徐鳳玲，黃顯玉，王琳娜

1. 萊蕪市人民醫(yī)院輸血科，山東 萊蕪 271100；

2. 青島大學(xué)附屬中心醫(yī)院，青島市腫瘤醫(yī)院放射物理科，山東 青島 266000；

3. 山東省青島療養(yǎng)院檢驗(yàn)科，山東 青島 266000

胰腺癌是一種死亡率極高、轉(zhuǎn)移能力極強(qiáng)的惡性消化系腫瘤，其特點(diǎn)常表現(xiàn)出發(fā)病隱匿、病程短、轉(zhuǎn)移早及死亡率高等，預(yù)后極差［1-2］。據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，胰腺癌的發(fā)病率和死亡率呈逐年升高趨勢(shì)［3］。20世紀(jì)90年代美國(guó)食品藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)將吉西他濱(gemcitabine，GEM)批準(zhǔn)為治療胰腺癌一線化療藥物，在一段時(shí)間內(nèi)GEM的臨床使用提高了胰腺癌的治療效率［4-5］。然而，隨著臨床GEM耐藥性的出現(xiàn)，GEM的化療療效大大降低，1年生存率僅為17%～23%［6］。因此，對(duì)胰腺癌GEM耐藥機(jī)制研究有著重大意義。

聚集素(clusterin，CLU)是一種多功能蛋白質(zhì)，由核型聚集素(nuclear clusterin，nCLU)和分泌型聚集素(secretory clusterin，sCLU)兩個(gè)亞型組成，在組織重建、脂質(zhì)運(yùn)輸、補(bǔ)體調(diào)節(jié)及細(xì)胞凋亡等過(guò)程中發(fā)揮作用［7］。研究發(fā)現(xiàn)，sCLU是一種細(xì)胞凋亡抑制因子，其表達(dá)與多種腫瘤細(xì)胞耐藥密切相關(guān)［8］。

氧化應(yīng)激在細(xì)胞凋亡和藥物毒性機(jī)制中扮演重要角色，活性氧(reactive oxygen species，ROS)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和治療中起著重要作用。本研究通過(guò)在sCLU干預(yù)下，GEM作用于胰腺癌細(xì)胞后，觀察胰腺癌細(xì)胞MIA PaCa-2的增殖趨勢(shì)，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)水平，以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)酶活力表達(dá)水平變化，以期探討sCLU對(duì)GEM耐藥性的影響機(jī)制，為胰腺癌的治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

MIA PaCa-2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)，GEM購(gòu)自法國(guó)Lilly公司，sCLU購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 儀器與試劑

CO2恒溫培養(yǎng)箱(HERAcell2401)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，倒置顯微鏡(s40-SLIDER)購(gòu)自德國(guó)Leica公司，酶標(biāo)儀(Multiskan MK 3)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，離心機(jī)(Neofuge 13)購(gòu)自上海力申科學(xué)儀器有限公司，分析天平(XP26)購(gòu)自瑞士Mettler Tolebo公司，RPMI-1640培養(yǎng)液、胎牛血清及磷酸鹽緩沖液購(gòu)自美國(guó)HyClone公司，CCK-8試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，ROS檢測(cè)試劑盒、總SOD 活力檢測(cè)試劑盒及CAT檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 方法

1.3.1 人胰腺癌細(xì)胞培養(yǎng)

將MIA PaCa-2細(xì)胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到90%融合時(shí)，以0.25%胰酶消化1.5 min，用完全培養(yǎng)液終止消化并傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞分別接種于96孔板和6孔板，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 GEM培養(yǎng)液配制與濃度

稱取GEM10 μg，用新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)液配制成10 μg/mL濃度，然后稀釋成0、0.63、1.25、2.50、5.00和10.00 μg/mL的GEM培養(yǎng)液。

1.3.3 CCK-8檢測(cè)sCLU及GEM對(duì)細(xì)胞增殖的影響

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞于終濃度分別為0、0.63、1.25、2.50、5.00和10.00 μg/mL的GEM培養(yǎng)液和含5.4 μmol/L的sCLU無(wú)血清培養(yǎng)基中暴露24 h。除去培養(yǎng)液，加入CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后用酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)吸光度(D)值，并計(jì)算細(xì)胞抑制率和IC50。每組作5個(gè)平行。

