熊忠亮，喬軍晶

(1.上海海事大學(xué) 商船學(xué)院，上海 201306；2.上海海事大學(xué) 海洋科學(xué)與工程學(xué)院，上海 201306)

流式細(xì)胞儀技術(shù)被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生物學(xué)、微生物學(xué)、制藥學(xué)、生殖學(xué)等領(lǐng)域，是現(xiàn)代科學(xué)研究中的先進(jìn)儀器之一。20世紀(jì)90 年代初，隨著海洋科學(xué)的發(fā)展，流式細(xì)胞儀開(kāi)始進(jìn)入海洋生物學(xué)的研究范疇，應(yīng)用于海洋浮游植物和海洋細(xì)菌的分類鑒定計(jì)數(shù)和生理生化研究以及海洋經(jīng)濟(jì)物種遺傳育種等方面，極大推動(dòng)了海洋生態(tài)學(xué)和海洋實(shí)驗(yàn)生物學(xué)的發(fā)展。

本實(shí)驗(yàn)用流式細(xì)胞儀對(duì)水體中的活體微藻(異彎藻，塔胞藻)進(jìn)行快速計(jì)數(shù)，探討流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)的正確性與可靠性。

1 目的

(1)通過(guò)對(duì)兩種不同藻進(jìn)行流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)，驗(yàn)證流式細(xì)胞儀是否只對(duì)水體中特定某種藻的微藻計(jì)數(shù)有效；

(2)通過(guò)對(duì)水體中低濃度活體微藻進(jìn)行計(jì)數(shù)，驗(yàn)證流式細(xì)胞儀是否可以計(jì)數(shù)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)不到的低濃度；

(3)流式細(xì)胞儀在進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)，選用兩種熒光染色劑(PI和Viacount)分別計(jì)數(shù)，相比較說(shuō)明流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性；

(4)用流式細(xì)胞儀對(duì)兩種微藻(塔胞藻和異彎藻)的混合液進(jìn)行活藻計(jì)數(shù)，為流式快速計(jì)數(shù)水體中混合微藻奠定基礎(chǔ)；

(5)分別用流式細(xì)胞儀和血球計(jì)數(shù)板對(duì)處于對(duì)數(shù)期和衰亡期的微藻進(jìn)行計(jì)數(shù)，驗(yàn)證流式細(xì)胞儀是否較血球計(jì)數(shù)板更能準(zhǔn)確地計(jì)數(shù)活的微藻。

2 實(shí)驗(yàn)材料及方法

2.1 實(shí)驗(yàn)儀器、試劑和材料

表1 儀器

表2 化學(xué)試劑

表3 實(shí)驗(yàn)中所用的微藻(上海海洋大學(xué))

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 微藻培養(yǎng)

2.2.1.1人工海水配置

取9 L自來(lái)水倒入水桶內(nèi)，滴入3～4滴殺菌除氯水，以消除自來(lái)水中次氯酸的影響。將300 g海鹽加入水桶內(nèi)，攪拌使海鹽溶解。 先用孔徑為120μm的中速定性濾紙對(duì)配制好的人工海水進(jìn)行粗過(guò)濾，再使用孔徑為0.22μm的微孔濾膜進(jìn)行細(xì)過(guò)濾，除去未溶解的雜質(zhì)顆粒。

2.2.1.2培養(yǎng)液配置

對(duì)赤潮異彎藻和塔胞藻使用F/2培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，其主要成分見(jiàn)表4。

表 4 培養(yǎng)液主要成分

2.2.1.3微藻的培養(yǎng)

將微藻接種于各自的培養(yǎng)液中，接種好的藻液放在恒溫光照培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)4～5 d至微藻生長(zhǎng)狀況處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期。恒溫光照培養(yǎng)室培養(yǎng)條件： 26℃，晝夜光暗交替光照。

2.2.2 流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)

① 收集含藻培養(yǎng)液，其藻細(xì)胞數(shù)目約1×104～ 5×105個(gè)/mL，移入40 mL的離心管。

② 振蕩混勻后，從40 mL離心管中移取400μL的藻液至3.5 mL的樣品管，隨后加入380μL viacount試劑，振蕩混勻，4℃避光培育30min。

③ 取海水稀釋樣品指定倍數(shù)，用100μL的白色濾器過(guò)濾。

④將樣品管置于流式細(xì)胞儀中測(cè)量，流量設(shè)為2μL/s。

⑤流式細(xì)胞儀計(jì)算公式：藻細(xì)胞數(shù)/mL=細(xì)胞儀上顯示的活體微藻數(shù)/體積×1000×稀釋倍數(shù)

