許文芳，費(fèi)迎明，周建康，陳將南，周亞娣，呂秋瓊

1.紹興市立醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江 紹興 312000；

2.紹興市立醫(yī)院消化內(nèi)科，浙江 紹興 312000

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)在全世界腫瘤發(fā)病率中居第6位，腫瘤相關(guān)死亡中居第2位［1］，特別是在中國及東南亞地區(qū)，HCC的發(fā)病率和死亡率一直居高不下，形勢非常嚴(yán)峻。HCC細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖能力，HCC進(jìn)展快速、預(yù)后較差，抑制HCC細(xì)胞增殖能夠有效提高HCC的綜合治療效果。然而，HCC細(xì)胞的增殖是一個多基因參與、多信號分子及通路共同調(diào)節(jié)的復(fù)雜過程，其確切機(jī)制尚未完全闡明。XB130蛋白是肌動蛋白絲相關(guān)蛋白1(actin filament associated protein 1，AFAP1)家族的新成員，又被稱為肌動蛋白絲相關(guān)蛋白1L2(AFAP1L2)［2］。作為一種銜接蛋白，被酪氨酸磷酸化的XB130可活化調(diào)控磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylin-ositol 3-kinase，PIK3)/絲氨酸-蘇氨酸激酶(serine-threonine kinase，AKT)通路、Rac依賴性通路等重要信號通路，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生存、增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲等多種重要細(xì)胞過程［3-4］。相關(guān)研究顯示，抑制XB130蛋白的表達(dá)，在胃癌、食管癌及前列腺癌等多種腫瘤中，均有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的效果［5-7］。因此，本研究通過RNA干擾技術(shù)抑制HCC細(xì)胞中XB130蛋白的表達(dá)，評估XB130蛋白缺失對HCC細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞周期的影響，并對其下游相關(guān)的蛋白及mRNA進(jìn)行檢測。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和細(xì)胞株

胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基及DMEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；各培養(yǎng)基加入10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素后使用。XB130、p-AKT、p-糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase，GSK)3β、cyclin D1及p-Rb一抗均購自美國Cell Signal公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗購自上海康成生物工程有限公司，HRP結(jié)合的山羊抗小鼠二抗和HRP結(jié)合的山羊抗兔二抗均購自中山生物工程有限公司，組織細(xì)胞裂解液購自美國Cell Signal公司，上樣緩沖液購自美國Invitrogen公司，BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific Inc公司，蛋白預(yù)染Marker(protein marker 0671)購自美國Fermentas公司，PVDF膜購自美國Millipore公司，化學(xué)發(fā)光試劑盒購自美國GE Healthcare公司，ECL發(fā)光增強(qiáng)劑購自美國Pierce公司，膠片和顯影定影液購自美國Kodak公司，Negative Control siRNA(NC-siRNA)和XB130-siRNA均購自美國Santa Cruz公司，LipofectamineTM2000和RNA抽提液TRIzol Reagent均購自美國Invitrogen公司，無血清培養(yǎng)基Opti-MEM transfection medium購自美國Gibco公司。用于反轉(zhuǎn)錄的Prime Script Reagent RT Kit購自寶生物工程(大連)有限公司，XB130、cyclin E1、c-Myc、PCNA及β-actin的引物設(shè)計(jì)也由寶生物工程(大連)有限公司完成。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)購自日本同仁化學(xué)研究所，人肝癌細(xì)胞系(Huh7、HepG2和SNU-449)和正常肝臟細(xì)胞系(HL7702)均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

Huh7和HepG2細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)基中，SNU-449和HL7702細(xì)胞置于RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 XB130-siRNA轉(zhuǎn)染沉默XB130表達(dá)

6孔培養(yǎng)板中每孔加入2×105個Huh7細(xì)胞，培養(yǎng)至40%～60%融合。于聚苯乙稀管中制備以下轉(zhuǎn)染液：用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋100 pmol XB130-siRNA或NC-siRNA至250 μL/孔，于37 ℃溫箱中溫育5 min；用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋5 μL LipofectamineTM2000至250 μL/孔，于37 ℃溫箱中溫育5 min；輕輕混合上述兩種液體，于37 ℃溫箱中溫育包埋15 min。將6孔板中的無血清培養(yǎng)基吸除，把轉(zhuǎn)染液緩緩加入培養(yǎng)板中，并用Opti-MEM培養(yǎng)基補(bǔ)足轉(zhuǎn)染體系至2 mL/孔，搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻。于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，吸除轉(zhuǎn)染體系，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后檢測XB130 mRNA表達(dá)水平，48 h后檢測XB130蛋白表達(dá)水平，并于72 h內(nèi)完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 CCK-8檢測細(xì)胞活力

