張志燦，楊曉婷，林 棟

（福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院，福建 福州 350122）

隨著社會醫(yī)療的不斷發(fā)展，近年來出現(xiàn)了許多關(guān)于智力落后、精神發(fā)育不全或精神發(fā)育遲滯等相關(guān)研究。精神發(fā)育遲滯多數(shù)發(fā)生于嬰幼兒期，而脆性 X綜合癥（fragile x syndrome，F(xiàn)RX）是常見的遺傳性智力發(fā)育遲緩疾病，其主要癥狀是神經(jīng)突觸發(fā)育的各種異常，如樹突棘異常，突觸之間的連接對于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性有重要作用［1-2］。實(shí)驗研究表明，針刺長強(qiáng)穴可以改善自閉癥模型大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力，同時針灸治療精神發(fā)育遲滯有著較好的臨床療效［3-4］。在針灸的作用機(jī)制研究中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)原件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）具有調(diào)節(jié)神經(jīng)元功能和結(jié)構(gòu)的可塑性的作用［5］，CREB信號通路參與長時程的易化，使得學(xué)習(xí)記憶出現(xiàn)活動依賴性［6］。此外，CREB信號通路還參與了神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展過程［7］。結(jié)合課題組的前期工作，本研究采用脆性X智力低下1（fragile X mental retardation 1，F(xiàn)MR1）基因敲除小鼠，這種小鼠具有智力低下、焦慮煩躁及易被激惹的特點(diǎn)［8-9］。本論文通過觀察該小鼠的自主行為學(xué)及皮質(zhì)區(qū)CREB蛋白表達(dá)水平，探討電針長強(qiáng)穴對FMR1基因敲除小鼠皮質(zhì)功能的影響。

1 實(shí)驗材料

1.1 實(shí)驗動物 FMR1基因敲除型小鼠24只，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗動物中心提供。于19日齡對小鼠進(jìn)行剪耳、分籠、取血并鑒定基因型。本研究動物在福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗動物中心按SPF級環(huán)境喂養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗試劑 免疫印跡一抗CREB，免疫印跡二抗 Goat Anti-Rabbit IgG（Cell Signaling Technology）；BCA法測定蛋白質(zhì)濃度［生工生物工程（上海）股份有限公司］；顯影液（MXB Biotechnologies）、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）。

1.3 實(shí)驗儀器 SW-CJ-ID潔凈工作臺（蘇州江東精密儀器有限公司）；DC-1020型電熱恒溫水槽（上海平軒科學(xué)儀器有限公司）；DYY-8型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（上海譜振生物科技有限公司）；VE-180垂直電泳槽（上海郎賦實(shí)業(yè)有限公司）；GG／D2凝膠成像系統(tǒng)（Gene Genius公司）；HANS-200A韓氏穴位神經(jīng)刺激儀（北京華運(yùn)安特科技有限責(zé)任公司）；RM2235切片機(jī)（徠卡微系統(tǒng)有限公司）；ZZ-6小鼠自主活動測試儀（上海欣曼科教設(shè)備有限公司）；凝膠成像分析儀（美國BIO-RAD公司）；TD4XD離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；華佗牌0.25 mm×3 mm毫針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）。

2 實(shí)驗方法

2.1 分組和干預(yù) 根據(jù)基因鑒定結(jié)果，將23日齡的小鼠隨機(jī)分為空白組、電針非穴組、電針長強(qiáng)穴組各8只。選取華佗牌30號1寸毫針，長強(qiáng)穴組于尾根與肛門之間的凹陷中進(jìn)針，進(jìn)針方向沿小鼠尾根部下方向前直刺，進(jìn)針深度約10 mm；電針非穴組于肋弓最低點(diǎn)上1 cm進(jìn)針。2組均采用韓氏電針儀連接針灸針，刺激參數(shù)為2 Hz頻率，連續(xù)波，強(qiáng)度為1～3 mA，以小鼠局部肌肉輕微抖動且無明顯掙扎為度，持續(xù)時間20 min，進(jìn)針及留針期間將小鼠以黑布蒙頭，以雙手適度束縛?？瞻捉M除模擬針刺過程中的抓取動作外，不進(jìn)行其他操作。各組小鼠均連續(xù)干預(yù)14 d，于第15 d取材。