2.2.3 血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)方法

① 取1 mL的微藻懸液于小離心管中，加160μL 4%的戊二醛，靜置5min。

② 用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

③計(jì)算公式:藻細(xì)胞數(shù)/mL=80小格內(nèi)微藻細(xì)胞個(gè)數(shù)/80×400×104×稀釋倍數(shù)

3 結(jié)果與分析

3.1 流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)精確度與準(zhǔn)確度

用以Viacount為染色劑的流式細(xì)胞儀和血球計(jì)數(shù)板分別對(duì)同一濃度赤潮塔胞藻計(jì)數(shù)，觀察他們的平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果如圖1所示。

處理前樣品溫度15℃，流式計(jì)數(shù)流量2 μL/s，Viacount用量為400μL，

過(guò)濾用50μm的黃色濾頭

圖1 用以Viacount為染色劑的流式細(xì)胞儀與血球計(jì)數(shù)板

對(duì)低濃度塔胞藻的計(jì)數(shù)

從圖1得出，兩者計(jì)數(shù)的平均值相差無(wú)幾，約為7.65×105#/mL，但從RSD(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差)來(lái)看，在正常的計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)比血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的精確度高。

為了再次說(shuō)明流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性，選用了兩種染色劑(Viacount，PI)，來(lái)對(duì)低濃度塔胞藻進(jìn)行流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)。結(jié)果如圖2。

處理前樣品溫度15℃，流式計(jì)數(shù)流量2μL /sec，Viacount用量為400μL，

PI用量200μL，過(guò)濾用50μm的黃色濾頭

圖2 分別以Viacount和PI為染色劑對(duì)低濃度塔胞藻

進(jìn)行流式計(jì)數(shù)

由圖2得出，對(duì)于同一低濃度(約為1.7×103#/mL)塔胞藻的計(jì)數(shù)，Viacount和PI的計(jì)數(shù)結(jié)果相近。以Viacount為染色劑時(shí)的流式計(jì)數(shù)的RSD比以PI為染色劑時(shí)的高，但兩者的RSD均小于3%，分別為2.79%和0.51%。

3.2 流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)對(duì)不同濃度塔胞藻計(jì)數(shù)的結(jié)果

流式細(xì)胞儀正常的計(jì)數(shù)濃度范圍是1×104～5×105cells/mL，為了驗(yàn)證流式細(xì)胞儀能否準(zhǔn)確以及精確地測(cè)出低于這個(gè)濃度范圍的低濃度微藻的濃度，設(shè)定105，104，103，102四個(gè)濃度梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分別用以Viacount和PI為染色劑的流式細(xì)胞儀對(duì)稀釋過(guò)的微藻懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)并與理論濃度比較。其結(jié)果如圖3、4。

由圖3得出，流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)結(jié)果與理論結(jié)果相近。稀釋度為10時(shí)，計(jì)算值和測(cè)量值差異最大。原因可能是測(cè)稀釋液濃度時(shí)，移液槍取樣不均勻或振蕩不徹底以致樣品中微藻偏少。稀釋度為6、10、200的RSD均小于5%。稀釋度為2000時(shí)RSD在10%～15%之間，原因是稀釋度在2000時(shí)濃度在102數(shù)量級(jí)上，濃度太低，相對(duì)來(lái)說(shuō)，RSD就增大。

處理前樣品溫度15℃，流式計(jì)數(shù)流量2μL/s，Viacount用量為400μL，

過(guò)濾用50μm的黃色濾頭。

圖3 以Viacount 為染色劑對(duì)不同濃度梯度的

塔胞藻進(jìn)行流式計(jì)數(shù)

處理前樣品溫度15℃，流式計(jì)數(shù)流量2μL/s，PI用量200μL， 過(guò)濾用50μm的黃色濾頭。圖4 以PI 為染色劑對(duì)不同濃度梯度的塔胞藻進(jìn)行流式計(jì)數(shù)

從圖4可得，用PI做染色劑時(shí)的計(jì)數(shù)結(jié)果與用Viacount做染色劑時(shí)的計(jì)數(shù)結(jié)果出現(xiàn)相同規(guī)律。各個(gè)稀釋度的計(jì)算值與實(shí)測(cè)值相差很少，說(shuō)明在這種情況下流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確度。稀釋度為10、100、200時(shí)RSD均小于2%，稀釋度為2000時(shí)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在15%左右。結(jié)合圖3，說(shuō)明流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)用在對(duì)于不同濃度梯度塔胞藻的計(jì)數(shù)準(zhǔn)確度和精確度都很好。

3.3 流式細(xì)胞儀對(duì)不同濃度異彎藻計(jì)數(shù)的結(jié)果

在3.2節(jié)討論了流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)在不同濃度塔胞藻上的應(yīng)用，為了驗(yàn)證流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)對(duì)于除塔胞以外的微藻也有同樣的準(zhǔn)確度與精確性，選用了赤潮異彎藻對(duì)其進(jìn)行以PI為染色劑的流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)。結(jié)果如圖5。

