方 菲,顏阿娜,汪少蕓

(福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院, 福建 福州 350116)

0 引言

魚(yú)鱗是魚(yú)皮真皮層的變形物,約占魚(yú)體質(zhì)量的l%～5%[1]. 其富含的膠原蛋白,可通過(guò)酶解、 微生物發(fā)酵水解等方法來(lái)制備具有抗氧化、 降血壓等生理活性的水解產(chǎn)物,這不僅能夠充分利用資源,提高魚(yú)類(lèi)加工的附加值,還可減少環(huán)境污染,促進(jìn)魚(yú)類(lèi)加工業(yè)的發(fā)展. 國(guó)內(nèi)外對(duì)各種魚(yú)類(lèi)魚(yú)肉酶解制備功能產(chǎn)物的研究較多,關(guān)于魚(yú)鱗酶解制備功能產(chǎn)物的研究主要集中在鰱魚(yú)[2]、 青魚(yú)[3]、 羅非魚(yú)[4-7]、 草魚(yú)[8-9]、 鯉魚(yú)[10]等魚(yú)鱗膠原蛋白/明膠的提取,以及魚(yú)鱗膠原蛋白/明膠生物活性肽的制備,而鯛魚(yú)鱗的研究則未見(jiàn)報(bào)道.

人體很多疾病與活性氧的形成有關(guān),抗氧化劑可通過(guò)提供氫原子或電子來(lái)阻止不飽和脂質(zhì)氧化,或通過(guò)清除單線(xiàn)態(tài)氧來(lái)終止自由基介質(zhì)導(dǎo)的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及通過(guò)金屬催化劑的失活或去除引發(fā)劑自由基中間體[11]. 本研究以鯛魚(yú)鱗為原材料,通過(guò)物理方式進(jìn)行預(yù)處理后進(jìn)行酶解,制備具抗氧化活性的酶解產(chǎn)物,避免了酸堿脫鈣處理的化學(xué)污染,為提高鯛魚(yú)加工廢棄物的利用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值尋找新的途徑.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鯛魚(yú)鱗,莆田匯豐食品有限公司提供； 酸性蛋白酶、 堿性蛋白酶、 木瓜蛋白酶、 中性蛋白酶,購(gòu)自諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司； 復(fù)合風(fēng)味蛋白酶,購(gòu)自廣州市華琪生物技術(shù)有限公司； 1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH),購(gòu)自美國(guó)sigma 公司； 其余試劑均為分析純,購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

1.2 主要儀器與設(shè)備

XZ-21K-高速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司)； KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)； 立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司)； FE20 pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)； Big Squid磁力攪拌器(德國(guó)IKA公司)； TH2-82恒溫水浴搖床(金壇市鴻科儀器廠(chǎng))； 自動(dòng)點(diǎn)位滴定儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司)； EU2600紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海昂拉儀器有限公司)； FD-1C-50冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)； Waters TM650E高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)； L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀(日本Hitachi公司).

1.3 方法

1) 樣品預(yù)處理. 魚(yú)鱗由羥基磷灰石和膠原蛋白交聯(lián)組成,結(jié)構(gòu)致密,直接酶解效率低. 因此,先使用粉碎機(jī),將魚(yú)鱗粉碎(5 min),然后結(jié)合超聲[12]及高壓提取[13]對(duì)魚(yú)鱗進(jìn)行處理,設(shè)置超聲功率200 W,溫度50 ℃,處理90 min后,121 ℃高壓處理60 min.

2) 鯛魚(yú)鱗酶解產(chǎn)物制備工藝. 鯛魚(yú)鱗經(jīng)預(yù)處理→調(diào)pH值→加酶酶解→滅酶→離心取上清→冷凍干燥→樣品.

3) 單因素實(shí)驗(yàn). 分別考察液料比、 pH值、 溫度、 酶底比、 酶解時(shí)間對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響.

4) 水解度測(cè)定. 采用甲醛滴定法[14].

表1 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)因素與水平Tab.1 Variables and their levels used in the response surface design

5) 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn). 根據(jù)Box-Behnken Design(BBD)原理,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,選取液料比、 酶底比和pH值3個(gè)因素,試驗(yàn)因素及水平如表1所示,以水解度和DPPH自由基清除率為考察目標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì).

6) 抗氧化活性測(cè)定. DPPH自由基清除率的測(cè)定,參照Wu等[15]的方法進(jìn)行； 羥基自由基清除活性,采用Zhang等[16]的方法進(jìn)行測(cè)定； 還原力的測(cè)定,參照GüLCIN等[17]方法進(jìn)行； 金屬螯合率的測(cè)定,采用Dinis等[18]的方法進(jìn)行.