1.3.4 MIA PaCa-2細(xì)胞內(nèi)ROS 的測(cè)定

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞于終濃度分別為0、1.25、2.50和5.00 μg/mL的GEM培養(yǎng)液和含5.4 μmol/L的sCLU無(wú)血清培養(yǎng)基中暴露24 h。除去培養(yǎng)液，加入等體積稀釋好的熒光探針DCFH-DA，繼續(xù)培養(yǎng)30 min，按照ROS試劑盒操作步驟，以485 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，采用多功能熒光酶標(biāo)儀分析細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

1.3.5 MIA PaCa-2細(xì)胞內(nèi)SOD活力的測(cè)定

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞于終濃度分別為0、1.25、2.50、5.00 μg/mL的GEM培養(yǎng)液和含5.4 μmol/L的sCLU無(wú)血清培養(yǎng)基中暴露24 h，裂解細(xì)胞后，離心去上清液，采用總SOD檢測(cè)試劑測(cè)定SOD活力，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，在560 nm波長(zhǎng)處測(cè)定D值，每組做3個(gè)平行。

1.3.6 MIA PaCa-2細(xì)胞內(nèi)CAT活力的測(cè)定

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞于終質(zhì)量濃度分別為0、1.25、2.50和5.00 μg/mL的GEM培養(yǎng)液和含5.4 μmol/L的sCLU無(wú)血清培養(yǎng)基中暴露24 h，裂解細(xì)胞后，離心(604×g)去上清液，采用CAT檢測(cè)試劑測(cè)定CAT活力，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，在520 nm波長(zhǎng)處測(cè)定D值，每組做3個(gè)平行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 GEM和sCLU干預(yù)對(duì)MIA PaCa-2細(xì)胞增殖影響

GEM、sCLU干預(yù)組對(duì)MIA PaCa-2細(xì)胞抑制率與陰性對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；GEM和sCLU干預(yù)組各濃度組的組內(nèi)比較結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且均隨著藥物濃度的增加呈上升趨勢(shì)(P＜0.05)；在低質(zhì)量濃度(0.63 μg/mL)時(shí)干預(yù)組對(duì)細(xì)胞抑制率高于GEM組(P＜0.05)，隨著質(zhì)量濃度(1.25、2.50、5.00和10.00 μg/mL)升高，GEM組對(duì)細(xì)胞的抑制率高于干預(yù)組(P＜0.05，表1)。

表 1 GEM及sCLU作用24 h對(duì)MIA PaCa-2細(xì)胞抑制率的影響Tab. 1 Effect of GEM exposure and sCLU intervention on the inhibition rates of MIA PaCa-2 cells in 24 h(n=5, ±s, %)

表 1 GEM及sCLU作用24 h對(duì)MIA PaCa-2細(xì)胞抑制率的影響Tab. 1 Effect of GEM exposure and sCLU intervention on the inhibition rates of MIA PaCa-2 cells in 24 h(n=5, ±s, %)

*: P＜0.05, compared with the negative control group (0 μg/mL), as well as compared with each other at different concentrations of GEM group or sCLU group; △: P＜0.05, compared with GEM group at different concentrations

Group Exposure dose ρB/(μg·mL-1)0 0.63 1.25 2.50 5.00 10.00 GEM 0 8.32±0.42* 18.2±0.33* 45.49±1.04* 78.56±0.12* 88.67±0.65*sCLU△ 0 11.26±0.61* 24.8±0.54* 36.45±0.83* 53.21±0.04* 66.47±0.31*

2.2 MIA PaCa-2細(xì)胞增殖時(shí)間變化趨勢(shì)

根據(jù)不同濃度GEM對(duì)細(xì)胞抑制率的影響，我們繪制了折線圖，并采用改良寇式法計(jì)算GEM的IC50為2.50 μg/mL，圖1為GEM(2.50 μg/mL)、sCLU干預(yù)組對(duì)MIA PaCa-2細(xì)胞抑制率隨時(shí)間變化趨勢(shì)圖，在6 h時(shí)，sCLU干預(yù)組細(xì)胞抑制率略高于GEM組(P＞0.05)，隨時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞抑制率逐漸升高，相同時(shí)間GEM組細(xì)胞抑制率高于sCLU干預(yù)組(P＜0.05，表1)。

2.3 MIA Pa Ca-2細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)水平結(jié)果

與陰性對(duì)照組比較，GEM、sCLU干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)ROS均較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜ 0.05)；隨著濃度的增加，GEM、sCLU干預(yù)組熒光強(qiáng)度呈升高趨勢(shì)(P＜0.05)；同濃度不同組間進(jìn)行比較，在質(zhì)量濃度為1.25、2.50和5.00 μg/mL時(shí)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表2)。

