王玉琦 王東華 李婷婷 王 旭 于殿宇

(東北農(nóng)業(yè)大學食品學院1，哈爾濱 150030)(東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院2，哈爾濱 150030)

米糠是稻米加工的副產(chǎn)物，它的利用價值非常高，含有的必需氨基酸平衡合理，生物效價高[1]。研究表明，米糠中富含多種營養(yǎng)成分和生理活性物質(zhì)，其中米糠多糖能降血壓、降血糖和抗腫瘤；米糠中植酸鈣有促進人體新陳代謝和骨骼組織生長發(fā)育的功能；米糠蛋白是目前世界公認的優(yōu)質(zhì)植物性蛋白，米糠中含有10%～20%的米糠蛋白[2]。米糠蛋白不含抗營養(yǎng)因子，對人體具有低過敏性、抗癌活性和保健的功能[3-8]，米糠蛋白功效比為2.0～2.5，與牛奶中功效比為2.5的酪蛋白相近，消化率達90%以上，米糠蛋白的營養(yǎng)價值可與動物蛋白相媲美[9-10]。目前，從米糠中提取米糠油的研究比較深入，由于研究技術(shù)的限制，造成我國米糠資源的利用率仍然偏低，經(jīng)脫脂后的米糠中仍有多種水溶性營養(yǎng)物質(zhì)沒被提取出來，如可溶性的米糠蛋白、米糠多糖、碳水化合物、植酸、維生素、礦物質(zhì)等。

米糠中的植酸鹽與蛋白質(zhì)和糖類等物質(zhì)易結(jié)合形成難溶的復(fù)合物，同時米糠蛋白分子間又含較多二硫鍵，導(dǎo)致米糠蛋白的溶解性降低，從而使營養(yǎng)物質(zhì)利用率下降[11-12]。已有研究用酶法改善米糠的溶解性，其反應(yīng)條件溫和，不產(chǎn)生有害物質(zhì)，且米糠粉得率較高[13-14]。白莉等[15]分別采用α-淀粉酶、纖維素酶和果膠酶對米糠提取蛋白，得到蛋白質(zhì)提取率分別為37.85%、43.93%、30.73%，其中纖維素酶的提取效果最佳。王雪飛等[16]比較了多種酶酶解回收蛋白質(zhì)，回收率達62.04%，但由于是單一酶作用，蛋白質(zhì)回收率低；李坤等[17]采用淀粉酶、纖維素酶和植酸酶復(fù)合酶法提取米糠蛋白，米糠蛋白提取率為80.06%。但在超臨界CO2狀態(tài)下利用植酸酶、淀粉酶和堿性蛋白酶的復(fù)合酶法生產(chǎn)米糠粉還鮮見報道。反應(yīng)物在超臨界流體中的溶解度增大，使酶與底物充分接觸，反應(yīng)時間短、效率高，且超臨界CO2具有無毒無味、化學性質(zhì)穩(wěn)定、經(jīng)濟、來源廣泛、不會對熱敏性食品及其風味產(chǎn)生影響等優(yōu)點[18-20]。

本實驗利用植酸酶將難溶性的植酸鹽絡(luò)合物酶解后，把蛋白質(zhì)釋放出來，而不影響蛋白整體結(jié)構(gòu)，解除它們對蛋白質(zhì)和淀粉的干擾[21-22]；再選擇一定比例的堿性蛋白酶和α-淀粉酶消除淀粉與蛋白質(zhì)的交聯(lián)作用，降低淀粉分子的分支化度，增加直鏈淀粉的比例，通過對蛋白質(zhì)進行降解使其轉(zhuǎn)化為容易消化吸收的多肽，有利于蛋白質(zhì)和糖類等營養(yǎng)成分的提取[23]，提高米糠蛋白的溶解性。

本研究主要考察超臨界CO2流體對酶的酶解效率影響，以及將淀粉酶解為可溶解的多糖和單糖的效率以及蛋白質(zhì)的提取效率，考察制得米糠粉的成分和得率，確定二次酶解對米糠粉特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

