張志燦,楊曉婷,林 棟
(福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院,福建 福州 350122)
隨著社會醫(yī)療的不斷發(fā)展,近年來出現(xiàn)了許多關(guān)于智力落后、精神發(fā)育不全或精神發(fā)育遲滯等相關(guān)研究。精神發(fā)育遲滯多數(shù)發(fā)生于嬰幼兒期,而脆性 X綜合癥(fragile x syndrome,F(xiàn)RX)是常見的遺傳性智力發(fā)育遲緩疾病,其主要癥狀是神經(jīng)突觸發(fā)育的各種異常,如樹突棘異常,突觸之間的連接對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性有重要作用[1-2]。實驗研究表明,針刺長強穴可以改善自閉癥模型大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力,同時針灸治療精神發(fā)育遲滯有著較好的臨床療效[3-4]。在針灸的作用機制研究中,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)原件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)具有調(diào)節(jié)神經(jīng)元功能和結(jié)構(gòu)的可塑性的作用[5],CREB信號通路參與長時程的易化,使得學(xué)習(xí)記憶出現(xiàn)活動依賴性[6]。此外,CREB信號通路還參與了神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展過程[7]。結(jié)合課題組的前期工作,本研究采用脆性X智力低下1(fragile X mental retardation 1,F(xiàn)MR1)基因敲除小鼠,這種小鼠具有智力低下、焦慮煩躁及易被激惹的特點[8-9]。本論文通過觀察該小鼠的自主行為學(xué)及皮質(zhì)區(qū)CREB蛋白表達水平,探討電針長強穴對FMR1基因敲除小鼠皮質(zhì)功能的影響。
1.1 實驗動物 FMR1基因敲除型小鼠24只,由福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。于19日齡對小鼠進行剪耳、分籠、取血并鑒定基因型。本研究動物在福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心按SPF級環(huán)境喂養(yǎng)。
1.2 實驗試劑 免疫印跡一抗CREB,免疫印跡二抗 Goat Anti-Rabbit IgG(Cell Signaling Technology);BCA法測定蛋白質(zhì)濃度[生工生物工程(上海)股份有限公司];顯影液(MXB Biotechnologies)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。
1.3 實驗儀器 SW-CJ-ID潔凈工作臺(蘇州江東精密儀器有限公司);DC-1020型電熱恒溫水槽(上海平軒科學(xué)儀器有限公司);DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(上海譜振生物科技有限公司);VE-180垂直電泳槽(上海郎賦實業(yè)有限公司);GG/D2凝膠成像系統(tǒng)(Gene Genius公司);HANS-200A韓氏穴位神經(jīng)刺激儀(北京華運安特科技有限責任公司);RM2235切片機(徠卡微系統(tǒng)有限公司);ZZ-6小鼠自主活動測試儀(上海欣曼科教設(shè)備有限公司);凝膠成像分析儀(美國BIO-RAD公司);TD4XD離心機(上海盧湘儀離心機儀器有限公司);華佗牌0.25 mm×3 mm毫針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)。
2.1 分組和干預(yù) 根據(jù)基因鑒定結(jié)果,將23日齡的小鼠隨機分為空白組、電針非穴組、電針長強穴組各8只。選取華佗牌30號1寸毫針,長強穴組于尾根與肛門之間的凹陷中進針,進針方向沿小鼠尾根部下方向前直刺,進針深度約10 mm;電針非穴組于肋弓最低點上1 cm進針。2組均采用韓氏電針儀連接針灸針,刺激參數(shù)為2 Hz頻率,連續(xù)波,強度為1~3 mA,以小鼠局部肌肉輕微抖動且無明顯掙扎為度,持續(xù)時間20 min,進針及留針期間將小鼠以黑布蒙頭,以雙手適度束縛??瞻捉M除模擬針刺過程中的抓取動作外,不進行其他操作。各組小鼠均連續(xù)干預(yù)14 d,于第15 d取材。
