李 婷 周春霞 馮 瑞 洪鵬志

(1. 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江 524088；2. 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088)

肌球蛋白是魚(yú)類(lèi)肌肉蛋白的主要成分，該蛋白以2個(gè)球狀頭部和1個(gè)棒狀尾部為骨架構(gòu)成了約160 nm的長(zhǎng)型不對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)[1]。肌球蛋白為鹽溶性蛋白，在高鹽溶液(600 mmol/L KCl)中，肌球蛋白以單體或可溶性寡聚體[2]形式分散在溶液中，體系熱穩(wěn)定性較好，這在食品的保水性和質(zhì)地方面起著非常重要的作用。而在低鹽溶液(<200 mmol/L KCl)中，肌球蛋白不易溶解[2]，受熱易發(fā)生變性聚集并伴有弱凝膠形成的趨勢(shì)，不利于水產(chǎn)品的精深加工。熱穩(wěn)定性是蛋白質(zhì)重要的功能特性，通過(guò)添加化學(xué)助劑來(lái)改善蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的研究繁多。一些多糖如果膠、卡拉膠能夠吸附在球狀蛋白質(zhì)表面形成一層“保護(hù)膜”，通過(guò)搭建靜電屏障來(lái)提高蛋白的熱穩(wěn)定性[3]；生物類(lèi)表面活性劑鼠李糖脂[4]和海藻糖脂[5]可以提高蛋白質(zhì)的熱解折疊溫度，并且隨添加量的增加，蛋白質(zhì)熱解折疊溫度進(jìn)一步提高，但研究對(duì)象均以牛血清白蛋白(BSA)為模型。Takai等[6]證明精氨酸可以顯著提高豬肉肌球蛋白在生理鹽溶液中的溶解度而不影響其二級(jí)結(jié)構(gòu)；Gao等[7]向0.1 mol/L NaCl中添加5 mmol/L 組氨酸后，鯉魚(yú)肌球蛋白溶解度明顯增加，形態(tài)學(xué)結(jié)果觀(guān)察到在熱處理過(guò)程中組氨酸誘導(dǎo)肌球蛋白形成了更細(xì)的聚集體和蜂窩狀網(wǎng)絡(luò)；但時(shí)嬌嬌[8]51-52、石彤[9]的研究顯示精氨酸、組氨酸對(duì)低離子強(qiáng)度下魚(yú)肉肌球蛋白的熱聚集無(wú)明顯抑制效果。

相較于植物蛋白而言，水產(chǎn)蛋白熱穩(wěn)定性較差，而一些改善劑如果膠、卡拉膠等大分子多糖通常需要特定的pH和較高的溫度條件才能溶解，在改善魚(yú)肉蛋白熱穩(wěn)定性時(shí)受到了限制。硫酸葡聚糖(dextran sulfate，DS)在室溫及中性條件即可溶解，更適合應(yīng)用于食品體系。研究[10-11]證實(shí)DS可有效抑制蛋白質(zhì)的熱聚集，但鮮見(jiàn)在魚(yú)肉蛋白中的應(yīng)用。為此，本研究以肌球蛋白為模型，在低離子強(qiáng)度(1，50，150 mmol/L KCl)熱處理(40，50，60，70，80 ℃，1 ℃/min)條件下，探討DS對(duì)肌球蛋白熱變性聚集的抑制效果及作用機(jī)理，提高對(duì)帶電多糖—蛋白質(zhì)相互作用的認(rèn)識(shí)，為肌球蛋白的基礎(chǔ)研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

鮮活羅非魚(yú)：湛江市場(chǎng)(2018年3～6月)；

硫酸葡聚糖(dextran sulfate，DS)、8-苯胺基-1-萘磺酸(8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS)：分析純，美國(guó)Sigma公司；

Lowry蛋白濃度測(cè)定試劑盒：上海荔達(dá)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)：Avanti J-26sxp型，美國(guó)貝克曼公司；