激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組綠色熒光不明顯，在2.5 μg/mL時(shí)，GEM、sCLU干預(yù)組不同程度地發(fā)出熒光，且sCLU干預(yù)組較GEM組弱(圖2)。

圖 1 GEM及sCLU干預(yù)后MIA PaCa-2細(xì)胞抑制率隨時(shí)間變化趨勢(shì)Fig. 1 The trend of MIA PaCa-2 cell inhibition rate after GEM exposure and sCLU intervention at different hours

表 2 GEM及sCLU作用24 h 細(xì)胞內(nèi)ROS變化水平的影響Tab. 2 Effect of GEM exposure and sCLU intervention on the expression levels of ROS for 24 h in MIA PaCa-2 cells［n=3,±s］

表 2 GEM及sCLU作用24 h 細(xì)胞內(nèi)ROS變化水平的影響Tab. 2 Effect of GEM exposure and sCLU intervention on the expression levels of ROS for 24 h in MIA PaCa-2 cells［n=3,±s］

*: P＜0.05, compared with the negative control group (0 μg/mL), as well as compared with each other at different concentrations of GEM group or sCLU group; △: P＜0.05, compared with GEM group at different concentrations

Group Exposure dose ρB/(μg·mL-1)0 1.25 2.50 5.00 GEM 39.21±11.60 138.30±18.63* 145.46±14.24* 178.56±15.62*sCLU△ 31.21±11.60 114.8±12.54* 126.45±12.37* 153.21±21.32*

圖 2 DCFH-DA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)水平Fig. 2 The expression levels of ROS measured by DCFH-DA method

2.4 MIA Pa Ca-2細(xì)胞內(nèi)SOD活力水平

與對(duì)照組相比，GEM、sCLU干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)SOD活力均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；隨著藥物濃度升高，GEM干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)SOD活力呈上升趨勢(shì)，sCLU干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)SOD活力呈先上升后下降趨勢(shì)；同濃度不同組間進(jìn)行比較，在濃度為2.50、5.00 μg/mL時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表3)。

2.5 MIA PaCa-2細(xì)胞內(nèi)CAT活力水平

與對(duì)照組相比，GEM、sCLU干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)CAT 活力均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜ 0.05)；隨著藥物濃度升高，GEM、sCLU干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)CAT活力呈先上升后下降趨勢(shì)；同濃度不同組間進(jìn)行比較，在濃度為2.50和5.00 μg/mL時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表4)。

表 3 GEM及sCLU作用24 h MIA PaCa-2 細(xì)胞內(nèi)SOD活力水平Tab. 3 Effect of GEM exposure and sCLU intervention on the expression levels of SOD for 24 h in MIA PaCa-2 cells(n=3, ±s , U/mg Pro)

表 3 GEM及sCLU作用24 h MIA PaCa-2 細(xì)胞內(nèi)SOD活力水平Tab. 3 Effect of GEM exposure and sCLU intervention on the expression levels of SOD for 24 h in MIA PaCa-2 cells(n=3, ±s , U/mg Pro)

*: P＜0.05, compared with the negative control group (0 μg/mL), as well as compared with each other at different concentrations of GEM group or sCLU group; △: P＜0.05, compared with GEM group at different concentrations

Group Exposure dose ρB/(μg·mL-1)0 1.25 2.50 5.00 GEM 109.21±12.30 141.30±21.53* 195.28±19.36* 192.42±21.22*sCLU△ 119.36±14.62 154.60±24.62* 177.35±26.62* 148.31±13.42*

表 4 GEM及sCLU作用24 h MIA PaCa-2 細(xì)胞內(nèi)CAT活力水平的影響Tab. 4 The effect of GEM exposure and sCLU intervention on the expression levels of CAT for 24 h in MIA PaCa-2 cells(n=3, ±s , U/mg Pro)

表 4 GEM及sCLU作用24 h MIA PaCa-2 細(xì)胞內(nèi)CAT活力水平的影響Tab. 4 The effect of GEM exposure and sCLU intervention on the expression levels of CAT for 24 h in MIA PaCa-2 cells(n=3, ±s , U/mg Pro)

*: P＜0.05, compared with the negative control group (0 μg/mL), as well as compared with each other at different concentrations of GEM group or sCLU group; △: P＜0.05, compared with GEM group at different concentrations

Group Exposure dose ρB/(μg·mL-1)0 1.25 2.50 5.00 GEM 1.94±0.60 2.67±0.63* 2.86±0.35* 2.41±0.53*sCLU△ 2.21±0.42 2.85±0.58* 3.15±0.57* 2.62±0.46*

