曹 瑩，姚 祥，陳水紅，李春杰

(草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室 農(nóng)業(yè)部草牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020)

禾草內(nèi)生真菌[Epichlo? endophytes(Clavicipitaceae,Hypocreales,Ascomycota)]是指在禾草體內(nèi)渡過全部或大部分生命周期，而不引致禾草外部癥狀的一大類真菌[1]。內(nèi)生真菌與禾草共生，一方面可提高禾草抗逆性，例如，抗旱[2-3]、耐鹽[4-6]、抗寒[7-8]等；另一方面產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物，合成生物堿，使草食動物中毒，影響家畜健康，例如，黑麥草(Loliumperenne)內(nèi)生真菌引起的新西蘭綿羊的蹣跚病[9]、醉馬草(Achnatheruminebrians)內(nèi)生真菌引起的家畜中毒癥[2,10]等。因此，禾草內(nèi)生真菌共生體對草地生態(tài)系統(tǒng)有重要的影響。

野大麥(Hordeumbrevisubulatum)是禾本科大麥屬的一種多年生優(yōu)良牧草，廣泛分布于中國北方鹽漬草甸，其質(zhì)地柔軟、多分蘗、產(chǎn)量高和適口性好，而且耐旱、耐鹽堿等，對環(huán)境有較強的適應(yīng)性[11-12]。調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，生長于甘肅河西走廊鹽堿地的野大麥內(nèi)生真菌帶菌率高達(dá)100%[13]。陳泰祥等[14]已對野大麥內(nèi)生真菌的生物學(xué)與生理學(xué)特性進(jìn)行了研究，目前有關(guān)內(nèi)生真菌提高野大麥抗性的研究主要表現(xiàn)在抗蟲性[15]、耐澇性[16]、耐鹽性[5,17]、抗旱性[18]等方面。

為了更好地闡明內(nèi)生真菌禾草共生體的互作關(guān)系，建立不帶菌種群顯得尤為重要。目前，已有的去除內(nèi)生真菌的方法為高溫、高濕法[2，19-24]和殺菌劑法[25-27]，但高溫、高濕法會不可避免地對宿主植物活力造成不同程度的影響[28]。相比之下，殺菌劑的除菌效果較好，但高濃度的殺菌劑也會對種子及幼苗造成一定的傷害[1]。據(jù)前人報道甲基托布津稀釋500倍液浸泡中華羊茅(Festucasinensis)種子8 h具有顯著殺菌效果而不影響種子萌發(fā)，是剔除中華羊茅種傳內(nèi)生真菌的有效方法[25]；甲基托布津稀釋500倍液浸泡披堿草(Elymusdahuricus)種子6～10 h，殺菌效果較好，可有效去除披堿草種傳內(nèi)生真菌[27]。但關(guān)于去除野大麥內(nèi)生真菌的研究未見報道，近年來，對野大麥內(nèi)生真菌共生體已開展了大量的研究工作，保證E+、E-植株相同的生態(tài)背景在研究內(nèi)生真菌提高宿主抗逆性等方面的影響顯得至關(guān)重要，有效去除野大麥內(nèi)生真菌可消除或減小不同生態(tài)地位帶來的誤差。因此，本研究在此基礎(chǔ)上使用甲基托布津?qū)σ按篼渻?nèi)生真菌共生體種子進(jìn)行處理，探究該處理條件對野大麥內(nèi)生真菌共生體的生長及生理生化的影響，旨在驗證甲基托布津稀釋500倍液浸種8 h是否對禾本科牧草野大麥的內(nèi)生真菌剔除同樣有效，為探究該處理濃度和處理時間對剔除禾本科牧草種傳內(nèi)生真菌是否具有普適性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所需的植物材料野大麥種子，2014年9月采于甘肅臨澤(100°06′ E， 39°11′ N，海拔1 453 m)，參照李春杰等[29]的方法檢測種子帶菌率為98%，種子保存于4 ℃冰箱待用。內(nèi)吸性殺菌劑為有效成分為70%的甲基托布津，購買于甘肅種子市場大地農(nóng)藥店。