96孔培養(yǎng)板中每孔加入5×103個Huh7細(xì)胞(XB130-siRNA轉(zhuǎn)染、NC-siRNA轉(zhuǎn)染和對照)，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)特定的時間(24、48或72 h)。向每孔加入10 μL CCK-8溶液(稀釋入DMEM培養(yǎng)基中為10%工作液)，注意不要生成氣泡，氣泡會折光影響吸光度(D)值；然后置96孔板于37 ℃溫箱中溫育0.5～4.0 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的D值。根據(jù)D值計(jì)算相對細(xì)胞活性，V%=(處理組D值/對照組D值)×100%。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

6孔培養(yǎng)板中每孔加入2×105個Huh7細(xì)胞，血清饑餓同步化24 h，然后分別用XB130-siRNA或NC-siRNA轉(zhuǎn)染，48 h后用胰酶消化，離心收集細(xì)胞，PBS洗兩遍，棄上清液，加入70%預(yù)冷乙醇中，吹打均勻，4 ℃固定12 h以上。然后用PBS洗滌去乙醇，洗2遍。并用含50 μg/mL溴化乙啶和0.2%Triton X-100的PBS 0.5 mL重懸細(xì)胞，加入100 μg/mL RNase A，4 ℃避光溫育30 min。用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期，一般計(jì)數(shù)20 000～30 000個細(xì)胞(不少于10 000)，結(jié)果用細(xì)胞周期擬和軟件ModFit分析，計(jì)算G0/G1、S及G2/M期細(xì)胞比例。

1.6 蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測蛋白表達(dá)

收集細(xì)胞，加入6倍體積的細(xì)胞裂解液，冰上裂解1 h；4 ℃下，裂解混合液于12 000×g條件下離心15 min，取其上清液用蛋白質(zhì)定量試劑盒BCA法定量，將蛋白樣品調(diào)至等濃度，混合上樣緩沖液后100 ℃蛋白變性5 min。制備10%的SD-PAGE膠，室溫垂直靜置30 min。安裝電泳裝置，上下槽中注入Tris-甘氨酸電泳緩沖液，泳道中加5 μL的蛋白標(biāo)志物或10 μL(60 μg)的實(shí)驗(yàn)組蛋白后電泳。安裝電轉(zhuǎn)膜裝置，注入轉(zhuǎn)膜液，將蛋白電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。將膜取出、TBS-T液稍漂洗，然后浸沒于封閉液(5%脫脂奶粉的TBS液)，室溫封閉2 h。TBS-T液洗膜3次，每次5 min。將其浸沒于p-AKT、p-GSK3β、cyclin D1、p-Rb和GAPDH的一抗液(1∶1 000稀釋)中，4 ℃溫育6 h。TBS-T液洗膜3次，每次5 m i n。再將其浸沒于H R P標(biāo)記的二抗液(1∶5 000稀釋)中，室溫溫育2 h。TBS-T液洗膜3次，每次5 min。滴加HRP-ECL發(fā)光液發(fā)光，暗室曝光，顯影定影并掃描分析。

1.7 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR)檢測mRNA表達(dá)

用T R Izol R NA試劑盒提取Huh7細(xì)胞(XB130-siRNA轉(zhuǎn)染、NC-siRNA轉(zhuǎn)染和對照的總RNA)，取2 μg RNA，按照廠商說明用Prime Script Reagent RT Kit試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。XB130上游引物為5’-AGCACAGC ACTGGTGAAGAA-3’，下游引物為5’-GTTG CTTGTTGATGGTCACT-3’；Cyclin E1上游引物為5’-CTGGATGTTGACTGCCTTGA-3’，下游引物為5’-TCTTTGGTGGAGAAGGATGGGGTGG-3’；c-Myc上游引物為5’-GCAGCTGCTTAGACGCTGGA-3’，下游引物為5’-CGCAGTAGAAATACGGCTGCAC-3’；PCNA上游引物為5’-GTGAATTTGCACGTATATGCCG-3’，下游引物為5’-GCAATTTTATACTCTACAACAAGG GG-3’。PCR反應(yīng)儀采用上海Applied Biosystems Inc公司的ABI 7900 Prism HT，數(shù)據(jù)處理采用melting curve分析，XB130、cyclin E1、c-Myc和PCNA的mRNA表達(dá)量均標(biāo)準(zhǔn)化到β-actin(上游引物為5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’，下游引物為5’-CTA AGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 XB130蛋白在Huh7、HepG2、SNU449和HL7702細(xì)胞中的表達(dá)差異