2.2 自主行為學(xué)檢測 分別于干預(yù)前2天（T1）、干預(yù)結(jié)束前2天（T2）進(jìn)行自主行為學(xué)檢測。將3組小鼠依次放入自主活動測試儀中，適應(yīng)環(huán)境5 min后開始啟動機(jī)器，時間為10 min，檢測后記錄活動數(shù)及清算黑格里的糞便數(shù)。

2.3 皮質(zhì)區(qū)CREB蛋白表達(dá) 取出FMR1基因敲除型小鼠的皮質(zhì)腦區(qū)，采用Western blot印跡法檢測CREB蛋白表達(dá)水平，用自動凝膠成像系統(tǒng)Chemi Imager 5500V2.03軟件進(jìn)行掃描，用Fluor Chen 2.0軟件進(jìn)行定量分析測得IDV值（integrated density value）。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)分布以（）表示，采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 3組小鼠自主行為學(xué)情況比較 見表1。

表1 3組小鼠自主行為學(xué)情況比較（）

表1 3組小鼠自主行為學(xué)情況比較（）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與電針非穴組比較，2） P＜0.05。

組別空白組電針非穴組電針長強(qiáng)穴組n 8 8 8 T1 124.00±12.00 129.00±10.00 129.00±13.00活動量／次 糞便數(shù)／個T2 124.00±6.00 138.00±8.00 156.00±13.001）2）T1 4.38±1.60 4.44±1.27 4.19±1.07 T2 4.25±1.46 4.56±0.94 5.19±1.33

3.2 3組小鼠皮質(zhì)區(qū)CREB蛋白表達(dá)的比較 見圖 2、表 2。

圖2 3組小鼠皮質(zhì)區(qū)CREB蛋白電泳圖

表2 3組小鼠皮質(zhì)區(qū)CREB蛋白表達(dá)比較（）

表2 3組小鼠皮質(zhì)區(qū)CREB蛋白表達(dá)比較（）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與電針非穴組比較，2） P＜0.05。

CREB／β-actin 1.82±1.90 2.41±1.85 5.76±3.511）2）組別空白組電針非穴組電針長強(qiáng)穴組n 8 8 8

4 討論

《靈樞》記載：“督脈之別，名曰長強(qiáng)……入貫?zāi)o，實(shí)則脊強(qiáng)，虛則頭痛?！保?0］古人以長強(qiáng)穴作為治療腦部疾病的重要穴位。在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，針灸長強(qiáng)穴能在一定程度上改善精神發(fā)育遲滯兒童的學(xué)習(xí)記憶能力。目前，長強(qiáng)穴已經(jīng)被作為治療精神發(fā)育遲滯、抑郁癥等認(rèn)知障礙疾病的治療要穴。有研究顯示電針能促進(jìn)腦缺血損傷后神經(jīng)遞質(zhì)的恢復(fù)，改善認(rèn)知障礙，增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力［11］。也有研究顯示電針承山與長強(qiáng)能起到一定的鎮(zhèn)痛作用，可能與神經(jīng)修復(fù)有關(guān)［12］。因此本研究探討電針長強(qiáng)穴對FMR1基因敲除小鼠自主行為學(xué)及CREB蛋白的影響。實(shí)驗結(jié)果表明，干預(yù)后電針長強(qiáng)組較其他組活動數(shù)明顯增加，同時電針長強(qiáng)穴的FMR1基因敲除小鼠CREB蛋白表達(dá)增強(qiáng)，提示電針FMR1基因敲除小鼠的長強(qiáng)穴在某種程度上能夠提高小鼠皮質(zhì)運(yùn)動系統(tǒng)的興奮性而表現(xiàn)為活動數(shù)增加，而這一效應(yīng)則有可能通過對CREB蛋白表達(dá)的提高得以實(shí)現(xiàn)。有研究發(fā)現(xiàn)電針改善AD小鼠重新恢復(fù)突觸功能，最終提高AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力［13-16］。而突觸的連接能夠影響反射的感覺和運(yùn)動神經(jīng)元，其中CREB磷酸化對長時程易化過程起到至關(guān)重要的作用。因此，CREB蛋白表達(dá)的提高，對神經(jīng)元的應(yīng)激及再生有著關(guān)鍵的作用，并有可能通過與神經(jīng)營養(yǎng)因子等相關(guān)信號分子的相互作用，對精神發(fā)育遲滯等疾病發(fā)揮作用。