1.2 試驗方法

1.2.1甲基托布津?qū)σ按篼渻?nèi)生真菌共生體的處理 設(shè)置甲基托布津稀釋500倍液浸種8 h為處理組，以蒸餾水浸種8 h為對照組，在浸泡8 h結(jié)束后，用蒸餾水洗去表面殘留殺菌劑，播種于裝有800 g經(jīng)過高溫滅菌的營養(yǎng)土和黃土(1∶1混勻)的花盆(直徑14 cm，高10 cm)中，處理組和對照組各種20盆，每盆播種5粒種子，置于蘭州大學(xué)榆中智能溫室進(jìn)行發(fā)芽。共計40盆。

1.2.2各項指標(biāo)的測定方法 待種子開始發(fā)芽后，進(jìn)行出苗率指標(biāo)統(tǒng)計，待種子出苗6周后進(jìn)行帶菌率檢測[29]。出苗60 d后，每隔10 d進(jìn)行一次株高和分蘗的形態(tài)學(xué)生長指標(biāo)統(tǒng)計，連續(xù)統(tǒng)計4次。出苗100 d后參照李合生[30]的方法進(jìn)行葉綠素含量、丙二醛含量、脯氨酸含量、過氧化氫酶活性、過氧化物酶活性、超氧化物歧化酶活性的測定；植物有機碳含量采用鉻酸氧還滴定法[31]、植物全氮含量采用全自動凱氏定氮儀進(jìn)行測定(Kjeltec 2300 Auto System Ⅱ,Foss Teactor AB,Sweden)、植物全磷含量采用鉬藍(lán)比色法[32]。

1.2.3統(tǒng)計分析 將試驗所得數(shù)據(jù)用 Microsoft Excel 2007錄入并進(jìn)行常規(guī)計算、分析、作圖，采用SPSS 12.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，單因素采用ANOVA分析，雙因素采用常規(guī)線性模型單變量分析。

2 結(jié)果

2.1 甲基托布津?qū)σ按篼渻?nèi)生真菌共生體出苗率、帶菌率及其生長的影響

與對照相比，經(jīng)殺菌劑處理過的野大麥出苗率顯著降低(P<0.05)，從85%降至72%。經(jīng)殺菌劑處理后的野大麥帶菌率大幅降低，從100%降至12%，差異顯著(P<0.05)(圖1)。

對野大麥處理組和對照組進(jìn)行株高的動態(tài)測量，每一次株高測量組間均出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)。結(jié)果顯示，該殺菌劑處理可降低野大麥的株高，出苗60、70、80、90和100 d時殺菌劑處理組的株高分別低于對照4.17、3.49、3.77、3.83和3.49 cm，且差異顯著(P<0.05)。隨著時間的延長，對照組組內(nèi)株高沒有顯著變化，處理組出苗80 d后組內(nèi)株高不再顯著增長(P>0.05)(圖2)。

圖1 500倍甲基托布津處理對野大麥的出苗率和帶菌率影響Fig. 1 Effect of 500× diluted mildothane treatment on the emergence and carrier rates of wild barley

對照組代表未經(jīng)殺菌劑處理的野大麥，處理組代表殺菌劑處理后的野大麥。不同小寫字母表示同一指標(biāo)對照組與處理組的組間差異顯著(P<0.05)。圖4同。

The control group comprised wild barley untreated with fungicide, and the treatment group comprised wild barley treated with fungicide. Different lowercase letters indicate significant difference in the same index between the control and treatment groups at the 0.05 level; similarly for Fig. 4.

對照組與處理組的分蘗在出苗70、80和100 d時組間出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，60和90 d未出現(xiàn)顯著差異(P>0.05)。組內(nèi)隨時間延長產(chǎn)生顯著差異(P<0.05)，但處理80 d后組內(nèi)分蘗未出現(xiàn)顯著差異(P>0.05)(圖3)。

經(jīng)統(tǒng)計分析，內(nèi)生真菌處理對株高影響顯著(P<0.05)，但是不同測量時間對株高影響不顯著(P>0.05)，二者互作對株高無顯著影響(P>0.05)；內(nèi)生真菌處理和不同測量時間均對分蘗影響顯著(P<0.05)，但是二者互作對分蘗無顯著影響(P>0.05)(表1)。

2.2 甲基托布津?qū)σ按篼渻?nèi)生真菌共生體生理指標(biāo)的影響

經(jīng)殺菌劑處理后，野大麥的對照組和處理組之間的葉綠素a和葉綠素b含量均值接近，未出現(xiàn)顯著差異(P>0.05)，處理組植株中類胡蘿卜素含量均值略高于對照組(P>0.05)。野大麥的處理組植株中丙二醛含量略高于對照組中的含量(P>0.05)。對照組和處理組的野大麥中脯氨酸含量之間沒有顯著差異(P>0.05)。野大麥對照組植株中CAT酶活性略高于處理組(P>0.05)。對照組野大麥中過氧化物酶活性稍高于處理組(P>0.05)。野大麥對照組和處理組之間超氧化物歧化酶活性無顯著差異(P>0.05)(表2)。