Western blot檢測結(jié)果顯示，XB130蛋白在Huh7、HepG2、SNU449和HL7702細(xì)胞中的相對表達(dá)量分別為0.66±0.10、0.78±0.11、0.83±0.08和0.32±0.06；與HL7702細(xì)胞比較，各HCC細(xì)胞中XB130的表達(dá)明顯升高(P＜0.01)，而3種人肝癌細(xì)胞系之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖1)。

圖 1 Western blot檢測Huh7、HepG2、SNU449和HL7702細(xì)胞中XB130蛋白的表達(dá)情況Fig. 1 The protein expressions of XB130 in Huh7, HepG2,SNU449 and HL7702 cells detected by Western blot

2.2 XB130-siRNA轉(zhuǎn)染對Huh7細(xì)胞中XB130蛋白和mRNA表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，在空白對照組、NC-siRNA轉(zhuǎn)染組和XB130-siRNA轉(zhuǎn)染組Huh7細(xì)胞中，XB130蛋白的相對表達(dá)量分別為0.67±0.14、0.62±0.11和0.12±0.07；與空白對照組比較，NC-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中XB130蛋白的相對表達(dá)量無明顯變化，與NC-siRNA轉(zhuǎn)染組比較，XB130-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中XB130蛋白的相對表達(dá)量明顯降低(P＜0.01，圖2)。

圖 2 各組Huh7細(xì)胞中XB130蛋白的表達(dá)Fig. 2 The protein expressions of XB130 in the difference groups of Huh7 cells

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，XB130 mRNA表達(dá)水平上的改變和Western blot的結(jié)果一致，抑制率達(dá)(77.92±4.64)%，抑制效果顯著(P＜0.001，圖3)。

圖 3 各組Huh7細(xì)胞中XB130 mRNA的表達(dá)Fig. 3 The expressions of XB130 mRNA in the difference groups of Huh7 cells

2.3 沉默XB130基因?qū)uh7細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，XB130-siRNA轉(zhuǎn)染后24、48 h，空白對照組、NC-siRNA轉(zhuǎn)染組和XB130-siRNA轉(zhuǎn)染組中Huh7細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖4)；而轉(zhuǎn)染后72 h，與空白對照組比較，NC-siRNA轉(zhuǎn)染組Huh7細(xì)胞活力無明顯差異，而與NC-siRNA轉(zhuǎn)染組比較，XB130-siRNA轉(zhuǎn)染組Huh7細(xì)胞活力明顯降低，為空白對照組細(xì)胞活力的(69.19±2.11)%(P＜0.001，圖4)。

圖 4 24、48和72 h時各組Huh7細(xì)胞活力Fig. 4 The viability of Huh7 cells after 24, 48 and 72 h

通過細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制細(xì)胞生長曲線，結(jié)果顯示，空白對照組和NC-siRNA轉(zhuǎn)染組168 h生長曲線差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖5)；XB130-siRNA轉(zhuǎn)染組與NC-siRNA轉(zhuǎn)染組比較，生長曲線于72 h開始顯著降低(P＜0.001，圖5)。

2.4 沉默XB130對Huh7細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染XB130-siRNA后48 h，與空白對照組比較，NC-siRNA轉(zhuǎn)染組Huh7細(xì)胞不同時期細(xì)胞的比例無明顯改變(P＞0.05，圖6)；而與NC-siRNA轉(zhuǎn)染組比較，XB130-siRNA轉(zhuǎn)染組Huh7細(xì)胞中，G0/ G1期細(xì)胞比例明顯升高(P＜0.001，圖6)，達(dá)到(68.20±1.51)%，S和G2/M期細(xì)胞比例則降低(P＜0.01，圖6)，分別降至(20.30±0.79)%和(11.50±0.74)%。

圖 5 各組Huh7細(xì)胞生長曲線Fig. 5 The growth curves of Huh7 cells

圖 6 各組Huh7細(xì)胞中不同細(xì)胞周期的比例Fig. 6 The ratio of Huh7 cells in the different cell cycle phases