恒溫水浴鍋：TU-20HT型，英國(guó)比比科技有限公司；

圓二色譜儀：Chirascan V100型，英國(guó)應(yīng)用光物理公司；

納米粒度分析儀：Nano-2s MPT-2型，英國(guó)馬爾文儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 肌球蛋白的提取 根據(jù)洪偉[12]的方法，所用溶液均提前預(yù)冷至4 ℃。

1.3.2 樣液的制備 用Tris-HCl緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，1，50，150 mmol/L KCl，pH 7.0)對(duì)肌球蛋白透析24 h。Lowry法[13]測(cè)定蛋白濃度，用對(duì)應(yīng)的Tris-HCl緩沖液稀釋至2.0 mg/mL。

將肌球蛋白溶液分為兩組：① 未添加組；② 添加組：向不同離子強(qiáng)度(1，50，150 mmol/L KCl)下肌球蛋白溶液中加入0.4 mg/mL的硫酸葡聚糖。

1.3.3 程序升溫處理 運(yùn)行程序控溫?zé)崽幚碥浖O(shè)置升溫速率為1 ℃/min。用溫度計(jì)測(cè)量樣液溫度為40，50，60，70，80 ℃時(shí)[14]取出備用。對(duì)照組溫度為4 ℃。

1.3.4 濁度的測(cè)定 稀釋蛋白濃度至0.5 mg/mL，在350 nm 處測(cè)吸光度[14]。

1.3.5 溶解度的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[13]。溶解度按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

c——溶解度，%；

m1——上清液中可溶性蛋白濃度，mg/mL；

m2——離心前蛋白濃度，mg/mL。

1.3.6 二級(jí)結(jié)構(gòu)α-螺旋含量分析 蛋白濃度稀釋為0.1 mg/mL，設(shè)置掃描范圍為190～260 nm。樣品池光徑為1 mm，對(duì)照組測(cè)量溫度為4 ℃。使用儀器控溫程序進(jìn)行熱處理，升溫速率為1 ℃/min，在40，50，60，70，80 ℃時(shí)測(cè)試。根據(jù)Ogawa等[15]的方法計(jì)算α-螺旋含量。

1.3.7 表面電勢(shì)的測(cè)定 固定蛋白濃度1 mg/mL，設(shè)置He-Ne激光為633 nm、散射角為90°[16]對(duì)樣品進(jìn)行除塵。使用Smoluchowski方程計(jì)算電勢(shì)值。

1.3.8 透射電鏡分析 固定蛋白濃度0.25 mg/mL滴于150目銅網(wǎng)，超純水多次沖洗后用0.5%～1.0%的醋酸雙氧鈾負(fù)染[17]并放入烘干箱(37 ℃)烘干。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 9.0軟件對(duì)文中各數(shù)據(jù)作圖，用SPSS 19.0比較分析差異顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸葡聚糖對(duì)肌球蛋白濁度的影響

固定肌球蛋白2.0 mg/mL，加入0.4 mg/mL硫酸葡聚糖(DS)后，用對(duì)應(yīng)離子強(qiáng)度的Tris-HCl緩沖液稀釋至0.5 mg/mL，肌球蛋白體系濁度的變化如圖1所示，在低離子強(qiáng)度(1 mmol/L KCl)下，肌球蛋白呈不溶狀態(tài)[2]，蛋白溶液渾濁，可檢測(cè)的濁度值高，熱處理后肌球蛋白分子進(jìn)一步聚集，體系濁度明顯增大(P<0.05)。加入DS后，DS完全溶解，體系濁度值明顯減小(P<0.05)，熱處理過(guò)程中濁度變化不明顯，與對(duì)照組比較，濁度明顯降低(P<0.05)，表明DS能明顯抑制低離子強(qiáng)度下肌球蛋白的熱聚集[圖1(a)]。