低溫脫脂米糠：黑龍江省北大荒米業(yè)集團有限公司；植酸酶(10 000 U/g，食品級)、α-淀粉酶(10 000 U/g，食品級)、堿性蛋白酶(60 000 U/g，食品級)：上海萬安科技有限責任公司；3,5-二硝基水楊酸、乙醇、鹽酸和燒堿等均為分析純。

RE-501旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：北京瑞成偉業(yè)儀器設(shè)備有限公司；JMS-50膠體磨：廊坊利杰食品有限公司；150 mL超高壓反應(yīng)釜：實驗室自制；LD4-2A低速離心機：北京醫(yī)用離心機廠；B-290噴霧干燥機：瑞士BUCHI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 脫脂米糠酶解的過程

在常壓狀態(tài)下，稱取低溫脫脂米糠10 g，加入80 mL體積的水分，浸泡處理后經(jīng)膠體磨磨漿，得到米糠漿液，添加到150 mL超高壓反應(yīng)釜內(nèi)，參照王雪飛[24]的實驗條件并略有改動，植酸酶的添加量為1.0%，pH為5.5，酶解溫度50 ℃，將其加入反應(yīng)釜內(nèi)，酶解一定時間后，終止反應(yīng)，滅酶鈍化后，將底物經(jīng)離心分離、蒸發(fā)濃縮和噴霧干燥后稱重，得到一次酶解產(chǎn)物。同樣方法，將底物添加到150 mL超高壓反應(yīng)釜內(nèi)，充入8 MPa CO2，使酶解反應(yīng)在超臨界CO2狀態(tài)下進行。

得到一次酶解產(chǎn)物后，在常壓狀態(tài)下，調(diào)節(jié)超高壓反應(yīng)釜內(nèi)溫度和pH以適應(yīng)堿性蛋白酶與α-淀粉酶的反應(yīng)條件，再加入適量堿性蛋白酶與α-淀粉酶，酶解一定時間后，終止反應(yīng)，得到的產(chǎn)物經(jīng)滅酶鈍化處理后，得到二次酶解產(chǎn)物。將底物冷卻至室溫，在3 000 r/min條件下離心分離5 min，得到濾渣和濾液。將濾液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，通過真空噴霧干燥，進風溫度185 ℃，出風溫度90 ℃，離心噴霧轉(zhuǎn)速2 000 r/min，得到米糠粉并稱重。同樣方法，得到一次酶解產(chǎn)物后，將酶添加到150 mL超高壓反應(yīng)釜內(nèi)，充入8 MPa CO2，調(diào)節(jié)超高壓反應(yīng)釜內(nèi)溫度和pH，使酶解反應(yīng)在超臨界CO2狀態(tài)下進行，滅酶鈍化后得到二次酶解產(chǎn)物，再經(jīng)離心分離和噴霧干燥后，得到米糠粉并稱重。

1.2.2 產(chǎn)品得率的測定

米糠粉是脫脂米糠經(jīng)過復(fù)合酶水解法等處理后得到的富含多種營養(yǎng)元素的固態(tài)粉末，根據(jù)米糠粉得率來反映脫脂米糠酶解的效果：

得到二次酶解產(chǎn)物后，加上一次酶解產(chǎn)物的質(zhì)量比上脫脂米糠的質(zhì)量為二次酶解后的得率。

1.3 原料組分測定

水分含量：GB/T 5497—1985《糧食、油料檢驗 水分測定方法》；灰分：GB/T 5505—2008《糧油檢驗 灰分測定法》；粗脂肪含量：GB/T5512—2008《糧食、油料檢驗 粗脂肪測定法》；淀粉含量：GB/T 5009.9—2003《食品中淀粉的測定方法》；膳食纖維含量：GB/T 5009.88—2008《食品中膳食纖維的測定》；還原糖含量：GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測定方法》；蛋白質(zhì)含量、氮溶指數(shù)(NSI)：GB/T 5009.5—1985《食品中蛋白質(zhì)的測定》；可溶性糖含量(以蔗糖計)的測定采用苯酚-硫酸法[25]。

