固定超聲時(shí)間為60 min，料液比為1∶12 (g/mL)，分別考察超聲溫度、頻率及功率3個(gè)因素對(duì)苦杏仁超聲脫苦的影響，以苦杏仁苷的溶出率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面Box-Behnken優(yōu)化設(shè)計(jì)，對(duì)所得試驗(yàn)結(jié)果建立二次回歸模型，并進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲處理時(shí)間對(duì)苦杏仁苷溶出率的影響 由圖2可知，在超聲脫苦過(guò)程中，開(kāi)始苦杏仁苷溶出率快速增大，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，溶出率趨于穩(wěn)定。在試驗(yàn)超聲時(shí)間范圍之內(nèi)，苦杏仁中苦杏仁苷并未完全遷移至水中，當(dāng)超聲時(shí)間為60 min 時(shí)，苦杏仁苷溶出率雖只到達(dá)55.99%，但此時(shí)苦味已經(jīng)較弱。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中，可以將超聲時(shí)間固定為60 min，進(jìn)一步研究超聲溫度、功率、頻率等參數(shù)變化對(duì)苦杏仁苷溶出率的影響，從而得到苦杏仁最佳超聲快速脫苦工藝。

圖2 超聲處理時(shí)間對(duì)苦杏仁苷溶出率的影響Figure 2 Effect of ultrasonic time on the dissolution rate of amygdalin

2.1.2 超聲溫度對(duì)苦杏仁苷溶出率的影響 由圖3可知，苦杏仁苷溶出率隨超聲溫度的升高呈增大趨勢(shì)，當(dāng)超聲溫度為60 ℃時(shí)，溶出率達(dá)到最大值。原因可能是，溫度較低時(shí)脫苦液黏度較低，質(zhì)點(diǎn)傳質(zhì)效果好，有利于苦杏仁苷溶出，溫度升高分子內(nèi)能增強(qiáng)，分子熱運(yùn)動(dòng)逐漸加快，從而導(dǎo)致苦杏仁細(xì)胞組織間的疏水鍵可能被滲入的分子破壞，從而使得苦杏仁苷向水中的遷移擴(kuò)散、溶出率增大[21]；但溫度過(guò)高時(shí)會(huì)引起已溶出到脫苦液中苦杏仁苷快速降解，其降解速度大于溶出速度，最終導(dǎo)致苦杏仁苷溶出率有降低趨勢(shì)，也不利于節(jié)能。考慮到苦杏仁苷溶出率為50%左右時(shí)已基本達(dá)到脫苦要求，因此響應(yīng)面試驗(yàn)中超聲溫度選取50，55，60 ℃ 3個(gè)水平值。

圖3 超聲溫度對(duì)苦杏仁苷溶出率的影響Figure 3 Effect of ultrasonic temperature on the dissolution rate of amygdalin

2.1.3 料液比對(duì)苦杏仁苷溶出率的影響 由圖4可知，當(dāng)料液比在1∶6～1∶8 (g/mL)時(shí)，苦杏仁苷溶出率增加較快；料液比在1∶8～1∶16 (g/mL)時(shí)，苦杏仁苷溶出率的增長(zhǎng)變得緩慢。但從總體上看，在試驗(yàn)范圍內(nèi)苦杏仁苷溶出率始終呈增加趨勢(shì)。由文獻(xiàn)[22]可知，苦杏仁苷易溶于水，且傳質(zhì)動(dòng)力也會(huì)隨著苦杏仁脫苦體系中水比重的增加而增加。因此，苦杏仁苷向水中的遷移也會(huì)隨之增強(qiáng)，超聲處理的空化效應(yīng)形成的微射流和局部熱點(diǎn)也會(huì)使苦杏仁苷溶出率增加；但料液比為1∶16 (g/mL)也會(huì)導(dǎo)致水溫在相同的產(chǎn)熱條件下有所降低，使固、液兩相間的吸附作用增強(qiáng)[23]，從而導(dǎo)致苦杏仁苷溶出率減緩。同時(shí)，對(duì)于工業(yè)化的苦杏仁脫苦而言，過(guò)多的溶濟(jì)也會(huì)造成資源浪費(fèi)、能耗及成本增加。綜合考慮，選擇料液比1∶12 (g/mL)作為苦杏仁超聲快速脫苦工藝優(yōu)化中最適條件。