2.2 自主行為學(xué)檢測 分別于干預(yù)前2天(T1)、干預(yù)結(jié)束前2天(T2)進行自主行為學(xué)檢測。將3組小鼠依次放入自主活動測試儀中,適應(yīng)環(huán)境5 min后開始啟動機器,時間為10 min,檢測后記錄活動數(shù)及清算黑格里的糞便數(shù)。
2.3 皮質(zhì)區(qū)CREB蛋白表達 取出FMR1基因敲除型小鼠的皮質(zhì)腦區(qū),采用Western blot印跡法檢測CREB蛋白表達水平,用自動凝膠成像系統(tǒng)Chemi Imager 5500V2.03軟件進行掃描,用Fluor Chen 2.0軟件進行定量分析測得IDV值(integrated density value)。
2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0進行統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)分布以()表示,采用單因素方差分析。
3.1 3組小鼠自主行為學(xué)情況比較 見表1。
表1 3組小鼠自主行為學(xué)情況比較()
表1 3組小鼠自主行為學(xué)情況比較()
注:與空白組比較,1) P<0.05;與電針非穴組比較,2) P<0.05。
組別空白組電針非穴組電針長強穴組n 8 8 8 T1 124.00±12.00 129.00±10.00 129.00±13.00活動量/次 糞便數(shù)/個T2 124.00±6.00 138.00±8.00 156.00±13.001)2)T1 4.38±1.60 4.44±1.27 4.19±1.07 T2 4.25±1.46 4.56±0.94 5.19±1.33
3.2 3組小鼠皮質(zhì)區(qū)CREB蛋白表達的比較 見圖 2、表 2。
圖2 3組小鼠皮質(zhì)區(qū)CREB蛋白電泳圖
表2 3組小鼠皮質(zhì)區(qū)CREB蛋白表達比較()
表2 3組小鼠皮質(zhì)區(qū)CREB蛋白表達比較()
注:與空白組比較,1) P<0.05;與電針非穴組比較,2) P<0.05。
CREB/β-actin 1.82±1.90 2.41±1.85 5.76±3.511)2)組別空白組電針非穴組電針長強穴組n 8 8 8
《靈樞》記載:“督脈之別,名曰長強……入貫?zāi)o,實則脊強,虛則頭痛?!保?0]古人以長強穴作為治療腦部疾病的重要穴位。在臨床研究中發(fā)現(xiàn),針灸長強穴能在一定程度上改善精神發(fā)育遲滯兒童的學(xué)習(xí)記憶能力。目前,長強穴已經(jīng)被作為治療精神發(fā)育遲滯、抑郁癥等認知障礙疾病的治療要穴。有研究顯示電針能促進腦缺血損傷后神經(jīng)遞質(zhì)的恢復(fù),改善認知障礙,增強學(xué)習(xí)記憶能力[11]。也有研究顯示電針承山與長強能起到一定的鎮(zhèn)痛作用,可能與神經(jīng)修復(fù)有關(guān)[12]。因此本研究探討電針長強穴對FMR1基因敲除小鼠自主行為學(xué)及CREB蛋白的影響。實驗結(jié)果表明,干預(yù)后電針長強組較其他組活動數(shù)明顯增加,同時電針長強穴的FMR1基因敲除小鼠CREB蛋白表達增強,提示電針FMR1基因敲除小鼠的長強穴在某種程度上能夠提高小鼠皮質(zhì)運動系統(tǒng)的興奮性而表現(xiàn)為活動數(shù)增加,而這一效應(yīng)則有可能通過對CREB蛋白表達的提高得以實現(xiàn)。有研究發(fā)現(xiàn)電針改善AD小鼠重新恢復(fù)突觸功能,最終提高AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力[13-16]。而突觸的連接能夠影響反射的感覺和運動神經(jīng)元,其中CREB磷酸化對長時程易化過程起到至關(guān)重要的作用。因此,CREB蛋白表達的提高,對神經(jīng)元的應(yīng)激及再生有著關(guān)鍵的作用,并有可能通過與神經(jīng)營養(yǎng)因子等相關(guān)信號分子的相互作用,對精神發(fā)育遲滯等疾病發(fā)揮作用。
綜上所述,電針長強穴可以增加FMR1基因敲除小鼠的活動量及其皮質(zhì)CREB蛋白的表達量,為我們后續(xù)開展針刺FMR1基因敲除小鼠長強穴對損傷神經(jīng)元影響的機制探索提供實驗數(shù)據(jù)。
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