符 杰，胡延春，陳偉紅，翁嘉華，胡力文，石 真，何亞軍，莫 全，王 婭，任志華，彭廣能，左之才，鄧俊良

(動(dòng)物疫病與人類健康四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境公害與動(dòng)物疾病四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 溫江 611130)

紫莖澤蘭(Eupatoriumadenophorum)又名解放草、破壞草[1]等，是菊科澤蘭屬多年生草本植物。紫莖澤蘭因其具有強(qiáng)大的生態(tài)適應(yīng)性和入侵性，可通過(guò)釋放化感物質(zhì)影響土壤微環(huán)境，從而抑制其他植物的生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致本土物種的消失[2]。經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，紫莖澤蘭現(xiàn)已是我國(guó)排在首位的外來(lái)入侵物種，且在四川、重慶、廣西、貴州等地危害最為嚴(yán)重[3]。紫莖澤蘭作為世界性毒草，不僅侵占草地，造成山林退化，而且給畜牧業(yè)特別是草地畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重?fù)p失[4]。在飼草匱乏的季節(jié)，日常的放牧或者喂食中，如果家畜誤食紫莖澤蘭或者含有紫莖澤蘭的飼料，會(huì)導(dǎo)致牛、羊等其他家畜接觸性皮炎[5]，有的患畜會(huì)出現(xiàn)精神消沉、腹瀉、脫毛、消瘦、肌肉發(fā)生震顫或者強(qiáng)直性痙攣[6]、肝臟損傷[7-10]等相應(yīng)的中毒癥狀及病理變化。而且，紫莖澤蘭的花粉和種子還能誘發(fā)馬屬動(dòng)物過(guò)敏性支氣管炎[11]。因此，紫莖澤蘭不僅會(huì)造成當(dāng)?shù)刂参餅?zāi)難性的破壞，同時(shí)也給畜牧業(yè)帶來(lái)較為嚴(yán)重的損失。

國(guó)內(nèi)外對(duì)紫莖澤蘭引起反芻動(dòng)物中毒的毒性作用還未進(jìn)行系統(tǒng)研究，對(duì)薩能奶山羊(Saanen goat)血常規(guī)及主要實(shí)質(zhì)器官的病理學(xué)影響研究也未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道。本研究探討紫莖澤蘭對(duì)薩能奶山羊血常規(guī)及肝、脾、腎等臟器病理學(xué)的影響，旨為進(jìn)一步研究反芻動(dòng)物紫莖澤蘭中毒機(jī)理及紫莖澤蘭防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇體重相近、體格健康、5～6月齡的薩能奶山羊16只、公母各半，隨機(jī)分成公母各半的對(duì)照組及試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組，每組4只；有研究表明，脫毒的紫莖澤蘭可作為飼料代替小麥麩[12]，且根據(jù)韓龍等[13]與周自瑋等[14]的研究結(jié)果，將山羊日糧與添加料設(shè)為20%∶80%(表1)，對(duì)照組動(dòng)物采食基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組動(dòng)物每天分別飼喂添加自然風(fēng)干后用粉碎機(jī)粉碎，未脫毒的紫莖澤蘭粉(采自四川省涼山州西昌市黃聯(lián)關(guān)鎮(zhèn))的日糧。試驗(yàn)于2014年4月12日至2014年7月29日在四川省成都市溫江區(qū)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)進(jìn)行。試驗(yàn)預(yù)試期2周，正試期12周。

1.2 飼養(yǎng)管理

16只試驗(yàn)?zāi)躺窖蜻M(jìn)行常規(guī)免疫及驅(qū)蟲(chóng)后集中飼養(yǎng)于已消毒的養(yǎng)殖場(chǎng)地，統(tǒng)一飼養(yǎng)管理。每天分別在09:00和17:00各飼喂一次，飼喂期間不限采食和飲水。每只每次投喂0.5 kg試驗(yàn)飼料，共計(jì)1 kg·d-1，定量飼喂。每天對(duì)羊圈進(jìn)行清掃，保持其干燥清潔。按照薩能奶山羊地方飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)選購(gòu)山羊日糧飼料(日糧飼料原料為風(fēng)干狀態(tài))，試驗(yàn)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平如表2所列。

表1 試驗(yàn)飼料配比Table 1 Ratios of experimental feed

表2 試驗(yàn)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平Table 2 Composition and nutrient levels of the experimental diet