圖4 料液比對(duì)苦杏仁苷溶出率的影響Figure 4 Effect of liquid ratio on the dissolution rate of amygdalin

2.1.4 超聲功率對(duì)苦杏仁苷溶出率的影響 由圖5可知，隨著超聲功率的增加苦杏仁苷的溶出率呈先增大后減小趨勢(shì)，超聲功率為300 W時(shí)，溶出率達(dá)到最大值?？赡苁浅暪β瘦^大時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量氣泡，減少了能量傳遞，同時(shí)功率過(guò)大還可能導(dǎo)致部分苦杏仁苷的降解[24]，使水中所能被檢測(cè)到的苦杏仁苷含量減少。此外，功率過(guò)大也會(huì)加速苦杏仁中其他物質(zhì)如蛋白質(zhì)、碳水化合物等向水中遷移[25-26]，不僅會(huì)影響苦杏仁苷的遷移與擴(kuò)散，而且會(huì)使水質(zhì)變得渾濁，嚴(yán)重降低了苦杏仁的品質(zhì)，同時(shí)也增加了能耗。因此響應(yīng)面試驗(yàn)中超聲功率選取200，250，300 W 3個(gè)水平值。

圖5 超聲功率對(duì)苦杏仁苷溶出率的影響Figure 5 Effect of ultrasound power on the dissolution rate of amygdalin

2.1.5 超聲頻率對(duì)苦杏仁苷溶出率的影響 由圖6可知，超聲頻率越大，苦杏仁苷的溶出率越大。其原因是超聲頻率越高其空化效應(yīng)也越強(qiáng)，苦杏仁受到水中空化泡崩潰瞬間巨大沖擊力的作用細(xì)胞壁發(fā)生破裂[24,27]，從而加速了苦杏仁苷的遷移，使其溶出率增加，當(dāng)超聲頻率為59 kHz時(shí)苦杏仁苷的溶出率最大?？紤]到所用超聲波的實(shí)際工況情況(在設(shè)定頻率值上下有1～2 kHz的偏差波動(dòng))，因此響應(yīng)面試驗(yàn)中超聲頻率選取28，40，59 kHz 3個(gè)水平值。

圖6 超聲頻率對(duì)苦杏仁苷溶出率的影響Figure 6 Effect of ultrasound frequency on the dissolution rate of amygdalin

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)上述單因素試驗(yàn)，選取對(duì)超聲誘導(dǎo)苦杏仁快速脫苦有重要影響的超聲溫度、頻率及功率3個(gè)因素，以苦杏仁苷的溶出率為響應(yīng)值，因素及水平的編碼表如表1所示。采用Design Expert 8.0.6軟件優(yōu)化超聲工作參數(shù)并對(duì)表2中結(jié)果進(jìn)行回歸分析。

采用響應(yīng)面分析法對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸模型，得到交聯(lián)度(Y)的二次回歸模型：

Y=59.42+1.88A+4.94B+5.42C-1.31AB-0.92AC+3.36BC-4.80A2-5.42B2-4.56C2。

(2)

表3是響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)方差分析結(jié)果，其中，模型P<0.000 1，表示模型差異極顯著，而失擬項(xiàng)P=0.626 7(>0.05)，說(shuō)明差異不顯著，即該回歸模型能夠與實(shí)際情況較好地吻合，可反映出各因素響應(yīng)值間的關(guān)系。因此，可根據(jù)該回歸模型進(jìn)行試驗(yàn)結(jié)果分析。

2.2.2 響應(yīng)面結(jié)果的分析 由圖7可見(jiàn)，A、B兩因素之間存在交互作用，且等值線趨于扁平，同時(shí)，結(jié)合表3結(jié)果可知A與B之間交互作用對(duì)苦杏仁苷溶出率存在顯著影響。由響應(yīng)面圖可知，當(dāng)A一定時(shí)，隨著B(niǎo)的增加苦杏仁苷溶出率呈現(xiàn)先升高后略有降低，變化趨勢(shì)較平緩；而當(dāng)B一定時(shí)，隨著A的增加溶出率呈較為平緩的先升后降趨勢(shì)。同時(shí)還可看出，在A、B交互作用的等值線中，B因素等值線的密集程度大于A因素，說(shuō)明超聲功率對(duì)苦杏仁苷溶出率的影響大于超聲溫度。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)因素及水平編碼表Table 1 Factors and level of independent variables used for response surface design