1.4 速溶性分析

參照劉曉毅[26]的方法測定米糠粉的速溶性，用45 g溫度為80 ℃的蒸餾水，溶解5 g酶解后脫脂米糠粉，啟動攪拌器低速攪拌，記錄粉末完全溶解的時間為t，根據(jù)QB/T 4067《食品工業(yè)用速溶茶行業(yè)標準》，全部溶解的時間在5 s內(nèi)即為速溶。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有實驗數(shù)據(jù)重復(fù)3次，利用正交設(shè)計助手對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計并做方差分析，用Origin 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 一次酶解脫脂米糠的效果

在常壓下酶解時間為70 min時，米糠粉得率最高為42.3%，在超臨界酶解脫脂米糠，當酶解時間為60 min時，米糠粉得率最高為48.2%，可以看出在超臨界CO2條件下酶解脫脂米糠后，因其在超臨界流體中的溶解度增大，酶與底物充分接觸，使反應(yīng)時間縮短、酶解效率高。如圖1所示，超臨界CO2狀態(tài)下米糠粉得率較常規(guī)酶解高出14.0%左右，酶解時間縮短了10 min。

圖1 酶解時間和質(zhì)量比對米糠粉得率的影響

2.2 堿性蛋白酶與α-淀粉酶最佳配比的選擇

在1.2.1所述條件下進行，堿性蛋白酶與α-淀粉酶的酶添加量4.0%，酶解時間60 min，pH為8.0，酶解溫度55 ℃時，按照不同的比例進行酶解，結(jié)果如圖1所示。最終確定堿性蛋白酶與α-淀粉酶質(zhì)量比為1:1時，米糠粉得率最高。沒有選擇在常壓的條件下進行，由于在實驗中發(fā)現(xiàn)超臨界CO2的條件下只影響酶的酶解效率和米糠粉的得率，不影響其酶的比例，故此常壓條件下實驗并未體現(xiàn)。

2.3 二次酶解脫脂米糠的效果

2.3.1 酶解時間對米糠粉得率的影響

調(diào)節(jié)pH 8.0，酶添加量4.0%，溫度55 ℃，在磁力攪拌條件下分別進行超臨界和常壓酶解反應(yīng)，考察堿性蛋白酶和α-淀粉酶酶解時間對米糠粉得率的影響，實驗結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，脫脂米糠在超臨界CO2體系酶解反應(yīng)中，在開始的一段時間里，隨著酶解時間的增加，米糠粉得率逐漸提高，這是由于此時底物濃度較高，酶解時間較短，反應(yīng)還未飽和。酶解時間為60 min時，米糠粉得率達到最高，之后趨于穩(wěn)定，這是由于反應(yīng)趨于飽和狀態(tài)，隨著產(chǎn)物濃度的增加，對底物產(chǎn)生了抑制作用，且酶的活性逐漸降低，因此米糠粉得率幾乎不再增加，所以選擇最適酶解時間為60 min，而常規(guī)酶法酶解最適時間70 min。原因可能是在超臨界CO2狀態(tài)下激發(fā)了酶的活性中心，同時進行二次酶解新鮮米糠蛋白，使酶在各自的反應(yīng)體系內(nèi)更好地發(fā)揮了效率，使酶解的時間縮短，所以在超臨界CO2體系下生產(chǎn)米糠粉的酶解反應(yīng)時間相比于常規(guī)酶法大大縮短了，提高了酶解效率的同時提高了米糠粉得率。

2.3.2 酶添加量對米糠粉得率的影響

按照1.2.1方法進行，調(diào)節(jié)pH 8.0，溫度55 ℃，加入不同量的酶，在磁力攪拌條件下分別進行超臨界和常壓酶解反應(yīng)，酶解時間為60 min，考察酶添加量對米糠粉得率的影響，實驗結(jié)果如圖2所示。

圖2 酶解溫度、pH及酶添加量對米糠粉得率的影響

由圖2可知，開始時隨著酶添加量的增加，米糠粉得率逐漸增加，當酶添加量超過4.0%時，酶解反應(yīng)中米糠粉得率的增加趨于平緩。是由于隨著酶添加量的增加，酶分子與底物結(jié)合位點增多，反應(yīng)速度加快，當酶量趨于飽和時，繼續(xù)增加對米糠粉得率影響不大，結(jié)合成本考慮，選擇最適添加量為4.0%。而且從圖2中可以看出超臨界CO2條件下米糠粉得率高于常規(guī)酶法酶解米糠粉的得率。

