瑪爾哈巴·帕爾哈提 白羽嘉,2 王 瑾 朱婉彤 阿迪萊·圖爾蓀 馮作山

(1. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000；2. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)作物學(xué)博士后流動(dòng)站，新疆 烏魯木齊 830000)

甜瓜(CucumismeloL.)是新疆重要的果品特產(chǎn)之一[1-2]。在整個(gè)生長時(shí)期，甜瓜均可能受到鏈格孢菌(Alternariaalternata)侵染而引發(fā)黑斑病。黑斑病發(fā)病初期呈淺黃褐色，后期病斑明顯變黑，病、健組織之間分界明顯，伴隨表皮凹陷，果肉呈海綿狀黑色團(tuán)塊[3-5]。伽師瓜和86-1甜瓜是新疆主要甜瓜品種，多產(chǎn)于新疆喀什地區(qū)，其中伽師縣產(chǎn)量位居第一[6]。

當(dāng)植物受到病原菌侵染時(shí)，往往分泌幾丁質(zhì)酶(CHT)與β-1,3-葡聚糖酶(GLU)等病程相關(guān)蛋白，來提高自身防御能力。目前果實(shí)采后病程相關(guān)蛋白的研究也主要集中在CHT[7-8]和GLU上[9-10]。也有研究[11-13]表明，抗壞血酸過氧化物酶(APX)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)在植物抗病性方面起著重要作用。植物受病害侵染可誘導(dǎo)這些保護(hù)酶產(chǎn)生變化，增強(qiáng)抗病能力[14]。目前，有關(guān)甜瓜抗病菌侵染的研究[15-17]多見于其果肉組織上，本研究擬以伽師瓜和86-1甜瓜為試材，取其果肉及果皮組織為試驗(yàn)對(duì)象，比較二者抵抗病原菌侵染能力的差異，以期為選擇培育優(yōu)良甜瓜品種和甜瓜采后病害控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

伽師瓜、86-1甜瓜：采摘自新疆喀什地區(qū)伽師縣三鄉(xiāng)，選取無病蟲害、無機(jī)械損傷果實(shí)，伽師瓜單果重(4.0±0.5) kg，全生育期110～120 d，中心可溶性固形物14.0%，邊部可溶性固形物9.0%。86-1甜瓜單果重(3.5±0.5) kg，全生育期115 d左右，中心可溶性固形物14.0%，邊部可溶性固形物9.8%；

鏈格孢：分離自伽師瓜自然發(fā)病的果實(shí)，用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基于4 ℃保存；

冰醋酸、無水醋酸鈉、聚乙二醇6000、聚乙烯吡咯烷酮(K30)、曲拉通、愈創(chuàng)木酚、30% H2O2溶液、鄰苯二酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、丙酮、濃鹽酸、鹽酸、乙醇、五水合四硼酸鉀、對(duì)二甲氨基苯甲醛、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、抗壞血酸：分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；

二硫蘇糖醇、乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二鈉、L-蛋氨酸、氮藍(lán)四唑、核黃素：分析純，生工生物工程(上海)股份有限公司；

幾丁質(zhì)：分析純，美國西格瑪奧德里奇公司；

脫鹽蝸牛酶、β-巰基乙醇：分析純，上海索萊寶生物科技有限公司；

葡萄糖、瓊脂：生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子天平：FA2104N型，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；

pH計(jì)：FE20型，梅特勒-托利多儀器有限公司；

無菌操作臺(tái)：NBCJ-B型，上海鴻都電子科技有限公司；

恒溫霉菌培養(yǎng)箱：MHP-250型，上海鴻都電子科技有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：LDZX-50KBS型，上海申安醫(yī)療器械廠；

顯微鏡：XSP-2C型，上海蔡康光學(xué)儀器有限公司；

高速分散器：XHF-DY型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：TGL-16G型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

紫外—可見分光光度計(jì)：TU-1810PC型，北京普析通用公司；

超聲波清洗器：SK2200H型，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：DZKW-S-4型，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；