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface optimization of experimental design and results

表3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)ANOVA分析表?Table 3 The anova analysis of response surface optimization experimental

由圖8可知，A、C兩因素間存在交互作用，但等值線趨于圓形，同時(shí)結(jié)合表3可知A與C交互作用對(duì)苦杏仁苷的溶出率影響不顯著。由響應(yīng)面圖可知，當(dāng)A一定時(shí)，隨著C的增加溶出率不斷升高后略有降低，但變化趨勢(shì)較為平緩；而當(dāng)C一定時(shí)，隨著A的增加溶出率呈平緩的先升后降趨勢(shì)。在A、C交互作用等值線中，C因素等值線的密集程度大于A因素，因此，超聲頻率對(duì)苦杏仁苷溶出率的影響大于超聲溫度。

由圖9可見(jiàn)，B、C兩因素間存在交互作用，且等值線較扁平，結(jié)合表3可知B與C的交互作用對(duì)苦杏仁苷溶出率存在顯著影響，且C因素等值線的密集程度大于B因素，表明超聲頻率對(duì)苦杏仁苷溶出率的影響大于超聲功率。

圖7 超聲溫度與功率對(duì)苦杏仁苷溶出率交互影響的響應(yīng)面及等值線圖Figure 7 Response surface and contour plots for the effects of ultrasonic temperature and power on the dissolution rate of amygdalin

圖8 超聲溫度與頻率對(duì)苦杏仁苷溶出率交互影響的響應(yīng)面及等值線圖Figure 8 Response surface and contour plots for the effects of ultrasonic temperature and ultrasound frequency on the dissolution rate of amygdalin

圖9 超聲功率與頻率對(duì)苦杏仁苷溶出率交互影響的響應(yīng)面及等值線圖Figure 9 Response surface and contour plots for the effects of ultrasonic power and ultrasound frequency on the dissolution rate of amygdalin

綜上可知，3個(gè)因素對(duì)苦杏仁苷溶出率影響為：超聲頻率>超聲功率>超聲溫度。

2.3 最優(yōu)預(yù)測(cè)工藝及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)二次回歸模型的預(yù)測(cè)結(jié)果可知，苦杏仁苷的最優(yōu)溶出理論條件為：超聲溫度55.19 ℃、功率283.10 W和頻率53 kHz，該條件下苦杏仁苷的理論溶出值可達(dá)63.50%?？紤]到所用超聲儀器實(shí)際工況情況，因此將工藝調(diào)整為：超聲溫度55 ℃、功率300 W和頻率59 kHz，在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，測(cè)得苦杏仁苷的含量為24.00 mg/g，苦杏仁苷實(shí)際平均溶出值為63.17%，與預(yù)測(cè)值間的相對(duì)誤差為0.33%，說(shuō)明在合理的試驗(yàn)范圍內(nèi)，預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的吻合性較好，該模型能夠很好地對(duì)實(shí)際情況進(jìn)行模擬。

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化出苦杏仁苷超聲脫苦的最佳工藝為：超聲溫度55 ℃、功率300 W、頻率59 kHz、超聲時(shí)間60 min、料液比1∶12 (g/mL)，該條件下苦杏仁苷的溶出率可達(dá)63.17%，在此條件下苦杏仁已沒(méi)有苦味。本研究以完整苦杏仁顆粒為研究對(duì)象，系統(tǒng)研究了超聲波工作參數(shù)對(duì)脫苦效率的影響，結(jié)果表明超聲波可將苦杏仁由傳統(tǒng)的6～7 h熱水脫苦時(shí)間縮短到1 h，大大縮短了苦杏仁脫苦所需時(shí)間，大量減少?gòu)U水排放和能源、資源浪費(fèi)，該研究結(jié)果可為苦杏仁的快速、高效脫苦工藝優(yōu)化提供理論依據(jù)；但其工業(yè)化應(yīng)用參數(shù)尚需進(jìn)一步優(yōu)化修正。