3 討 論

胰腺癌化療失敗的主要原因之一就是對(duì)藥物產(chǎn)生了耐藥性，目前其耐藥機(jī)制尚不明確。sCLU在多種惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平較高，被認(rèn)為是惡性腫瘤細(xì)胞耐藥的重要機(jī)制之一，但是對(duì)于sCLU干預(yù)胰腺癌耐藥的研究比較缺乏［9-11］。本研究結(jié)果顯示，GEM可抑制MIA PaCa-2細(xì)胞的增殖，氧化損傷可能是GEM致細(xì)胞毒性的重要機(jī)制之一，sCLU在一定程度可以調(diào)節(jié)GEM的氧化損傷作用，隨著GEM 濃度的升高，sCLU影響效應(yīng)更加明顯，sCLU在一定程度可能通過(guò)調(diào)節(jié)GEM氧化損傷而產(chǎn)生耐藥。

CCK-8實(shí)驗(yàn)被認(rèn)為是檢測(cè)藥物抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的靈敏方法之一，本次研究與課題組前期MTT法檢測(cè)胰腺癌細(xì)胞暴露于GEM的抑制趨勢(shì)相一致，但在sCLU干預(yù)下，隨著藥物濃度的升高，細(xì)胞抑制率逐漸降低。但是在較低濃度時(shí)，暴露于sCLU和GEM組抑制率反而高于單純GEM組(P＞0.05)，可能是sCLU在一定程度上也可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［12-13］。在較高濃度時(shí)，sCLU對(duì)GEM藥物毒性的調(diào)節(jié)效應(yīng)比較明顯(P＜0.05)。Wang等［14］通過(guò)下調(diào)sCLU的表達(dá)，增強(qiáng)了肝癌細(xì)胞(Bel7402和SMMC7721)對(duì)GEM的敏感性，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞抑制率升高。

ROS在腫瘤的發(fā)展和治療過(guò)程中扮演著重要角色，其引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)被認(rèn)為是抗腫瘤藥物發(fā)揮療效的可能作用機(jī)制之一［15-17］。Donadelli等［18］將胰腺癌細(xì)胞暴露于GEM和大麻素后，ROS水平可發(fā)生不同程度的升高，升高的ROS可以誘發(fā)細(xì)胞自我吞噬而產(chǎn)生藥物作用，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。生理狀態(tài)下的ROS產(chǎn)生與清除處在一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，一旦細(xì)胞發(fā)生病變，大量產(chǎn)生的ROS可以直接導(dǎo)致細(xì)胞毒性效應(yīng)，其可使脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)變性、DNA突變及斷裂等。研究結(jié)果表明，某些化療藥物能夠下調(diào)Bcl-2或抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，從而促進(jìn)細(xì)胞色素C表達(dá)或激活JNK、P38信號(hào)通路，進(jìn)而升高ROS表達(dá)水平，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡［19-20］。本研究結(jié)果顯示，隨著GEM藥物濃度的升高，ROS表達(dá)水平逐漸增高，sCLU干預(yù)組ROS表達(dá)水平降低，在高濃度時(shí)降低明顯，提示sCLU在一定濃度內(nèi)降低細(xì)胞內(nèi)ROS的表達(dá)水平。

本實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞內(nèi)SOD和CAT活力隨ROS表達(dá)水平升高而增強(qiáng)，在半數(shù)致死劑量時(shí)活力達(dá)到最高，提示細(xì)胞內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)的進(jìn)行是協(xié)調(diào)一致的；在sCLU干預(yù)下SOD和CAT活力表達(dá)增強(qiáng)，提示sCLU干預(yù)增強(qiáng)了細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的表達(dá)活力，致使ROS表達(dá)水平降低，從而降低對(duì)腫瘤細(xì)胞的藥物療效。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，GEM可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，在一定藥物濃度范圍內(nèi)，sCLU可干預(yù)GEM引起胰腺癌細(xì)胞內(nèi)ROS表達(dá)水平和SOD、CAT酶活力表達(dá)水平的明顯變化，sCLU在一定程度可能通過(guò)調(diào)節(jié)GEM氧化損傷而產(chǎn)生耐藥。sCLU在一定程度上可以調(diào)節(jié)GEM對(duì)胰腺癌細(xì)胞藥物毒性作用，氧化應(yīng)激可能是sCLU調(diào)節(jié)GEM對(duì)胰腺癌細(xì)胞藥效的重要機(jī)制之一。

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