7) 相對(duì)分子質(zhì)量分布測(cè)定. 采用高效液相色譜法進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定, 條件為： Waters TM650E高效液相色譜儀(配2487 UV檢測(cè)器和M32 工作站)； 色譜柱： TSKgel 2000 SWXL(300 mm×7.8 mm)； 流動(dòng)相： 乙腈∶水∶三氟乙酸=45∶55∶0.1(體積比)； 檢測(cè)波長(zhǎng)： 220 nm； 流速： 0.5 mL·min-1； 柱溫： 30 ℃.

8) 氨基酸組成分析. 參照《食品中氨基酸的測(cè)定(GB/T 5009.124-2003)》[19]進(jìn)行.

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Office 2007、 Design-Expert 8.0.6、 SPSS Statistics等軟件處理數(shù)據(jù),結(jié)果為3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值.

2 結(jié)果與討論

2.1 酶的篩選

圖1 不同蛋白酶酶解后的水解度及DPPH自由基清除率Fig.1 Effect of different enzymes on degree of hydrolysis and DPPH free radical scavenging rate

在各個(gè)蛋白酶所推薦的最適溫度和pH值條件下,按E/S 4.0%,液料比50∶1,酶解6 h,所得結(jié)果如圖1所示. 由圖1可知,經(jīng)5種不同蛋白酶酶解后,酶解液的DPPH自由基清除率依次為： 堿性蛋白酶、 木瓜蛋白酶、 酸性蛋白酶、 中性蛋白酶、 復(fù)合風(fēng)味蛋白酶,水解度由大到小依次為： 復(fù)合風(fēng)味蛋白酶、 堿性蛋白酶、 木瓜蛋白酶、 中性蛋白酶、 酸性蛋白酶. 這是由于不同蛋白酶對(duì)魚(yú)鱗蛋白的酶切位點(diǎn)不同,使得酶解產(chǎn)物暴露出的氨基酸片段種類(lèi)及數(shù)量有所不同,進(jìn)而導(dǎo)致酶解產(chǎn)物的抗氧化活性有所差別[20]. 綜合考慮,選用堿性蛋白酶作為鯛魚(yú)鱗蛋白酶促水解的酶切工具.

2.2 不同條件對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響

2.2.1 液料比對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響

使用堿性蛋白酶在溫度50 ℃,pH值8.0,E/S 7.0%的條件下,酶解6 h,比較不同的液料比對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響,所得結(jié)果如圖2所示. 體系的分散度受液料比的影響,由圖2可知,在液料比為10∶1,20∶1,30∶1,40∶1,50∶1的條件下,經(jīng)酶解后所得酶解液的水解度和DPPH自由基清除率總體呈先上升后下降的趨勢(shì),在液料比為30∶1時(shí),所得酶解液的水解度和DPPH自由基清除率均達(dá)到最大,表明在此條件下,酶與魚(yú)鱗蛋白接觸較充分,有利于酶促反應(yīng)進(jìn)行. 因此,將后續(xù)酶解工藝優(yōu)化所用液料比確定為30∶1.

2.2.2 pH值對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響

在液料比為30∶1的條件下,保持其他條件相同,探究不同pH值對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響,所得結(jié)果如圖3所示. 由圖3可知,pH值在6.5～9.0的間隔范圍內(nèi),DPPH自由基清除率與水解度為最大時(shí)所對(duì)應(yīng)的pH值并不相同. 在 pH值為7.5時(shí),酶解液的水解度達(dá)到最大,可能是該條件下酶的構(gòu)像與魚(yú)鱗蛋白能有效的契合,促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行,而DPPH自由基清除率則在pH值為 7.0時(shí)出現(xiàn)最大值,可能是在pH值為7.0時(shí),酶解產(chǎn)物所帶電荷對(duì)能促進(jìn)DPPH自由基的清除. 但在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,發(fā)現(xiàn)體系初始pH值接近7.5,因而,將pH值設(shè)定為7.5.

圖2 液料比對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of liquid to material ratio on degree of hydrolysis and DPPH free radical scavenging rate

圖3 pH值對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of pH value on degree of hydrolysis and DPPH free radical scavenging rate

2.2.3 溫度對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響

在液料比為30∶1,pH值為7.5的條件下,保持其他條件相同,探究不同的溫度對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響,所得結(jié)果如圖4所示. 溫度升高,反應(yīng)速率會(huì)加快,但隨著溫度升高,酶變性失活,導(dǎo)致酶促反應(yīng)速率下降,酶對(duì)魚(yú)鱗蛋白酶解所表現(xiàn)的最適溫度是這兩種影響的綜合結(jié)果. 由圖4可知,在酶解溫度為50 ℃時(shí),所得酶解液的水解度最大,且在該溫度下,酶解液所對(duì)應(yīng)的DPPH自由基清除率也達(dá)到最大值,表明酶對(duì)鯛魚(yú)鱗蛋白酶促水解的最適溫度為50 ℃,且此時(shí)活性最大. 因此,將后續(xù)酶解的溫度設(shè)定為50 ℃.