隨著離子強(qiáng)度增加，分子間靜電相互作用增加，肌球蛋白纖絲狀聚集體逐漸解聚[8]12-13，體系濁度逐漸減小。在生理離子強(qiáng)度(150 mmol/L KCl)下，溶液中鹽離子所產(chǎn)生的反離子膠束作用[18]抑制了DS的溶解，肌球蛋白體系濁度明顯增大(P<0.05)，但與未添加DS的肌球蛋白比較，熱處理后體系濁度明顯降低(P<0.05)[圖1(c)]，肌球蛋白體系熱聚集情況有所改善。

2.2 硫酸葡聚糖對(duì)肌球蛋白溶解度的影響

如圖2所示，低離子強(qiáng)度(1 mmol/L KCl)下肌球蛋白的溶解度僅為25%，熱處理后溶解度明顯下降(P>0.05)，當(dāng)溫度為40 ℃時(shí)，肌球蛋白溶解度下降到約8%；添加DS后，肌球蛋白溶解度降低(P<0.05)，表明未經(jīng)熱處理時(shí)DS對(duì)低離子強(qiáng)度下肌球蛋白無(wú)增溶效果，可能是肌球蛋白和DS均屬于大分子產(chǎn)生了相分離現(xiàn)象[19]，DS此時(shí)無(wú)法與肌球蛋白完全結(jié)合。但在熱處理過(guò)程中含有DS的肌球蛋白溶解度變化不明顯，當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，其溶解度仍高于30%，表明DS能明顯抑制低離子強(qiáng)度下肌球蛋白的熱聚集。

隨著離子強(qiáng)度的升高，肌球蛋白溶解度隨之升高，這是因?yàn)辂}離子可誘導(dǎo)肌球蛋白纖絲解聚，分子以單體或可溶性寡聚體形式存在[20]。因此，在生理離子強(qiáng)度(150 mmol/L KCl)下可達(dá)84%。添加DS后，50 mmol/L KCl溶液中肌球

不同大寫(xiě)字母表示同一溫度之間差異顯著(P<0.05)；不同小寫(xiě)字母表示同一樣品之間差異顯著(P<0.05)

蛋白溶解度降低(P<0.05)，生理離子強(qiáng)度(150 mmol/L KCl)下無(wú)明顯變化(P>0.05)。但與未添加DS的肌球蛋白體系比較，添加DS后進(jìn)一步熱處理過(guò)程中肌球蛋白溶解度增加(P<0.05)，表明DS能部分抑制肌球蛋白的熱聚集。

2.3 硫酸葡聚糖對(duì)肌球蛋白電勢(shì)的影響

為了進(jìn)一步探討DS對(duì)肌球蛋白熱聚集的抑制機(jī)理，對(duì)3種離子強(qiáng)度下肌球蛋白分子的表面電勢(shì)進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。在試驗(yàn)范圍內(nèi)(pH 7.0)，肌球蛋白整體帶負(fù)電，隨著KCl濃度的升高，體系電勢(shì)逐漸減小，可能是鹽離子的增加對(duì)肌球蛋白分子表面擴(kuò)散雙電層產(chǎn)生了壓縮作用[21]，使肌球蛋白溶解度增加。經(jīng)過(guò)熱處理后，在1，50 mmol/L KCl條件下，隨著熱處理溫度的進(jìn)行(40～70 ℃)，肌球蛋白體系電勢(shì)逐漸減小，質(zhì)點(diǎn)間相互排斥作用減小，分散體系被破壞，分子間吸引力大于排斥力，發(fā)生聚集[22]。具體表現(xiàn)為懸浮液渾濁、顆粒粒徑增大，溶液中可溶性蛋白含量明顯下降。在150 mmol/L KCl下，鹽離子改變了帶電顆粒周?chē)碾x子分布[23]，隨溫度升高表面電勢(shì)有升高的趨勢(shì)。添加負(fù)電性多糖DS后，試驗(yàn)范圍內(nèi)肌球蛋白體系電勢(shì)均明顯增加(P<0.05)，在1 mmol/L KCl條件下最為明顯，與對(duì)照組相比體系電勢(shì)增加了約25 mV，表明DS與肌球蛋白分子形成了穩(wěn)定的分散體[24]。與未添加DS的肌球蛋白體系比較，在1，50 mmol/L KCl條件下，熱處理初期肌球蛋白分子受熱部分展開(kāi)，肌球蛋白表面帶正電荷的—NH3+通過(guò)靜電相互作用與DS上帶負(fù)電的—OSO3-結(jié)合形成復(fù)合物[25]，這種吸引作用比—NH3+與—CO2-的吸引作用要強(qiáng)烈，使得同溫度下肌球蛋白電勢(shì)明顯增大(P<0.05)，分子間排斥力大于吸引力，蛋白溶解度增加；當(dāng)溫度升高到60～80 ℃時(shí)，肌球蛋白表面電勢(shì)依然較高，溶解度無(wú)明顯變化，說(shuō)明DS-肌球蛋白形成的復(fù)合物熱穩(wěn)定性較好。而在生理離子強(qiáng)度下，在50～80 ℃ 溫度區(qū)間內(nèi)，DS對(duì)肌球蛋白電勢(shì)無(wú)明顯影響，可能與鹽離子的干擾作用抑制了DS的作用效果有關(guān)。因此，低離子強(qiáng)度下DS抑制肌球蛋白熱聚集的效果可能與分子間強(qiáng)的靜電相互作用有關(guān)。