圖2 500 倍甲基托布津處理對野大麥株高的影響Fig. 2 Effects of 500× diluted mildothane treatment on the height of wild barley

對照組代表未經(jīng)殺菌劑處理的野大麥，處理組代表殺菌劑處理后的野大麥。*表示對照組與處理組的組間差異顯著(P<0.05)，不同小寫字母表示處理組或?qū)φ战M內(nèi)不同出苗天數(shù)間差異顯著(P<0.05)。圖3同。

The control group comprised wild barley untreated with fungicide, and the treatment group comprised wild barley treated with fungicide. * indicate significant difference between the control and treatment groups at the 0.05 level, and different lowercase letters indicate significant difference between different days after emergenc in the same group at the 0.05 level; similarly for Fig. 3.

圖3 500 倍甲基托布津處理對野大麥分蘗的影響Fig. 3 Effect of 500× diluted mildothane treatment on the wild barley tiller number

變異來源Variationsource株高PlantheightdfFP分蘗TillernumberdfFPT45．6370．06147．2500．041E1883．3230．000117．0530．015T×E40．0800．98840．6200．650

T：時間；E：內(nèi)生真菌；T×E：時間×內(nèi)生真菌。

T: time; E: endophytic fungi; T × E: time×endophytic fungi.

表2 500倍甲基托布津處理對野大麥內(nèi)生真菌共生體理指標(biāo)的影響Table 2 Effects of 500× diluted mildothane treatment on the physiological indexes of Hordeum brevisubulatum-Epichlo? bromicola symbionts

對照組代表未經(jīng)殺菌劑處理的野大麥，處理組代表殺菌劑處理后的野大麥。

The control group comprised wild barley untreated with fungicide, and the treatment group comprised wild barley treated with fungicid.

2.3 甲基托布津?qū)σ按篼渻?nèi)生真菌共生體營養(yǎng)元素指標(biāo)的影響

經(jīng)稀釋500倍的甲基托布津殺菌處理后，野大麥對照組植株中的全碳、全氮和全磷含量均顯著高于野大麥處理組植株中的含量(P<0.05)，與對照組相比，野大麥處理組植株中C、N和P的含量依次降低4.87%、10.99%、13.50%(圖4)。

3 討論與結(jié)論

本研究探討了殺菌劑甲基托布津?qū)σ按篼渻?nèi)生真菌的殺菌效果及對野大麥內(nèi)生真菌共生體的生長及生理生化的影響。目前，國內(nèi)外學(xué)者利用殺菌劑去除禾草內(nèi)生真菌，姚祥等[25]對兩種內(nèi)吸性殺菌劑在不同濃度和時間處理下對中華羊茅種傳內(nèi)生真菌的影響進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)不同稀釋倍數(shù)的殺菌劑對中華羊茅種傳內(nèi)生真菌有不同的效果；李娜娜等[26]進(jìn)行了甲基托布津?qū)ψ眈R草種傳內(nèi)生真菌滅菌活性及種子萌發(fā)和幼苗生長影響的研究，結(jié)果表明，不同稀釋濃度的甲基托布津?qū)ψ眈R草種傳內(nèi)生真菌產(chǎn)生的效果不同；張蕊思[27]研究了殺菌劑對披堿草種子內(nèi)生真菌的殺菌效果及種子活力的影響發(fā)現(xiàn)，甲基托布津稀釋500倍液浸泡種子6～10 h殺菌效果較好；眾多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，用內(nèi)吸性殺菌劑對多年生黑麥草內(nèi)生真菌進(jìn)行殺菌處理，殺菌效果顯著[33-35]。禾草內(nèi)生真菌具有較強的宿主特異性，而不同共生體之間禾草內(nèi)生真菌的定殖、生長特性差異較大[36]。內(nèi)生真菌侵染野大麥并與之形成特異性較強的野大麥-內(nèi)生真菌互惠共生體，有關(guān)殺菌劑對野大麥內(nèi)生真菌殺菌的研究還未見報道。