2.2.4 酶底比對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響

在液料比為30∶1,pH值為7.5,50 ℃的條件下,考察不同的E/S對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響,所得結(jié)果如圖5所示. 酶用量影響酶解效率,用量的增加一般會(huì)使效率提高. 由圖5可知,在E/S為1.0%～7.0%間隔區(qū)間范圍內(nèi),隨著E/S的增加,水解度及DPPH自由基清除率明顯增加. 在E/S為7.0%時(shí),繼續(xù)增大加酶量,酶解物的水解度和DPPH自由基清除率增加緩慢且逐漸趨近于平緩. 考慮酶促水解的效果及經(jīng)濟(jì)效益,選用E/S為7.0%較為適宜.

圖4 酶解溫度對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effect of temperature on degree of hydrolysis and DPPH free radical scavenging rate

圖5 酶底比對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.5 Effect of E/S ratio on degree of hydrolysis and DPPH free radical scavenging rate

2.2.5 酶解時(shí)間對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響

圖6 酶解時(shí)間對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis time on degree of hydrolysis and DPPH free radical scavenging rate

在液料比為30∶1,pH值為7.5,50 ℃,E/S7.0%條件下,考察酶解時(shí)間對(duì)水解度和DPPH自由基清除率的影響,所得結(jié)果如圖6所示. 由圖6可知,隨著酶促水解時(shí)間的延長(zhǎng),水解度的變化呈上升趨勢(shì),在10 h后趨近平緩. 但在6～10 h范圍內(nèi),DPPH自由基清除活性并沒(méi)有大幅度提升,而10 h后DPPH自由基清除率表現(xiàn)出下降的趨勢(shì),這可能是水解度增大,組成酶解液中多肽片段的氨基酸協(xié)同作用不利于DPPH自由基的清除,從而表現(xiàn)出DPPH自由基清除率的降低. 考慮儀器設(shè)備的使用狀況,把酶解反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為6 h.

2.3 響應(yīng)面分析

2.3.1 模型的建立及顯著性檢驗(yàn)

以DPPH自由基清除率和水解度為響應(yīng)值,采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)原理設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),所得結(jié)果如表2所示. 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸模型的方差分析,所得DPPH自由基清除率和水解度的回歸模型方差分析如表3、 4所示.

表2 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 Experimental design and results for response surface analysis

續(xù)表2 Continue table 2

表3 DPPH自由基清除率回歸模型的方差分析Tab.3 ANOVA for response surface quadratic model of DPPH free radical scavenging rate

注：P<0.001 表示極顯著***；P<0.01表示較顯著**；P<0.05 表示顯著*；P>0.05 表示不顯著

表4 水解度回歸模型方差分析Tab.4 ANOVA for response surface quadratic model of DH

注：P<0.001 表示極顯著***；P<0.01表示較顯著**；P<0.05 表示顯著*；P>0.05 表示不顯著

由軟件分析得DPPH自由基清除率與各因素的回歸方程為： DPPH自由基清除率(%)= 81.03-1.79A+6.84B+0.83C-0.16AB+1.42AC-0.66BC-4.35A2-1.66B2+1.17C2,由表3可知,一次項(xiàng)A、B,二次項(xiàng)A2、B2對(duì)DPPH自由基清除率的影響顯著,交互項(xiàng)對(duì)DPPH自由基清除率的影響不顯著,且該方程相關(guān)系數(shù)R2=0.978 6,表明僅有2.14%響應(yīng)值變化不能用該模型解釋,此外,P<0.000 1,即該模型顯著,且失擬項(xiàng)不顯著,因而,該方程與實(shí)際擬合較好,可用于預(yù)測(cè)酶解過(guò)程中酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除活性.

2.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化和驗(yàn)證

綜合考慮水解度和DPPH自由基清除率兩個(gè)衡量指標(biāo)優(yōu)化酶解條件,控制水解度在10%,DPPH在81%,選取鯛魚(yú)鱗酶解工藝優(yōu)化的條件為： 液料比27.7 ∶1,E/S=6.95%,pH=7.29,為便于實(shí)際操作,將參數(shù)進(jìn)一步調(diào)整為： 液料比28∶1,酶底比7.0%,pH 值7.3進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證,試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值,所得酶解液DPPH自由基清除率為(82.33±1.03)%,水解度為(10.35±0.12)%,與理論值接近,證明了方程的可靠性及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的有效性. 此外,未酶解液的DPPH自由基清除率為14.15%,表明經(jīng)酶解后抗氧化活性有了顯著性提高(P<0.001).