2.3.3 酶解液pH對米糠粉得率的影響

在溫度55 ℃，酶添加量4.0%，pH不同的情況下，在磁力攪拌條件下分別進行超臨界和常壓酶解反應(yīng)，酶解時間為60 min，分別考察2個酶解反應(yīng)中pH對米糠粉得率的影響，實驗結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，米糠粉得率隨pH的增加呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，當酶解pH為8.0時，米糠粉得率最高。這是由于pH一般影響酶活性部位可影響基團、復(fù)合物及底物的離解，且酶在一定的pH范圍內(nèi)才有活性，超過一定的pH后，酶的空間結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變，以致使酶失活。只有在最適pH條件下活性最高，從而將底物最大程度的轉(zhuǎn)變?yōu)槊附猱a(chǎn)物，米糠粉得率最高，所以選擇酶解最適pH為8.0。且在超臨界CO2條件下米糠粉得率較高。

2.3.4 酶解溫度對米糠粉得率的影響

調(diào)節(jié)pH 8.0，酶添加量4.0%，在不同溫度條件下，在磁力攪拌條件下分別進行超臨界和常壓酶解反應(yīng)，酶解時間60 min，考察酶解溫度對米糠粉得率的影響，實驗結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，米糠粉得率隨著溫度的升高而逐漸增加，當酶解溫度55 ℃，米糠粉得率達到最高，隨后又逐漸下降。原因是在未達到最適溫度之前，溫度升高，酶分子與底物分子之間有效碰撞頻繁，致使酶分子與底物之間的結(jié)合速度加快，促進酶解反應(yīng)的進行，當溫度達到了酶的最適溫度時，最利于酶解反應(yīng)；超過了酶系的最適溫度，會使得維持酶自身結(jié)構(gòu)的次級鍵解體，酶的活性受到抑制甚至失活。所以選擇在超臨界CO2條件下酶解的最適溫度為55 ℃。

2.4 正交實驗優(yōu)化結(jié)果

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，已經(jīng)得出在超臨界CO2條件下米糠酶解時間短，酶解效率高，米糠粉得率高，所以在此只做超臨界CO2條件下以酶解時間、酶添加量、pH、酶解溫度作為考察因子，以米糠粉得率作為實驗指標，采用L16(45)正交實驗設(shè)計，如表1所示。

表1 正交實驗設(shè)計及結(jié)果

表2 正交實驗方差分析

注：*表示差異顯著(P<0.05)。

由方差結(jié)果可知，影響米糠粉得率的4個因素的主次順序為：酶添加量>酶解溫度>pH>酶解時間，酶解溫度和酶添加量對速溶米糠粉得率有顯著影響。最佳組合為A2B2C3D2，即酶解最佳工藝參數(shù)為酶解時間60 min，酶添加量4.0%，pH為8.0，酶解溫度55 ℃，在此條件下米糠粉得率為79.0%，比常規(guī)酶法生產(chǎn)米糠粉得率約提高了14.0%。

2.5 原料及米糠粉組分分析

原料及米糠粉組分分析結(jié)果如表3所示，所得米糠粉中主要營養(yǎng)成分為60.54%的可溶性總糖和15.28%的蛋白質(zhì)，脫脂米糠經(jīng)二次酶解反應(yīng)后有84.23%的蛋白質(zhì)被提取出來。經(jīng)超臨界CO2條件下復(fù)合酶解的米糠粉中NSI為93.28%，比原料脫脂米糠的NSI提高了51.53%。在80 ℃條件下，脫脂米糠粉僅有極少部分可以溶解，而經(jīng)過酶解處理后的米糠粉在4.26 s內(nèi)完全溶解，達到了速溶的標準，進一步證明米糠粉的溶解性得到了明顯改善[27]。米糠經(jīng)復(fù)合酶解后，大分子物質(zhì)被降解成小分子物質(zhì)，有利于其在水中分散，其可溶性糖和可溶性多肽氨基酸等的含量得以增加，易為人體消化吸收[28]，使得其溶解性增加，從而也改善了粉體的沖調(diào)性。