1.3 血液生理指標(biāo)的測(cè)定

試驗(yàn)期每隔14 d，于晨后對(duì)每組薩能奶山羊進(jìn)行空腹頸靜脈采血2 mL，用真空(肝素鈉)抗凝管進(jìn)行抗凝，分別采用試管稀釋法，sahli比色法以及硝基四唑氮藍(lán)(NBT)還原法測(cè)定血液中的白細(xì)胞(WBC)、血紅蛋白(HGB)及中性粒細(xì)胞(NEUT)含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)Excel初步處理后，利用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件One-way ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著時(shí)采用Duncan法進(jìn)行多重比較，試驗(yàn)結(jié)果以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)并標(biāo)以顯著水平表示。

1.5 組織病理學(xué)觀察

將全部薩能奶山羊進(jìn)行頸靜脈放血處死，進(jìn)行解剖檢查，觀察組織器官有無(wú)明顯的病理變化。將采集的對(duì)照組與試驗(yàn)組奶山羊的肝、脾、腎經(jīng)4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，甲苯透明，石蠟包埋，5 μm切片，HE常規(guī)染色后，于光鏡下觀察并記錄其組織學(xué)變化。最后,將飼喂不同紫莖澤蘭比例的試驗(yàn)組和對(duì)照組進(jìn)行觀察比較，并記錄觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)薩能奶山羊血常規(guī)的影響

2.1.1白細(xì)胞(WBC)變化 試驗(yàn)Ⅰ組在試驗(yàn)56與84 d時(shí)白細(xì)胞數(shù)極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，于70 d時(shí)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(表3)。試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組血液中白細(xì)胞數(shù)目均在試驗(yàn)42 d顯時(shí)著高于對(duì)照組(P<0.05)，且從試驗(yàn)56 d開(kāi)始到84 d，試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。

2.1.2淋巴細(xì)胞(LY)變化 試驗(yàn)Ⅰ組56 d至70 d顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，且在試驗(yàn)84 d時(shí)極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)(表4)。試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組血液中LY數(shù)目均于試驗(yàn)42 d時(shí)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，當(dāng)試驗(yàn)從56 d進(jìn)行到84 d，試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組表現(xiàn)為極顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

表3 各組薩能奶山羊血液中白細(xì)胞(WBC)的變化Table 3 Changes in white blood cell count for each group

同行中的*和**分別表示試驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著(P<0.05 )和極顯著(P<0.01 )。表4、表5和表6同。

* and ** within the same row indicate significant difference between control group and treatment group at 0.01 and 0.05 level, respectively; this applies to Table 4, Table 5, and Table 6.

表4 各組薩能奶山羊血液中淋巴細(xì)胞(LY)的變化Table 4 Changes in LY for each group

2.1.3中性粒細(xì)胞(NEUT)變化 整個(gè)試驗(yàn)階段，試驗(yàn)Ⅰ組在試驗(yàn)56 d時(shí)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(表5)。在試驗(yàn)84 d時(shí)，試驗(yàn)Ⅰ組NEUT數(shù)目極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組血液中NEUT數(shù)目均在試驗(yàn)42 d時(shí)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，分別于試驗(yàn)70 d、56 d至試驗(yàn)結(jié)束NEUT數(shù)目極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。

2.1.4血紅蛋白(HGB)含量變化 試驗(yàn)Ⅰ組在試驗(yàn)56 d到70 d顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，在試驗(yàn)84 d時(shí)極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)(表6)。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組在試驗(yàn)28 d時(shí)均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而且均從試驗(yàn)42 d到84 d極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。

2.2 對(duì)主要臟器的病理學(xué)影響

2.2.1肝臟 各試驗(yàn)組山羊肝臟隨紫莖澤蘭飼喂劑量增加而色澤變淡，表面有褐色斑點(diǎn)，并未見(jiàn)明顯出血點(diǎn)。在試驗(yàn)組Ⅰ中，肝細(xì)胞明顯腫脹，部分肝細(xì)胞溶解、壞死，肝索排列紊亂，肝竇狹窄甚至閉鎖，部分肝竇淤血。試驗(yàn)組Ⅱ中，肝細(xì)胞主要為水泡變性。試驗(yàn)組Ⅲ中，肝細(xì)胞脂肪變性，部分發(fā)生凝固性壞死，并伴有中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1)。由此可見(jiàn)，隨著試驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)，各試驗(yàn)組肝臟病變?cè)桨l(fā)嚴(yán)重。