氣體傳輸泵：2XZ-2型，臨海市譚氏真空設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

(1) 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的制備：將馬鈴薯去皮切塊，稱取200 g放入1 000 mL蒸餾水中煮沸至發(fā)軟，用紗布過濾，補(bǔ)加蒸餾水至1 000 mL。加入20 g葡萄糖與15 g瓊脂，攪拌溶解，分裝至250 mL錐形瓶，121 ℃ 高壓滅菌20 min，倒平板備用。

(2) 孢子懸浮液的制備：將保藏鏈格孢菌種的培養(yǎng)基在無菌操作臺(tái)打開，用高溫滅菌過的鑷子取適量菌落，轉(zhuǎn)移至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，27 ℃黑暗培養(yǎng)7 d后用顯微鏡觀察菌落特征，確認(rèn)為所需菌種，收集孢子。用含有 0.01% Tween-80 的無菌水配制濃度為1×106個(gè)/mL 孢子懸浮液備用。

(3) 甜瓜預(yù)處理：用自來水沖洗，再用2%過氧化氫清洗并浸泡30 s消毒，最后用無菌水沖洗3遍，晾干備用，放入7 ℃ 冷庫預(yù)冷。

(4) 接種與取樣：在甜瓜果實(shí)赤道等距刺入3 個(gè)深度為5 mm的傷口(直徑3.5 mm)，吸取20 μL上述孢子懸浮液接入，對(duì)照組接入等量無菌水，用塑料膠條封住，裝箱，置于7 ℃、相對(duì)濕度85%～90%冷庫貯藏。

(5) 取樣：在0，3，6，9，12，15，18，21，24，27，30 d后觀察，取傷口周圍5 mm處果皮和果肉組織，液氮速凍，-80 ℃保存。每處理用果實(shí)10個(gè)。

1.2.2 病斑直徑測(cè)量 將接種鏈格孢菌的甜瓜沿3個(gè)傷口處切開，每次取4個(gè)瓜，切開的兩半瓜都測(cè)取，取平均值。

1.2.3 CHT和GLU活性測(cè)定 參照文獻(xiàn)[18]。

1.2.4 保護(hù)酶活性測(cè)定

(1) APX活性測(cè)定：參照文獻(xiàn)[19]。

(2) SOD活性測(cè)定：采用氮藍(lán)四唑光化還原法[20]。

(3) POD活性測(cè)定：參照Zauberman等[21]方法并做修改。稱取10 g冷凍果肉組織和5 g冷凍果皮組織，分別加入10，20 mL提取緩沖液(50 mmol/L pH 5.5 醋酸緩沖液，1 mmol/L 聚乙二醇6000，4 g/100 g聚乙烯吡咯烷酮K30，1 g/100 g 曲拉通)，充分研磨成勻漿后，于4 ℃、8 000×g離心30 min，上清液即為POD酶提取液。酶促反應(yīng)體系：25 mmol/L 愈創(chuàng)木酚溶液3 mL，0.5 mL酶提取液， 0.5 mol/L H2O2溶液200 μL。以蒸餾水為空白，立即在波長470 nm處測(cè)定吸光度值，然后每隔1 min 測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定6 min。以每克鮮重樣品每分鐘吸光度值增加1時(shí)為1個(gè)POD活性單位(U)，結(jié)果以U/g表示。

(4) PPO活性測(cè)定：參照Zauberman等[21]的方法并做修改。稱取10 g冷凍果肉組織和5 g冷凍果皮組織，分別加入10，20 mL提取緩沖液(100 mmol/L pH 5.5 醋酸緩沖液，1 mmol/L聚乙二醇6000，4 g/100 g聚乙烯吡咯烷酮K30，1 g/100 g 曲拉通)，充分研磨成勻漿后，于4 ℃、8 000×g離心30 min，上清液即為PPO酶提取液。酶促反應(yīng)體系：50 mmol/L、pH 5.5醋酸緩沖液4 mL， 50 mmol/L鄰苯二酚溶液1 mL，100 μL 酶提取液。以蒸餾水為參比空白，立即在波長420 nm 處測(cè)定吸光度值，然后每隔1 min 測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定6 min。以每克鮮重樣品每分鐘吸光度變化值增加1時(shí)為1個(gè)PPO活性單位(U)，結(jié)果以U/g表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行差異性顯著分析，P<0.05 表示差異顯著，利用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及繪圖，試驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 鏈格孢侵染甜瓜果實(shí)病斑直徑的變化