表3 原料及米糠粉組成成分及相關(guān)指標分析

3 結(jié)論

以低溫脫脂米糠為原料，先用植酸酶酶解低溫脫脂米糠，將難溶性的植酸鹽絡(luò)合物酶解后，把蛋白質(zhì)釋放出來，再利用堿性蛋白酶和α-淀粉酶酶解一次酶解后的脫脂米糠，使酶能夠在各自的最佳條件下酶解底物，同時由于超臨界流體的存在激發(fā)了酶的活性中心，使蛋白質(zhì)和淀粉更容易酶解成小分子物質(zhì)，所得米糠粉中主要營養(yǎng)成分為60.54%的可溶性總糖和15.28%的蛋白質(zhì)，酶解反應(yīng)時間較常規(guī)酶解反應(yīng)時間縮短了約10 min，酶的效率提高增加了米糠粉的得率，在酶添加量4.0%，酶解時間60 min，pH為8.0，酶解溫度55 ℃時，米糠粉得率為79.0%，脫脂米糠中84.23%的蛋白質(zhì)被提取出來，米糠粉中NSI值為93.28%，米糠粉溶解性增大，為生產(chǎn)高質(zhì)量的米糠蛋白提供借鑒，提高了米糠綜合利用的價值。

[1]SUNG-WOOK H,KYU-MAN C,SEONG-JUN C.Nutritional quality of rice bran protein in comparison to animal and vegetable protein[J].Food Chemistry,2015,172:766-769

[2]XIA N,WANG X Q,et al.Preparation and characterization of protein from heat-stabilized ricebran using hydrothermal cooking combined with amylase pretreatment[J].Journal of Food Engineering,2012,110(1):95-101

[3]HELM R M,BURKS A W.Hypoallergenicity of rice bran protein[J].Cereal Foods World,1996(41):938-843

[4]SHOJI Y,MITA T,ISEMURA M,et al.A fibronectin-binding protein from rice bran with cell adhesion activity for animal tumor cells[J].Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,2001,65(5):1181-1186

[5]THUTIYAPORN C,ATHAPOL N.Ultrasonic assisted alkali extraction of protein from defatted rice bran and properties of the protein concentrates[J].International Journal of Food Science & Technology,2009,49(9):1843-1849

[6]鄭煜焱,曾潔,李晶,等.米糠蛋白的組成及功能性[J].食品科學,2012,(23):143-149

ZHENG Y Y,ZENG J,LI J,et al.The composition and function of rice bran protein[J].Food Science,2012,(23):143-149

[7]池愛平,陳錦屏,張海生,等.脫脂米糠酶法水解制備米糠營養(yǎng)素工藝研究[J].食品科學,2006,27(12):339-343

CHI A P,CHEN J P,ZHANG H S,et al.Study on preparation of rice bran nutrient by enzymatic hydrolysis ofdefatted rice[J].Food Science,2006,27(12):339-343

[8]KAXUHIRO Y,YOSHIYUKI W,KAZUNORI Y.Suppressive effect of defatted rice bran on the oxidation of methyl linoleate[J].Food Chemistry,2010,123(4):1132-1135

[9]FABIAN C,JU Y H.A review on ricebran protein:its properties andextraction methods[J].Critical Reviews Food Science Nutrition,2011,51(9):816-827

[10]ISLAM M S,NAGASAKA R,OHARA K,et al.Biological abilities ofrice bran-derived antioxidant phytochemicals for medical therapy[J].Current Topics in Medicinal Chemistry,2011,11(14):1847-1853

[11]KUMA R V,SINBA A K,MAKKAR H P,et al.Phytate and phytase in fish nutrition[J].Anim Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition,2012,96(3):335-364

[12]IMEHU,KHOKHARS.Distribution of conjugated and free phenols in fruits:antioxidant activity and cultivar variations[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2002,50(22):6301-6306