2.4 抗氧化活性分析

酶解液經(jīng)冷凍干燥后,進(jìn)行DPPH自由基、 羥基自由基清除活性、 還原力以及金屬螯合率測(cè)定來(lái)表征酶解產(chǎn)物的體外抗氧化活性,所得結(jié)果如圖7所示.

酶促水解產(chǎn)物的抗氧化實(shí)驗(yàn)表明其抗氧化活性與酶解液的質(zhì)量濃度呈劑量依賴(lài)性. 如圖7(a)所示,酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率隨酶解液質(zhì)量濃度的上升而增強(qiáng),其IC50(半數(shù)清除質(zhì)量濃度)為2.33 mg·mL-1,說(shuō)明酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力； 圖7(b)為酶解產(chǎn)物對(duì)羥基自由基的清除率,其IC50為4.27 mg·mL-1. 圖7(c)為還原力測(cè)試,隨著酶解液質(zhì)量濃度的增高,還原力也不斷增高,在測(cè)試范圍內(nèi)呈正相關(guān),表現(xiàn)出一定的還原性,在酶解液質(zhì)量濃度為6.0 mg·mL-1時(shí),其吸光值為0.4. 圖7(d)為酶解物的金屬螯合率,隨酶解液質(zhì)量濃度的上升呈上升趨勢(shì),當(dāng)質(zhì)量濃度為6.0 mg·mL-1時(shí),金屬螯合率僅為29.49%,這可能是魚(yú)鱗本身含有羥基磷灰石,在酶促水解過(guò)程中釋放出鈣離子,并與多肽片段結(jié)合,使得金屬結(jié)合位點(diǎn)被占據(jù),從而表現(xiàn)出較低的外來(lái)金屬螯合率.

圖7 不同質(zhì)量濃度酶解物的抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activity of hydrolysate at different concentration

2.5 相對(duì)分子質(zhì)量分布測(cè)定

圖8為鯛魚(yú)鱗酶解產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量分布圖,酶解產(chǎn)物中存在多種大小不等的肽片段,相對(duì)分子質(zhì)量集中分布在5 ku以下,其中相對(duì)分子質(zhì)量為180～1 000 u的占70.29%,表明酶解產(chǎn)物中具有較多的寡肽,這與楊立等[8]的結(jié)果相類(lèi)似,而小分子肽片段可產(chǎn)生離子化的氨基和羧基,易于提供電子或氫原子,從而終止自由基介質(zhì)導(dǎo)的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[11],有利于酶解產(chǎn)物展現(xiàn)其抗氧化活性.

圖8 酶解產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量分布圖Fig.8 Molecular weight distribution of the hydrolysate measured by HPLC

2.6 氨基酸組成分析

將制備得到的鯛魚(yú)鱗酶解產(chǎn)物進(jìn)行氨基酸組成測(cè)定后,所得結(jié)果如表5所示. 由表5可知,鯛魚(yú)鱗酶解產(chǎn)物氨基酸組成豐富,其中甘氨酸質(zhì)量百分含量最高,占所有氨基酸組成中的32.98%,其次為丙氨酸(12.85%)、 脯氨酸(10.41%),羥脯氨酸(7.14%),表明酶解產(chǎn)物中含有的膠原肽質(zhì)量百分含量較多,而丙氨酸、 脯氨酸、 羥脯氨酸等對(duì)自由基清除具有較好的效果,因而,酶解產(chǎn)物表現(xiàn)出一定的抗氧化活性[21-22]. 此外,鯛魚(yú)鱗酶解產(chǎn)物中谷氨酸、 精氨酸、 天冬氨酸、 絲氨酸的質(zhì)量百分含量也較高,占氨基酸總量比分別為： 7.69%、 4.71%、 4.59%、 4.31%. 酶解物中含有除色氨酸外的7種人體所必需的氨基酸,其總質(zhì)量百分含量占13.75%,可作為優(yōu)質(zhì)的海洋多肽源.

表5 鯛魚(yú)鱗多肽氨基酸組成Tab.5 Amino acid composition of Snapper scales peptides (%)

3 結(jié)語(yǔ)

1) 經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)后在液料比28∶1,酶底比為7.0%,pH值為7.3條件下,酶解6 h,所得酶解液的水解度為10.35%,DPPH自由基清除率為82.33%.

2) 抗氧化實(shí)驗(yàn)表明,酶解產(chǎn)物的抗氧化活性與酶解物的濃度呈劑量依賴(lài)性,其中DPPH自由基清除率的IC50為2.33 mg·mL-1,羥基自由基的清除率IC50為4.27 mg·mL-1,同時(shí)表現(xiàn)出一定的還原力和金屬螯合率.

3) 鯛魚(yú)鱗酶解產(chǎn)物中主要為寡肽,其氨基酸組成豐富,含有多種人體所必需的氨基酸.

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