病斑直徑可直接反映果實(shí)的病情變化。由圖1可知，第12天2種甜瓜均開始出現(xiàn)黑色病斑，由果皮向果肉發(fā)散擴(kuò)大，與蔣黎艷等[22]對(duì)溫州蜜柑的研究結(jié)果相一致。果皮和果肉的病斑直徑隨著貯藏天數(shù)的增加均逐漸擴(kuò)大，果肉病斑直徑始終大于果皮。但與86-1甜瓜相比，伽師瓜病斑直徑擴(kuò)展相對(duì)較慢。第30天，86-1甜瓜果皮和果肉病斑直徑分別是伽師瓜果皮和果肉的1.14，1.06倍。從甜瓜組織分析，果皮較果肉可顯著抑制甜瓜的鏈格孢病斑直徑擴(kuò)大(P<0.05)，病斑直徑增長速度比果肉慢，與其它品種相比，伽師瓜比86-1甜瓜對(duì)抵御鏈格孢病菌侵染具有更強(qiáng)能力，且病斑直徑增長速度低于86-1甜瓜。同時(shí)本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，伽師瓜和86-1甜瓜果皮和果肉在同一天開始出現(xiàn)病斑，與張培嶺等[23]的研究結(jié)果一致。

圖1 鏈格孢侵染對(duì)2種甜瓜病斑直徑的影響Figure 1 Effects of Alternaria alternata infection on the lesions diameter of two melons

2.2 鏈格孢侵染對(duì)甜瓜果實(shí)病程相關(guān)蛋白活性的影響

2.2.1 CHT活性 病原菌引起植物抗病性機(jī)制不是單一的機(jī)制，存在著多種機(jī)制甚至是多種機(jī)制協(xié)同作用的結(jié)果[24]。大部分病原菌細(xì)胞壁的主要成分含有幾丁質(zhì)，而CHT可以有效地將其分解，從而破壞病原菌結(jié)構(gòu)達(dá)到抑制病原菌的作用[25]。由圖2可知，貯藏期間2種甜瓜果皮和果肉的CHT活性都呈先上升后下降的趨勢(shì)。伽師瓜和86-1甜瓜接種果皮分別在18～30，15～21 d CHT活性保持較高水平，說明甜瓜自身的抗病系統(tǒng)在這段時(shí)間發(fā)揮顯著作用，導(dǎo)致酶活性升高。9 d前各處理增長緩慢，在此之后迅速增長并相繼出現(xiàn)高峰，高峰之后緩慢下降，且2種甜瓜接種果皮均高于對(duì)照。伽師瓜接種果皮在第21天出現(xiàn)明顯高峰，是對(duì)照峰值的1.75倍。86-1甜瓜接種果皮CHT活性峰值提前3 d出現(xiàn)，是對(duì)照峰值的1.77倍，但僅為伽師瓜接種果皮峰值的50.74%。2種甜瓜接種果肉CHT活性變化較對(duì)照果肉更明顯。伽師瓜接種果肉CHT活性變化在第9天后迅速增大，在第18～24天保持較高CHT活性。86-1甜瓜接種果肉從第3天后CHT活性明顯增加，在第6～9天活性高于伽師瓜接種果肉，但差異不顯著，第18天出現(xiàn)CHT活性峰值，是伽師瓜接種果肉峰值的79.17%。單春會(huì)[26]將青霉菌接種于伽師瓜發(fā)現(xiàn)果實(shí)中CHT在不同侵染階段啟動(dòng)相應(yīng)反應(yīng)，這與本研究結(jié)果相似。