圖4 500 倍甲基托布津處理對野大麥全碳、全氮和全磷含量的影響Fig. 4 Effect of 500× diluted mildothane treatment on C, N, and P content of wild barley

本研究以殺菌劑甲基托布津為材料，其作用機理主要是干擾真菌的有絲分裂中紡錘體的形成，影響細(xì)胞分裂，起到殺菌作用。作為內(nèi)吸性殺菌劑，其性價比高，對人、畜和植物都很安全[37]。500倍的甲基托布津可使中華羊茅的帶菌率從98%降低到10%，該稀釋濃度對中華羊茅處理后，發(fā)芽率、株高和分蘗指標(biāo)在處理前后無顯著差異[25]。甲基托布津濃度為500倍稀釋液時，披堿草種子帶菌率為12%左右，此時滅菌效果要優(yōu)于其他處理濃度組[27]。本研究與其結(jié)果相似，用500倍甲基托布津處理后，與對照相比，經(jīng)殺菌劑處理后的野大麥帶菌率從100%降至12%，差異顯著(P<0.05)。

本研究使用甲基托布津?qū)σ按篼渻?nèi)生真菌共生體種子進(jìn)行處理，探究在該條件下對野大麥內(nèi)生真菌共生體生長及生理生化的影響。結(jié)果表明，500倍的甲基托布津處理降低了野大麥的株高、分蘗，但隨著時間延長，殺菌劑處理種子出苗80 d后組內(nèi)株高、分蘗均未出現(xiàn)顯著差異(P>0.05)。Harvey等[34]發(fā)現(xiàn)，使用殺菌劑丙環(huán)唑?qū)邴湶莘N子進(jìn)行殺菌處理時，短時期內(nèi)種子新長出的幼苗的高度受到抑制，但這種負(fù)作用在植株生長后期逐漸消失，這與本研究結(jié)果較為相似。Siegel等[20]認(rèn)為，許多化學(xué)農(nóng)藥不能完全殺死高羊茅(Festucaarundinacea)植株體內(nèi)或種子中的內(nèi)生真菌，或者具有真菌毒性作用的同時也對植物有毒害作用。朱丹青等[38]發(fā)現(xiàn)葉面施用多效唑?qū)μ锲?Panaxnotoginseng)苗期的生理變化存在顯著的影響，顯著提高了葉綠素含量、增強了苯丙氨酸解氨酶活性、升高了總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，丙二醛含量變化不明顯，總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，而這些生理變化都會轉(zhuǎn)而影響到植物生長的變化。吳學(xué)宏等[39]研究發(fā)現(xiàn)，用2.5%咯菌腈包衣處理西瓜(Citrulluslanatus)種子，植物體內(nèi)丙二醛含量下降，蛋白質(zhì)含量增加，并且與對照相比，過氧化氫酶、過氧化物酶活性顯著提高。但是，眾多研究表明，適宜劑量殺菌劑處理種子后對部分種子幼苗的生長是安全的，不會影響植物正常的生理活動[40-41]。本研究發(fā)現(xiàn)，用500倍甲基托布津處理后對植株葉綠素含量、丙二醛含量、脯氨酸含量、過氧化氫酶活性、過氧化物酶活性和超氧化物酶活性均未產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)。殺菌劑處理對野大麥的各種生理抗性指標(biāo)未造成顯著影響，說明該計量殺菌劑處理種子后對植物的生長是安全的，本身未產(chǎn)生脅迫，沒有對其正常的生理活動造成影響。500倍甲基托布津處理后其營養(yǎng)指標(biāo)C、N和P水平與對照相比顯著降低(P<0.05)。分析其原因可能是內(nèi)生真菌在植株體內(nèi)因代謝活動的需要而增強了共生體的整體代謝水平，從而增加了共生體對營養(yǎng)元素的吸收和代謝，使共生體得到了更好的生長而具有更好的營養(yǎng)指標(biāo)。

本研究發(fā)現(xiàn)，使用70%甲基托布津稀釋500倍浸泡野大麥種子8 h的除菌效果良好，且殺菌劑處理對野大麥的生理抗性指標(biāo)未產(chǎn)生顯著影響。同時，有研究表明70%甲基托布津作為一種高效低毒的廣譜內(nèi)吸性殺菌劑，具有保護(hù)和治療作用[42]。因此，其在生產(chǎn)中使用具有一定優(yōu)勢。

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