表5 各組薩能奶山羊血液中性粒細(xì)胞(NEUT)的變化Table 5 Changes in NEUT for each group

表6 紫莖澤蘭對(duì)奶山羊血紅蛋白(HGB)的影響Table 6 Effect of Eupatorium adenophorum on HGB in Saanen goat

圖1 各組薩能奶山羊肝臟病理變化Fig. 1 Histopathological changes in the liver for each group of Saanen goats

A：對(duì)照組肝細(xì)胞，×400，HE；B：①肝細(xì)胞腫脹明顯，②肝細(xì)胞溶解、壞死，肝索排列紊亂，③肝竇狹窄閉鎖，肝竇淤血，×400，HE；C：肝細(xì)胞水泡變性，×400，HE；D：④肝細(xì)胞凝固性壞死，⑤脂肪變性，⑥中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，×400，HE。

A：Liver cells of control, ×400, HE; B: ①Some hepatic cells are tumid, ②dissolved and necrotic, ③the hepatic cords is narrow, blocked and congested in Trial Ⅰ, ×400, HE; C: Vacuolar degeneration of liver cells in Trial Ⅱ, ×400, HE; D: ④Coagulation necrosis, ⑤steatosis and ⑥neutrophil infiltration of liver cells in Trial Ⅲ, ×400, HE.

2.2.2脾臟 與對(duì)照組相比，各試驗(yàn)組有脾臟輕度腫大，被膜增厚，色澤變淡的現(xiàn)象。各試驗(yàn)組均出現(xiàn)脾組織嚴(yán)重充血，紅髓區(qū)充血。試驗(yàn)組Ⅰ還伴有淋巴細(xì)胞減少的現(xiàn)象。試驗(yàn)組Ⅱ紅髓區(qū)且噬細(xì)胞數(shù)量增多，試驗(yàn)組Ⅲ則出現(xiàn)含鐵血黃素增多(圖2)。由此可見(jiàn)，隨著試驗(yàn)時(shí)間延長(zhǎng)，各試驗(yàn)組脾臟病變?cè)桨l(fā)嚴(yán)重。

2.2.3腎臟 各試驗(yàn)組腎臟均出現(xiàn)不同程度腫大，質(zhì)地變?nèi)?，被膜緊張。組織切片可觀察到試驗(yàn)組Ⅰ中腎小管發(fā)生充血，腎小管上皮細(xì)胞腫脹。試驗(yàn)組Ⅱ中間質(zhì)小靜脈和毛細(xì)血管擴(kuò)張淤血，腎組織伴有顆粒變性和水泡變性的現(xiàn)象。試驗(yàn)組Ⅲ中腎小球細(xì)胞淤血，間質(zhì)淤血，部分腎小管上皮細(xì)胞壞死(圖3)。

圖2 各組薩能奶山羊脾臟病理變化Fig. 2 Histopathological changes in the spleen for each group of Saanen goats

A：對(duì)照組為正常脾組織×400，HE；B：試驗(yàn)組Ⅰ中①紅髓區(qū)充血，②淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，×400，HE ；C：試驗(yàn)組Ⅱ中③脾組織嚴(yán)重出血，④紅髓區(qū)巨噬細(xì)胞數(shù)量增多，×400，HE；D：試驗(yàn)組Ⅲ中⑤紅髓區(qū)充血，⑥含鐵血黃素增多，×400，HE。

A: Spleen of control ×400, HE; B: ①Congestion of the red pulp, ②lymphocytes decreased in TrialⅠ， ×400, HE; C: ③The splenic tissue was bleeding and ④macrophages increased in the red pulp in TrialⅡ， ×400, HE; D: ⑤Congestion of the red pulp, ⑥hemosiderin increased in spleen in Trial Ⅲ×400, HE.

圖3 各組薩能奶山羊腎臟病理變化Fig. 3 Histopathological changes in the kidney for each group of Saanen goats

A：對(duì)照組腎組織，×400，HE；B：①腎小管充血，②腎小管上皮細(xì)胞腫脹，×400，HE；C：③間質(zhì)小靜脈，④毛細(xì)血管淤血，⑤腎小管上皮細(xì)胞水泡變性，×400，HE；D：⑥腎小球細(xì)胞淤血，⑦間質(zhì)淤血，⑧腎小管上皮細(xì)胞壞死，×400，HE。

A:Kidney of control, ×400, HE; B: ①The renal tubules were congested and ②the renal tubular epithelial cells swelled, ×400, HE; C: ③Stromal venules and ④capillaries congestion, ⑤vacuolar degeneration of renal tubular epithelial cells, ×400, HE; D: ⑥Glomerular cell and ⑦stromal congestion, ⑧necrosis of renal tubular epithelial cells, ×400, HE.