不同大寫(xiě)字母表示同一溫度之間差異顯著(P<0.05)；不同小寫(xiě)字母表示同一樣品之間差異顯著(P<0.05)

不同大寫(xiě)字母表示同一溫度之間差異顯著(P<0.05)；不同小寫(xiě)字母表示同一樣品之間差異顯著(P<0.05)

2.4 硫酸葡聚糖對(duì)肌球蛋白α-螺旋含量的影響

3種離子強(qiáng)度下肌球蛋白分子二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化見(jiàn)圖4、5。KCl濃度為1 mmol/L時(shí)，溶解性差，α-螺旋含量?jī)H有45%。隨著KCl濃度增大，肌球蛋白表面電荷增加，氨基酸之間的靜電相互作用增強(qiáng)，溶解度增大，二級(jí)結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，α-螺旋含量逐漸增大。KCl濃度為150 mmol/L時(shí)，α-螺旋含量達(dá)到61.65%。為了探討熱處理過(guò)程中肌球蛋白的構(gòu)象變化，用CD光譜儀對(duì)其進(jìn)行升溫處理，當(dāng)溫度達(dá)到肌球蛋白的變性溫度(50 ℃左右)時(shí)，肌球蛋白α-螺旋含量顯著下降(P<0.05)，從CD圖譜中可以看出3個(gè)離子強(qiáng)度(1，50，150 mmol/L KCl)下肌球蛋白的特征峰已經(jīng)完全消失，說(shuō)明肌球蛋白已經(jīng)變性。繼續(xù)升高溫度(60～80 ℃)，蛋白分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，疏水基團(tuán)逐漸暴露，蛋白質(zhì)之間的非共價(jià)鍵引起無(wú)規(guī)則聚集[26]，溶解度逐漸下降，α-螺旋含量繼續(xù)降低。

圖4 硫酸葡聚糖對(duì)肌球蛋白CD譜圖的影響Figure 4 Effect of DS on the CD-spectra of myosin

據(jù)Ru等[25]報(bào)道，多肽鏈上羰基(—CO)和氨基(—NH)之間的氫鍵維持了蛋白質(zhì)的α-螺旋結(jié)構(gòu)。經(jīng)DS處理后，與未添加組相比，在KCl濃度為1～50 mmol/L的蛋白體系中，α-螺旋含量明顯增大(P<0.05)，可能是DS的高電荷密度對(duì)氫鍵有所影響[27]。熱處理后，即使在80 ℃，肌球蛋白的α-螺旋含量依然有20%。在CD圖譜中觀(guān)察到肌球蛋白208 nm處的肩峰完好，222 nm處的肩峰消失。在KCl濃度為150 mmol/L的蛋白體系中，α-螺旋含量隨溫度升高呈下降趨勢(shì)；但是CD圖譜顯示在50 ℃時(shí)肌球蛋白的特征峰依然完整。雖然不同體系中DS對(duì)肌球蛋白構(gòu)象的影響有所差異，但是足以說(shuō)明在熱處理過(guò)程中，DS可以保護(hù)肌球蛋白的部分二級(jí)結(jié)構(gòu)。

