趙瑞柯+曹俊華

[摘要]目的 建立反相高效液相色譜法同時測定血漿中茶堿和多索茶堿的濃度。方法 色譜柱為Phenomenex C18 柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇∶水（30∶70）；流速為1 ml/min；檢測波長為273 nm，內(nèi)標(biāo)為咖啡因。結(jié)果 茶堿和多索茶堿在1.05～67.33 μg/ml的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r>0.999）；茶堿和多索茶堿的方法回收率分別為96.79%～105.40%、91.85%～95.51%， 日內(nèi)、日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均<10%。結(jié)論 本方法簡單、準(zhǔn)確，適用于同時測定茶堿和多索茶堿的血藥濃度。

[關(guān)鍵詞]茶堿；多索茶堿；血藥濃度監(jiān)測；反相高效液相色譜法

[中圖分類號] R917 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）1（c）-0007-03

Simultaneous determination of the concentration of Theophylline and Doxofylline in human plasma by revered-phase high performance liquid chromatography

ZHAO Rui-ke1 CAO Jun-hua2

1.Department of Pharmacy，Traditional Chinese Medcine Hospital of Changsha City in Hu′nan Province，Changsha 410100，China；2.Department of Pharmacy in Mawangdui Area，People′s Hospital in Hu′nan Province，Changsha 410000，China

[Abstract]Objective To establish a method for simultaneous determination of theophylline and doxofylline in human plasma by RP-HPLC.Methods Phenomenex C18 （250 mm ×4.6 mm，5 μm） column was used.The mobile phase was composed of methanol-water （30∶70） at flow rate of 1.0 ml/min.The detection wavelength was 273 nm and the internal standard was caffeine.Results The linear range was 1.05 to 67.33 μg/ml for theophylline and doxofylline （r>0.999）.The recovery rates was 96.79%-105.40% and 91.85%-95.51% respectively.The intra-day precisions and the inter-day precisions were both less than 10%.Conclusion The method is rapid and accurate.It can be used for the simultaneous determination of theophylline and doxofylline concentration in human plasma.

[Key words]Theophylline；Doxofylline；Plasma concentration monitoring；RP-HPLC

茶堿是臨床上治療支氣管哮喘的經(jīng)典藥物，其通過抑制磷酸二酯酶，使細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）含量增高而發(fā)揮藥理作用。茶堿的有效血藥濃度與中毒濃度非常接近，因此臨床應(yīng)用需要監(jiān)測其血藥濃度[1]。多索茶堿是新型的甲基黃嘌呤衍生物，其支氣管平滑肌松弛作用是茶堿的10～15倍，并有鎮(zhèn)咳作用。多索茶堿的毒副作用較茶堿少，但是大劑量仍可引起血壓下降等不良反應(yīng)[2-3]。目前茶堿和多索茶堿的血藥濃度測定多有報道，但是同時測定的文獻(xiàn)較少。茶堿和多索茶堿互為補(bǔ)充，臨床上存在著兩者交替使用甚至合并使用的情況[4-6]。本研究建立了反相高效液相色譜法同時測定血漿中茶堿和多索茶堿的藥物濃度，現(xiàn)報道如下。

1儀器與材料

1.1儀器

LC-10A高效液相色譜儀，SPD-10A紫外檢測器，Shimadzu CLASS-VP液相工作站（日本島津）；梅特勒-托利多AG285電子分析天平（瑞士，精度：0.01 mg）；TG16-W 微量高速離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；WH-2 微量旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）。

1.2藥品與試劑

氨茶堿對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100336-200703，含量為99.9%），多索茶堿對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100109-200305，含量為99.9%），咖啡因?qū)φ掌罚▋?nèi)標(biāo)，中國藥品生物制品檢定所，批號：100757-200556，含量99.1% ）， 甲醇（色譜純，Merck，Germany），水為雙重蒸餾水，其他試劑為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18 柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm），預(yù)柱：Phenomenex C18柱（10 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：40℃；流動相：甲醇∶水（30∶70）；流速：1 ml/min；檢測波長：273 nm；進(jìn)樣量：10 μl。endprint

2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取氨茶堿對照品10.1 mg 、多索茶堿對照品10.1 mg，置于10 ml 容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，制成10.10 μg/ml的對照品儲備液；另精密稱取咖啡因?qū)φ掌?0 mg，置于100 ml 容量瓶中，加甲醇溶解至刻度，得濃度為100 μg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液。以上樣品均置于4℃的冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3血漿樣品的處理

取血漿0.35 ml，置于1.5 ml的EP管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液25 μl，再加入甲醇溶液1.1 ml，渦旋振蕩1 min，以10 000 r/min離心10 min，取上清液10 μl進(jìn)樣。

2.4色譜行為

空白血樣、空白血樣中加入對照品和內(nèi)標(biāo)血樣經(jīng)HPLC分析得到色譜圖（圖1）。茶堿、多索茶堿和內(nèi)標(biāo)的保留時間分別為7.1、13.8、9.6 min，基線平穩(wěn)，峰形良好，無雜質(zhì)峰干擾。提示本方法具有較高特異性，能夠準(zhǔn)確測定血漿中茶堿和多索茶堿的濃度。