3 討論與結(jié)論

四川涼山彝族自治州是紫莖澤蘭重災(zāi)區(qū)之一，紫莖澤蘭的瘋狂傳播生長(zhǎng)致使涼山的絕大部分山林田地以及牧場(chǎng)被侵占，牲畜被迫采食而中毒的事件也屢屢發(fā)生，給牧民造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。研究表明，紫莖澤蘭全草所含有的有毒成分主要包括9-羰基-10,11-去氫澤蘭酮(Euptox A)、佩蘭毒素、香豆精、鞣質(zhì)，還有生物堿類等[15]，其中分離到的Euptox A對(duì)牲畜有劇毒，它是導(dǎo)致肝損傷的主要毒素[16-19],也會(huì)造成動(dòng)物的其他器官和組織的毒性損傷，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致動(dòng)物死亡。

本研究通過(guò)給予對(duì)照組奶山羊飼喂全價(jià)飼料，試驗(yàn)組Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別飼喂40%(0.4 kg·d-1)、60%(0.6 kg·d-1)、80%(0.8 kg·d-1)劑量紫莖澤蘭日糧，結(jié)果表明，各試驗(yàn)組的LY值于試驗(yàn)后期均極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，NEUT顯著升高(P<0.05)，后期極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。這說(shuō)明不同劑量的紫莖澤蘭均可能對(duì)薩能奶山羊機(jī)體免疫系統(tǒng)造成影響。試驗(yàn)動(dòng)物采食紫莖澤蘭中毒后，其機(jī)體免疫能力下降，導(dǎo)致機(jī)體易受致病菌等的入侵而引發(fā)各種炎癥反應(yīng)。通過(guò)比較各試驗(yàn)組值可以看出，紫莖澤蘭能顯著引起薩能奶山羊WBC值升高，而且存在明顯時(shí)間和劑量效應(yīng)，紫莖澤蘭添加量越高、飼喂時(shí)間越長(zhǎng)，白細(xì)胞值越高，試驗(yàn)組Ⅲ最為明顯，說(shuō)明當(dāng)長(zhǎng)期采食紫莖澤蘭可引起薩能奶山羊機(jī)體持續(xù)性炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致白細(xì)胞水平升高。這與周自瑋等[14]的研究結(jié)論一致。整個(gè)試驗(yàn)階段，隨著紫莖澤蘭劑量的增加，HGB水平表現(xiàn)為下降越明顯，說(shuō)明紫莖澤蘭對(duì)機(jī)體的造血功能產(chǎn)生較顯著影響，這與李厚勇等[20]研究結(jié)論一致。

另一方面，本研究通過(guò)對(duì)紫莖澤蘭中毒的薩能奶山羊組織切片進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)紫莖澤蘭對(duì)試驗(yàn)組薩能奶山羊主要實(shí)質(zhì)性器官肝、脾、腎臟的組織結(jié)構(gòu)具有損害作用，可導(dǎo)致各器官的功能性細(xì)胞變性與壞死，這就表明紫莖澤蘭對(duì)反芻動(dòng)物——薩能奶山羊具有毒性作用，可對(duì)奶山羊造成肝腎毒性，影響其機(jī)體正常的新陳代謝功能，從而導(dǎo)致奶山羊的生長(zhǎng)異常。董強(qiáng)等[21]也報(bào)道了用紫莖澤蘭全草飼喂小鼠后會(huì)造成小鼠生長(zhǎng)緩慢，肝、腎等也呈現(xiàn)不同程度的病理?yè)p害。紫莖澤蘭雖然是良好的飼料來(lái)源，但未脫毒的紫莖澤蘭不適宜作為食草動(dòng)物的飼料[22]。

綜上，本研究通過(guò)向薩能奶山羊日糧中添加不同劑量的紫莖澤蘭粉，結(jié)果導(dǎo)致了試驗(yàn)組奶山羊肝、脾、腎器官出現(xiàn)不同程度的病理?yè)p傷，而試驗(yàn)組奶山羊血液指標(biāo)的改變也表明了采食紫莖澤蘭會(huì)造成試驗(yàn)動(dòng)物中毒，這為進(jìn)一步完善紫莖澤蘭引起山羊中毒的毒理學(xué)研究以及紫莖澤蘭的開(kāi)發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)。

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