2.2.2 GLU活性 GLU存在于大部分高等植物中，與CHT協(xié)同作用下可明顯抑制病原菌的生長[27]。由圖3可知，整個(gè)貯藏期間2種甜瓜果皮和果肉GLU活性都呈先上升后下降的趨勢(shì)，與果實(shí)CHT活性有著相似變化。對(duì)于果皮，伽師瓜接種果皮GLU活性持續(xù)上升，在第24天出現(xiàn)峰值，86-1甜瓜接種果皮GLU活性緩慢上升，提前3 d達(dá)到最大活性值。伽師瓜和86-1甜瓜接種果皮均高于對(duì)照(P<0.05)。果肉趨勢(shì)與果皮相似，2種甜瓜果肉接種組均在第21天出現(xiàn)GLU活性峰值。伽師瓜接種果肉在第9天迅速升高隨后出現(xiàn)明顯峰值，是對(duì)照的2.42倍，這與CHT在伽師瓜接種果肉中活性變化表現(xiàn)相似，說明CHT可以和GLU協(xié)同，產(chǎn)生強(qiáng)烈抵抗作用，共同抵御鏈格孢菌侵染。86-1甜瓜接種果肉在貯藏前期GLU活性表現(xiàn)平緩，第21天達(dá)到GLU活性高峰后緩慢下降。柴喜榮等[28]發(fā)現(xiàn)黃瓜抵御疫病過程中，果實(shí)中GLU與CHT均顯著增加，并與黃瓜品種抗病性呈正相關(guān)。這表明，當(dāng)植物受到病原菌侵染時(shí)，往往分泌CHT與GLU等病程相關(guān)蛋白，來提高自身防御能力。

圖2 鏈格孢侵染對(duì)2種甜瓜CHT活性的影響Figure 2 Effects of Alternaria alternata infection on CHT activity of two melons

圖3 鏈格孢侵染對(duì)2種甜瓜GLU活性的影響Figure 3 Effects of Alternaria alternata infection on GLU activity of two melons

2.3 鏈格孢侵染對(duì)甜瓜果實(shí)保護(hù)酶活性的影響

2.3.1 APX活性 保護(hù)酶也與植物體抗病、抗病原菌入侵能力密切相關(guān)。APX可以有效清除細(xì)胞內(nèi)多種脅迫環(huán)境下產(chǎn)生的過多活性氧，使果實(shí)體系處于相對(duì)平衡狀態(tài)，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用[29]。由圖4可知，隨著貯藏天數(shù)的延長，2種甜瓜果皮和果肉的APX活性都不斷上升，在第30天有最大活性值。對(duì)于果皮，伽師瓜接種果皮在第15天迅速升高，而86-1甜瓜接種果皮總體緩慢上升，在上升期間，前者約是后者的2倍。對(duì)于果肉，伽師瓜接種果肉APX活性在第9天明顯升高，同時(shí)期86-1甜瓜接種果肉增長緩慢，說明APX在伽師瓜接種果肉貯藏前期就起到保護(hù)作用，一直維持到貯藏結(jié)束。有研究[30]表明，經(jīng)吡唑并嘧啶衍生物誘導(dǎo)的黃瓜接種尖孢鐮孢菌后，保護(hù)酶APX活性有所提高，且有APX基因表達(dá)。

2.3.2 SOD活性 由圖5可知，貯藏期間2種甜瓜的果皮和果肉SOD活性都呈先上升后下降的趨勢(shì)。對(duì)于果皮，伽師瓜接種果皮SOD活性漲幅趨勢(shì)明顯，其他處理SOD活性變化波動(dòng)不大，可能是受鏈格孢菌侵染，伽師瓜接種果皮在這段時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧，誘導(dǎo)SOD活性提高，起到了防御氧自由基產(chǎn)生的第一道防線作用[31]。伽師瓜和86-1甜瓜接種果皮分別在第18天和第21天出現(xiàn)活性高峰，前者是后者的3.67倍。對(duì)于果肉，伽師瓜和86-1甜瓜接種果肉SOD活性變化相似，峰值均在貯藏第21天出現(xiàn)，伽師瓜接種果肉SOD活性整體顯著高于86-1甜瓜的(P<0.05)。2種甜瓜果肉組SOD活性變化較果皮組平緩，可能是甜瓜受鏈格孢病菌侵染后，果皮比果肉發(fā)揮更積極的抵御作用。研究[32]發(fā)現(xiàn)，對(duì)不同感抗品種柑橘經(jīng)毒素處理，抗性品種柑橘SOD活性分別在處理初期和末期出現(xiàn)2次活性最大值。

圖4 鏈格孢侵染對(duì)2種甜瓜APX活性的影響Figure 4 Effects of Alternaria alternata infection on APX activity of two melons