2.5線性范圍與最低檢測限

用空白血漿將茶堿對照品和多索茶堿對照品溶液稀釋成不同濃度（1.05，2.11，4.21，8.42，16.83， 33.66，67.33 μg/ml）的含藥血漿，按“2.3”項下處理方法處理并測定，以茶堿、多索茶堿的峰面積和內(nèi)標(biāo)的峰面積比值與茶堿和多索茶堿的濃度進(jìn)行線性回歸，分別得到回歸方程為Y=18.591X-0.457（r2=0.9987）、 Y=17.362X-0.256（r2=0.9963），結(jié)果提示茶堿和多索茶堿在1.05～67.33 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量限為1.05 μg/ml。

2.6回收率與精密度試驗

分別配制濃度為2.11、16.83、33.66 μg/ml的茶堿和多索茶堿的血漿樣品標(biāo)準(zhǔn)管，按 “2.3”項下操作，測定峰面積，按回歸方程計算實測濃度，分別在同一天內(nèi)測定5次和每天5次連續(xù)測定3 d，分別考察方法的日內(nèi)、日間精密度和回收率。

配置濃度為2.11、16.83、33.66 μg/ml的茶堿和多索茶堿標(biāo)準(zhǔn)液各5份，直接進(jìn)樣得峰面積。用空白血漿配置不同濃度的茶堿、多索茶堿標(biāo)準(zhǔn)血漿各5份，平行操作，進(jìn)樣得峰面積。將萃取前后的峰面積進(jìn)行比較，計算方法的提取回收率（表1）。

2.7樣品穩(wěn)定性考察

血漿樣品室溫放置穩(wěn)定性：用空白血漿配制相當(dāng)于濃度2.11、16.83、33.66 μg/ml的茶堿和多索茶堿的血漿樣品，考察其在-20℃冷凍保存、反復(fù)凍融、室溫條件下的穩(wěn)定性。結(jié)果提示，茶堿和多索茶堿的血漿樣品在-20℃保存20 d，反復(fù)凍融3次，室溫條件下放置10 h，測得的濃度與理論濃度相比，RSD均<10%，提示茶堿和多索茶堿在上述條件下保持穩(wěn)定（表2）。

2.8臨床應(yīng)用

患者，男，73歲，診斷：慢性阻塞性肺疾病急性加重，高血壓3級（極高危）。入院后醫(yī)囑給予患者氨茶堿注射液0.25 g和0.9%氯化鈉注射液250 ml靜脈滴注，12 h給藥1次。第4天測定茶堿谷濃度為17.3 μg/ml，患者已有較明顯的惡心嘔吐等中毒癥狀。醫(yī)生調(diào)整遺囑，改為多索茶堿0.2 g和0.9%氯化鈉注射液250 ml靜脈滴注，12 h給藥1次，第8天給藥前測定多索茶堿谷的濃度為8.46 μg/ml ，患者哮喘控制佳，且無不良反應(yīng)發(fā)生。

3討論

目前國內(nèi)外報道的茶堿和多索茶堿HPLC同時測定的方法主要有固相提取法[7]、液液萃取法[8]、直接蛋白沉淀法[9-15]等。固相提取法操作過程繁瑣，液液萃取法通常采用的氯仿、異丙醇等易揮發(fā)試劑，對身體有較大毒性，且過程需要萃取、轉(zhuǎn)移、揮干等，操作一致性和穩(wěn)定性較差。而已有的蛋白沉淀法，多采用10%三氯醋酸、10%高氯酸等，上清液需用微孔濾膜過濾，流動相中加入三乙胺等改善拖尾。本法沉淀劑選用甲醇，流動相采用甲醇-水，對色譜柱損傷較小。

多索茶堿與茶堿在化學(xué)結(jié)構(gòu)上的區(qū)別是多索茶堿在茶堿的7位上加了1個二氧戊環(huán)，這是兩者在色譜柱上能夠分離的基礎(chǔ)，多索茶堿的保留時間比茶堿延長了許多。流動相中有機(jī)相與水相的比例對茶堿和多索茶堿的保留時間有很大的影響，本研究考察了甲醇與水的不同配比，當(dāng)甲醇比例>35%時，茶堿色譜峰和血漿內(nèi)源性雜質(zhì)峰無法分離。當(dāng)甲醇∶水的比例為3∶7時，茶堿、多索茶堿、內(nèi)標(biāo)與雜質(zhì)峰分離效果較好，出峰時間適宜，滿足了測定需求。

以往認(rèn)為茶堿的有效治療濃度范圍是10～20 μg/ml，近些年研究發(fā)現(xiàn)茶堿在低濃度（5～10 μg/ml）時有顯著的抗炎作用及免疫調(diào)節(jié)作用，故把茶堿的有效血藥濃度定為6～15 μg/ml更合理，該濃度兼顧了茶堿的擴(kuò)張支氣管和抗炎作用，又減少了毒性作用的發(fā)生[16-18]。多索茶堿的有效藥物濃度仍無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，但考慮到多索茶堿的藥理作用是茶堿的10～15倍，在<5 μg/ml時是否有臨床意義還需進(jìn)一步研究。本方法的測定范圍（1.05～67.33 μg/ml）完全覆蓋了最低有效濃度和中毒濃度，可以滿足臨床測定的需要。

目前在臨床治療上，為了控制哮喘的急性癥狀，口服多索茶堿的患者仍可能靜脈注射茶堿注射液，使用本方法可同時快速準(zhǔn)確地測定茶堿和多索茶堿的血藥濃度，為臨床及時調(diào)整劑量、減少不良反應(yīng)的發(fā)生提供依據(jù)。

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（收稿日期：2017-09-04 本文編輯：閆 佩）endprint