不同大寫(xiě)字母表示同一溫度之間差異顯著(P<0.05)；不同小寫(xiě)字母表示同一樣品之間差異顯著(P<0.05)

2.5 硫酸葡聚糖對(duì)肌球蛋白分子形態(tài)變化的影響

利用透射電子顯微鏡觀(guān)察肌球蛋白分子形態(tài)的變化見(jiàn)圖6。在低離子強(qiáng)度(1 mmol/L KCl)下，肌球蛋白呈細(xì)絲狀，分子互相交聯(lián)纏繞，50 ℃熱處理后肌球蛋白絲狀體斷裂、減少，分子頭部聚集變大、尾部相互纏繞形成明顯的聚集體；添加DS后，肌球蛋白纖絲部分解聚，體系有分散的趨勢(shì)，50 ℃熱處理后纖絲聚集形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，部分絲狀體聚集，與未添加DS的熱處理組比較，肌球蛋白的頭部和尾部未發(fā)生明顯大的聚集體，結(jié)合溶解度、電勢(shì)和分子二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化分析，DS誘導(dǎo)肌球蛋白蛋白分子靜電相互作用的變化導(dǎo)致了熱處理過(guò)程中網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，由此抑制了蛋白質(zhì)大分子間的熱聚集。

在50 mmol/L KCl條件下，體系中鹽離子的存在促進(jìn)肌球蛋白溶解，肌球蛋白絲狀體變粗、解聚。隨著鹽離子的繼續(xù)增加(150 mmol/L KCl)，肌球蛋白解離，以單體或二聚體形式均勻分散；經(jīng)過(guò)50 ℃熱處理后肌球蛋白絲狀體消失，頭部出現(xiàn)明顯聚集，尾部變短變粗，形成明顯的聚集體；添加DS后，蛋白質(zhì)粗絲發(fā)生解離，整體上看，肌球蛋白體系逐步分散。進(jìn)一步熱處理后，僅生理離子強(qiáng)度下的肌球蛋白形成了帶球狀顆粒的棒狀膠束，可能是溶液中與DS有強(qiáng)結(jié)合作用的反離子[18]較多，誘導(dǎo)了膠束的形成，體系有類(lèi)似弱凝膠的狀態(tài)。

3 結(jié)論

硫酸葡聚糖是水溶性陰離子多糖，在低離子強(qiáng)度下，DS的高電荷密度可以使肌球蛋白體系電勢(shì)升高，肌球蛋白纖絲部分解聚，體系分散，熱處理后蛋白質(zhì)分子部分伸展，DS的—OSO3-基團(tuán)與暴露在肌球蛋白表面—NH3+基團(tuán)產(chǎn)生強(qiáng)烈的靜電相互作用，形成了穩(wěn)定的復(fù)合物，保護(hù)了肌球蛋白分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)，分子形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，部分絲狀體聚集；生理離子強(qiáng)度下，由于DS與鹽離子形成的反離子的膠束作用使肌球蛋白形成膠束，但是與未添加DS的肌球蛋白體系相比，溶解度依然較高。綜上表明DS可有效抑制低離子強(qiáng)度下肌球蛋白分子的熱聚集。基于DS與肌球蛋白的作用機(jī)理可為抑制肌球蛋白熱變性聚集提供一條新的解決思路。但DS與肌球蛋白作用過(guò)程中是否會(huì)引起多糖及蛋白分子本身結(jié)構(gòu)的變化尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。