2.5 沉默XB130對Huh7細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，在空白對照組、NC-siRNA轉(zhuǎn)染組和XB130-siRNA轉(zhuǎn)染組Huh7細(xì)胞中，p-AKT蛋白的相對表達(dá)量分別為0.87±0.17、0.93±0.22和0.34±0.14，p-GSK3β蛋白的相對表達(dá)量分別為0.90±0.24、0.92±0.19和0.53±0.11，cyclin D1蛋白的相對表達(dá)量分別為0.93±0.26、0.89±0.29和0.47±0.16，p-Rb蛋白的相對表達(dá)量分別為0.90±0.23、0.92±0.28和0.58±0.17；與空白對照組比較，NC-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中p-AKT、p-GSK3β、cyclin D1及p-Rb蛋白的相對表達(dá)量無明顯變化，與NC-siRNA轉(zhuǎn)染組比較，XB130-siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中p-AKT、p-GSK3β、cyclin D1及p-Rb蛋白的相對表達(dá)量明顯降低(P＜0.01，圖7)。

圖 7 各組Huh7細(xì)胞中周期相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig. 7 The expressions of cell cycle related proteins in different Huh7 cells

2.6 沉默XB130對Huh7細(xì)胞周期相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的影響

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染XB130-siRNA后的Huh7細(xì)胞，其E2F/DP-1的靶基因cyclin E1、c-Myc和PCNA的mRNA表達(dá)，較NC-siRNA轉(zhuǎn)染組均明顯下降(P均＜0.001，圖8)，分別降至(57.44±3.61)%、(42.05±8.83)%和(48.72±3.82)%。

圖 8 各組Huh7細(xì)胞中E2F/DP-1靶基因的表達(dá)Fig. 8 The expressions of E2F/DP-1 target genes in different Huh7 cells

3 討 論

本研究以XB130為切入點(diǎn)，以HCC細(xì)胞增殖為研究對象，應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)，證實(shí)了XB130在細(xì)胞增殖中的重要作用，探索了XB130調(diào)控HCC細(xì)胞周期的可能機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，XB130蛋白在HCC細(xì)胞系中的表達(dá)較正常肝細(xì)胞明顯升高，提示XB130可能和HCC發(fā)生、發(fā)展存在一定的相關(guān)性。XB130蛋白可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲等生物學(xué)過程，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。我們通過沉默HCC細(xì)胞的XB130基因后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞增殖能力會受到明顯抑制。這些結(jié)果表明，XB130可能與細(xì)胞惡性病變有關(guān)，作為一種原癌基因在HCC細(xì)胞中高表達(dá)，并對其細(xì)胞增殖發(fā)揮重要作用。

有研究報(bào)道，抑制胃癌、食管癌和前列腺癌中的XB130可引起細(xì)胞周期的G0/G1期阻滯［5-7］。為了進(jìn)一步了解XB130基因調(diào)控HCC細(xì)胞增殖的機(jī)制，我們檢測了沉默XB130基因后Huh7細(xì)胞周期的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默XB130基因48 h后，G0/G1期Huh7細(xì)胞比例明顯升高，說明XB130蛋白在HCC中能夠促進(jìn)細(xì)胞從G0期進(jìn)入G1期，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖。

XB130蛋白包含有數(shù)個酪氨酸磷酸化位點(diǎn)、1個Src同源結(jié)構(gòu)域2(SH2)和3個SH3，故其可被酪氨酸磷酸化，進(jìn)而與PI3K的亞單位p85α結(jié)合并激活下游的AKT，調(diào)控細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等過程［3-4］。為了探索XB130在HCC中調(diào)控細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的可能機(jī)制，本研究測定了細(xì)胞中p-AKT、p-GSK3β、cyclin D1及p-Rb的蛋白表達(dá)和E2F/DP-1的靶基因mRNA表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，p-AKT、p-GSK3β表達(dá)下降，提示在HCC中XB130基因受抑制也可以導(dǎo)致AKT磷酸化水平下調(diào)，并進(jìn)而影響GSK3β的磷酸化水平。AKT的失活伴隨GSK3β的活化，會使cyclin D1表達(dá)下降，抑制周期蛋白依賴性激酶CDK4/6的活性，導(dǎo)致其下游的Rb蛋白磷酸化受限，E2F/DP-1轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物難以發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活細(xì)胞周期的功能［8］；而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，cyclin D1和p-Rb表達(dá)下調(diào)，以及E2F/DP-1靶基因cyclin E1、c-Myc和PCNA表達(dá)下調(diào)。上述結(jié)果提示，XB130蛋白可能是通過活化PI3K/AKT通路，調(diào)控細(xì)胞周期蛋白及下游轉(zhuǎn)錄因子，從而影響Huh7細(xì)胞的增殖能力。

XB130在HCC細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用，可以成為HCC治療的一個新靶點(diǎn)。

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