綜上所述，電針長強(qiáng)穴可以增加FMR1基因敲除小鼠的活動量及其皮質(zhì)CREB蛋白的表達(dá)量，為我們后續(xù)開展針刺FMR1基因敲除小鼠長強(qiáng)穴對損傷神經(jīng)元影響的機(jī)制探索提供實(shí)驗數(shù)據(jù)。

［1］ 吳強(qiáng)，陳麗云，張學(xué)君.X染色體上脆性X智力低下基因1敲除模型小鼠針刺長強(qiáng)穴學(xué)習(xí)記憶及海馬CA1區(qū)γ-氨基丁酸A型受體α1亞基表達(dá)的影響［J］.中國組織工程研究，2015，19（49）：7964-7968.

［2］ 韓平，俞萍，陳可愛，等.針刺長強(qiáng)穴對FMR1基因敲除小鼠海馬CA1區(qū)BDNF和SYN表達(dá)的影響［J］.福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，22（5）：14-18.

［3］ 陳蘭芳，張學(xué)君，林棟，等.電針長強(qiáng)穴對FMR1基因敲除小鼠海馬CA1區(qū)PSD-95、CREB蛋白表達(dá)的影響［J］.康復(fù)學(xué)報，2015，25（4）：18-21，26.

［4］ 張晨驥，張學(xué)君，陳蘭芳，等.電針“長強(qiáng)”穴對FMR1基因敲除小鼠海馬CA1區(qū)NLGN-3蛋白表達(dá)的影響［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2017，44（4）：858-861.

［5］ 符文彬，劉健華，白艷甫，等.電針對抑郁癥大鼠海馬CREBBDNF受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用［J］.中國老年學(xué)雜志，2009，29（23）：3038-3042.

［6］ 葛軍，張玉，鄭增長，等.CREB轉(zhuǎn)錄因子及其磷酸化信號通路的研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（30）：16769-16771，16774.

［7］ 宋海龍，鄭焱，王曉民.CREB信號通路在神經(jīng)系統(tǒng)中的調(diào)控及功能［J］.中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2013，29（9）：797-804.

［8］ ILIFF A J，RENOUX A J，KRANS A，et al.Impaired activitydependent FMRP translation and enhanced mGluR-dependent LTD in Fragile X premutation mice ［J］.Hum Mol Genet，2013，22（6）：1180-1192.

［9］ BUDNIK V，SALINAS P C.Wnt signaling during synaptic development and plasticity ［J］.Curr Opin Neurobiol，2011，21（1）：151-159.

［10］周波蘭，李應(yīng)昆.淺論長強(qiáng)穴臨床妙用［J］.針灸臨床雜志，2009，25（5）：53-54.

［11］張會珍，梁玉磊，張雪靜，等.不同時間電針對血管性癡呆小鼠行為學(xué)及海馬單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響［J］.針刺研究，2014，39（2）：142-147.

［12］李寧，何洪波，王成偉，等.電針承山、長強(qiáng)穴治療痔瘡疼痛療效觀察［J］.中國針灸，2008，28（11）：792-794.

［13］盧圣鋒，邵欣，唐勇，等.電針促進(jìn)阿爾茨海默病模型小鼠（SAMP8）海馬神經(jīng)元突觸可塑性的神經(jīng)細(xì)胞黏附機(jī)制［J］.中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2008，23（12）：1057-1060.

［14］張學(xué)君，陳蘭芳，張晨驥.針刺長強(qiáng)穴對FMR1基因敲除小鼠海馬 PSD-95蛋白表達(dá)的影響［J］.時珍國醫(yī)國藥，2016，27（6）：1533-1535.

［15］張學(xué)君，吳強(qiáng).電針督脈不同穴對自閉癥模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬CA1區(qū)PSD-95蛋白表達(dá)的影響［J］.中國針灸，2013，33（7）：627-631.

［16］趙建新，田元祥，曹剛，等.電針腎俞、膈俞、百會穴對擬血管性癡呆小鼠腦組織SOD活力、MDA含量的影響［J］.中國中醫(yī)藥科技，2000，7（2）：65-66.