處理前樣品溫度15℃，流式計(jì)數(shù)流量2μL/s，PI用量200μL， 過(guò)濾用50μm的黃色濾頭。圖5 以PI 為染色劑對(duì)不同濃度梯度的異彎藻進(jìn)行流式計(jì)數(shù)

由圖5可知，在不同稀釋度下，所有微藻懸液用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)的RSD均小于2%，表明計(jì)數(shù)精確度均很高。且各個(gè)稀釋度下(10、20、40、200)的計(jì)算值與實(shí)測(cè)值之間差異較小，說(shuō)明對(duì)于異彎藻，流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確度和精確度都很好。結(jié)合3.2節(jié)，可知流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)法不僅對(duì)于低濃度塔胞藻可靠，對(duì)于低濃度赤潮異彎藻的計(jì)數(shù)效果同樣可靠。

3.4 流式細(xì)胞儀對(duì)混合藻計(jì)數(shù)的結(jié)果

海水中微藻的種類不是單一的，存在的微藻有很多種。為了讓實(shí)驗(yàn)更具現(xiàn)實(shí)意義，選用塔胞藻和異彎藻的混合液作為研究對(duì)象。在混合之前，先用流式細(xì)胞儀測(cè)出所用塔胞藻和異彎藻的原始濃度，便于算出混合微藻懸液(有兩種混合方式，一種是塔胞藻∶異彎藻為1∶3混合，另一種是塔胞藻∶異彎藻為3∶1混合)的理論濃度值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6。

處理前樣品溫度15℃，流式計(jì)數(shù)流量2μL/s，Viacount用量為400μL， 過(guò)濾用50μm的黃色濾頭。圖6 以Viacount 為染色劑對(duì)兩種不同混合液進(jìn)行流式計(jì)數(shù)

由圖6可知，不管塔胞藻與異彎藻以何種比例混合(1∶3、3∶1)，混合液的理論濃度與由流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)的濃度都很接近。且兩種不同混合藻液的測(cè)量RSD都很小，分別為0.85%和1.5%，表明流式細(xì)胞儀對(duì)混合微藻懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)是可靠的。

4 結(jié)論

4.1 流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確度與精確度

用分別以Viacount和PI為染色劑的流式細(xì)胞儀對(duì)同一濃度赤潮塔胞藻進(jìn)行計(jì)數(shù)，得出兩者的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差卻均小于3%，且計(jì)數(shù)值與血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)值相近。再用以PI為染色劑的流式細(xì)胞儀對(duì)稀釋度分別為10、100、200、2000的赤潮塔胞藻進(jìn)行計(jì)數(shù)，當(dāng)稀釋度分別為10、100、200時(shí)，PI為染色劑的流式細(xì)胞儀RSD均小于2%，稀釋度為2000時(shí)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在15%左右，用以Viacount為染色劑的流式細(xì)胞儀進(jìn)行計(jì)數(shù)也得出相似的結(jié)論。將測(cè)試對(duì)象改為異灣赤潮藻或者異灣赤潮藻與塔胞藻的混合懸液，其測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%，說(shuō)明流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確度與精確度是可靠的。

4.2 流式細(xì)胞儀可計(jì)數(shù)各種濃度范圍內(nèi)的微藻

對(duì)于低濃度的活體微藻濃度，對(duì)不同濃度的塔胞藻進(jìn)行計(jì)數(shù)。流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)在1×103～1×106的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差基本在2%左右，最大不超過(guò)5%。在1×102誤差在15%左右。相比血球計(jì)數(shù)板正常范圍內(nèi)的RSD(10%～20%)，其結(jié)果更為可靠。

4.3 流式細(xì)胞儀可對(duì)不同藻類進(jìn)行計(jì)數(shù)

選用低濃度異灣藻計(jì)數(shù)，在10，20，40，200的稀釋度下，所有微藻懸液用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)的RSD均小于2%，說(shuō)明流式細(xì)胞儀對(duì)低濃度活體微藻的計(jì)數(shù)不僅只對(duì)塔胞藻有效。所以流式細(xì)胞儀快速，準(zhǔn)確并精確的計(jì)數(shù)水體中低濃度的活體微藻對(duì)不同微藻都適用。

4.4 流式細(xì)胞儀可對(duì)藻類混合藻進(jìn)行進(jìn)行計(jì)數(shù)

用流式細(xì)胞儀對(duì)不同比例的塔胞藻和異彎藻的混合藻液(1∶3和3∶1)進(jìn)行計(jì)數(shù)，理論值和計(jì)數(shù)值相差不大，RSD均小于

2%。從而說(shuō)明流式細(xì)胞儀可用于在混合藻類計(jì)數(shù)。

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