圖5 鏈格孢侵染對(duì)2種甜瓜SOD活性的影響Figure 5 Effects of Alternaria alternata infection on SOD activity of two melons

2.3.3 POD活性 POD一方面在清除、阻止活性氧形成起著重要作用，另一方面，它與一些抗性物質(zhì)如總酚、黃酮、木質(zhì)素等的合成有緊密聯(lián)系[33-34]。由圖6可知，貯藏期間伽師瓜和86-1 2種甜瓜的果皮和果肉POD活性都呈先上升后下降的趨勢(shì)。對(duì)于果皮，伽師瓜接種果皮在第12～18天連續(xù)出現(xiàn)較高POD活性，并在第12天出現(xiàn)POD活性峰值，整個(gè)貯藏期間POD活性均高于對(duì)照(P<0.05)。86-1甜瓜接種果皮在第18天緩慢上升到高峰值后迅速下降，除第24天和第27天外，POD活性均高于對(duì)照(P<0.05)。對(duì)于果肉，伽師瓜接種果肉在貯藏前期POD活性直線上升，第12天出現(xiàn)POD活性峰值隨后急劇下降。86-1甜瓜接種果肉在第6天迅速達(dá)到POD活性高峰后緩慢下降。同樣的結(jié)果在香蕉果實(shí)中也有發(fā)現(xiàn)[35]。

2.3.4 PPO活性 PPO活性的增加是果實(shí)受病原菌侵染后發(fā)生的典型變化，PPO與POD兩者協(xié)同可以為果實(shí)細(xì)胞提供防御，以減少病原菌造成的傷害，因此被認(rèn)為是植物的保護(hù)酶之一[36]。由圖7可知，貯藏期間2種甜瓜果皮和果肉的PPO活性都呈先上升后下降的趨勢(shì)。對(duì)于果皮，伽師瓜果皮PPO活性峰值較86-1甜瓜晚12 d出現(xiàn)，除第12天外，伽師瓜接種果皮PPO活性均大于86-1甜瓜，說明PPO在貯藏后期對(duì)伽師瓜果皮抵御病原菌侵染起了主要作用，且抵抗作用

圖6 鏈格孢侵染對(duì)2種甜瓜POD活性的影響Figure 6 Effects of Alternaria alternata infection on POD activity of two melons

圖7 鏈格孢侵染對(duì)2種甜瓜PPO活性的影響Figure 7 Effects of Alternaria alternata infection on PPO activity of two melons

大于86-1甜瓜。對(duì)于果肉，伽師瓜接種果肉在第12天出現(xiàn)明顯PPO活性峰值，是對(duì)照的1.26倍。86-1甜瓜接種果肉在第18天出現(xiàn)PPO活性峰值，是對(duì)照的1.06倍。第15天開始，86-1甜瓜接種和對(duì)照果肉均高于伽師瓜接種和對(duì)照果肉，這是因?yàn)橘煿显谇捌诒憩F(xiàn)較強(qiáng)烈的抵御作用，隨著時(shí)間的推移慢慢減少，導(dǎo)致PPO活性低于86-1甜瓜。同樣在不同品種蘋果果實(shí)對(duì)抗灰霉病時(shí)，PPO活性表現(xiàn)為高抗品種高于感病品種高于高感品種[37]。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，伽師瓜病斑直徑小于86-1甜瓜，果皮病斑直徑小于果肉，說明伽師瓜比86-1甜瓜能更好地抵御鏈格孢侵染，其果皮也比果肉能更好保護(hù)果實(shí)不受病原菌損害。整個(gè)貯藏期間，增強(qiáng)的CHT、GLU、APX、SOD、POD和PPO活性與甜瓜果實(shí)對(duì)鏈格孢侵染抗病性緊密相關(guān)。與86-1甜瓜相比，伽師瓜果實(shí)中CHT、GLU、APX、SOD、POD和PPO活性更高。說明伽師瓜比86-1甜瓜有更積極的防御鏈格孢侵染作用，尤其在貯藏中后期作用顯著。今后的研究重點(diǎn)可以從同工酶電泳和分子水平等方向深入闡述甜瓜果實(shí)對(duì)鏈格孢侵染的抗病性機(jī)制，挖掘影響甜瓜抗病性的關(guān)鍵基因及代謝途徑。