[13]李新華,富艷鑫,鄭煜焱.米糠蛋白提取工藝條件的優(yōu)化[J].食品科學,2010,22:251-254

LI X H,FU Y X,ZHENG Y Y.Optimization of extraction conditions of rice bran protein[J].Food Science,2010,22:251-254

[14]LAMSAL B P,JUNG S,JOHNSON L A.Rheological properties of soyprotein hydrolysates obtained from limited enzymatic hydrolysis[J].LWT-Food Science and Technology,2007,40(7):1215-1223

[15]白莉,楊忠亮,接偉光.米糠蛋白提取工藝優(yōu)化及分離純化[J].食品科技,2010(5):173-176

BAI L,YANG Z L,JIE W G.Optimization and separation and purification of rice bran protein extraction technology[J].Food Science and Technology,2010(5):173-176

[16]王雪飛,于國萍,徐紅華.不同酶類提取米糠蛋白的研究[J].中國糧油學報,2004,19(1):8-11

WANG X F,YU G P,XU H H.Studies on extraction of rice bran by different enzymes[J].Journal of the Chinese Cereals and Oils Association,2004,19(1):8-11

[17]李坤,劉穎,竇博鑫.米糠蛋白提取中褐變抑制劑的篩選[J].食品工業(yè)科技,2012(2):218-223

LI K,LIU Y,DOU B X.Screening of browning inhibitors in rice bran protein extraction[J].Food Industry Technology,2012(2):218-223

[18]董海洲,萬本屹,劉傳富,等.葡萄籽油超臨界二氧化碳萃取最佳工藝參數(shù)及其理化特性的研究[J].中國糧油學報,2004,19(5):55-58

DONG H Z,WAN B Y,LIU C F,et al.Study on optimum technological parameters and physicochemical properties of grape seed oil by supercritical carbon dioxide extraction[J].Journal of the Chinese Cereals and Oils Association,2004,19(5):55-58

[19]廖傳華,黃振仁.超臨界流體萃取技術(shù)[M].北京:化學工業(yè)出版社,2004:101-115

LIAO C H,HUANG Z R.Supercritical fluid extraction technology[M].Beijing:Chemical Industry Press,2004:101-115

[20]FATEMEH B,SEYYED M,GHOREISHI.Response surface optimization of supercritical CO2extraction of α-tocopherol from gel and skin of Aloe vera and almond leaves[J].The Journal of Supercritical Fluids,2014,95:348-354

[21]SHIH F F,CHAMPAGEN E T,DAIGLE K,et al.Use of enzymes in the processing of protein products from rice bran and rice flour[J].Food/Nahrung,1999,43(1):14-18

[22]李欣,陳威,何敏.熱激處理和檸檬酸提高發(fā)芽糙米中植酸酶活性[J].食品工業(yè)科技,2014,35(8):202-209

LI X,CHEN W,HE M.Heat shock treatment and citric acid to improve phytase activity in germinated brown rice[J].Food Science and Technology,2014,35(8):202-209

[23]WANG M,HETTIARACHCHY N S,QI M,et al.Preparation and Functional Properties of Rice Bran Protein Isolate[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,1999,47(2):411-416

[24]王雪飛.酶法制備米糠分離蛋白的研究[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學,2003

WANG X F.Study on enzymatic preparation of rice bran protein isolate[D].Haerbin:Northeast Agricultural University,2003

[25]郭金龍,陳有君,孫國琴,等.苯酚-硫酸法測定杏鮑菇多糖方法的研究[J].食品科學,2008,29(12):555-558

GUO J L,CHEN Y J,SUN G Q,et al.Study on the determination of polysaccharidesfrompleurotus eryngii by phenol-sulfuric acid method[J].Food Science,2008,29(12):555-558

[26]劉曉毅.精制核桃粉加工工藝的研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)大學,2000,32

LIU X Y.Study on processing technology of refined walnut powder[D].Beijing:China Agricultural University,2000,32

[27]KORHONEN H,PIHLANTO A.Food-derived BioactivePeptides-Opportunities for Designing Future Foods[J].Current Pharmaceutical Design,2003,16(9):1297-1308

[28]PRAKASH J.Rice bran protein:properties and food uses[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition,1996,36(6):537-552.