周 勇，施 紅，林心君，余文珍

（福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122）

據(jù)WHO數(shù)據(jù)顯示1994年糖尿病患者人數(shù)為1.2億，2014年全世界有3.87億糖尿病患者，預(yù)計(jì)到2025年全球?qū)⑼黄?0億人［1］。隨著糖尿病發(fā)病率不斷攀升，死亡率也隨之升高。眾所周知，在糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中，并發(fā)癥也相繼出現(xiàn)，如視網(wǎng)膜病變、肝腎病變及周圍神經(jīng)病變等。以往關(guān)于糖尿病相關(guān)并發(fā)癥研究較多，近幾年T2DM合并肝損傷逐漸引起相關(guān)人士關(guān)注，大量研究表明T2DM會(huì)增加肝臟發(fā)生纖維化并進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化或肝癌的風(fēng)險(xiǎn)，其成為了糖尿病死亡率升高的一個(gè)重要因素［2］。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 36只SPF級(jí)Wistar雄性大鼠，體質(zhì)量（105±5）g。由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，許可證號(hào)：SCXK（滬）2012—0002。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物和試劑 石斛合劑序貫方（石斛、黃芪、五味子、丹參、川牛膝、生地黃、地龍等）購(gòu)自福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院；鹽酸二甲雙胍片（山東明仁福瑞達(dá)制藥有限公司）；鏈脲佐菌素（STZ，美國(guó)Sigma公司）；玉米油、CCl4（上海麥克林生化科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 尼康生物顯微鏡（日本尼康公司，55I）；低溫離心機(jī)（美國(guó) Thermo 公司，Multifuge X3R）；分析天平（奧豪斯儀器有限公司，CP214）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 石斛合劑序貫方湯劑的制備 石斛合劑序貫方（1方、2方）以常規(guī)水煎2次后合并、過濾。采用旋轉(zhuǎn)濃縮，配制成石斛合劑1方含生藥量1.7 g／mL、石斛合劑 2 方 1 g／mL。

2.2 動(dòng)物模型的建立 將36只大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)抽取 8只作為正常對(duì)照組，其他大鼠先予高糖高脂飼料 （含60.7%基礎(chǔ)飼料、15%蔗糖、10%豬油、10%蛋黃粉、4%膽固醇、0.3%膽酸鹽）飼養(yǎng)42 d后，繼以低劑量STZ（25 mg／kg，檸檬酸緩沖液配制，pH＝4.2～4.6，現(xiàn)配現(xiàn)用）一次性腹腔注射，繼予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，于注射第4、5天用微量血糖測(cè)定儀測(cè)量空腹血糖，篩選出2次連續(xù)測(cè)量血糖≥11.1 mmol／L的大鼠，即為糖尿病模型大鼠，不滿足者剔除。糖尿病模型成功后再按大鼠體質(zhì)量0.2 mL／100 g皮下注射40%CCl4，每周2次，共 6周，建立糖尿病合并肝纖維化模型大鼠。

2.3 分組及干預(yù) 糖尿病模型大鼠按體質(zhì)量和血糖進(jìn)行隨機(jī)分層分組，分為模型對(duì)照組、二甲雙胍組、石斛合劑組各8只。石斛合劑組為先予石斛合劑 1 方按 17 g／（kg·d）灌胃 6 d，繼予石斛合劑 2 方按 10 g／（kg·d）灌胃 3 d，如此循環(huán)；二甲雙胍組予二甲雙胍按 0.1 g／（kg·d）灌胃；正常對(duì)照組、模型對(duì)照組予等量生理鹽水灌胃。4組均灌胃干預(yù)6周。

2.4 觀測(cè)指標(biāo)

2.4.1 血糖 采用尾靜脈采血，檢測(cè)4組大鼠灌胃干預(yù)前后的血糖。

2.4.2 血清AST、ALT濃度 采用紫外比色法測(cè)定4組大鼠灌胃干預(yù)前后血清AST、ALT濃度。

2.4.3 肝臟HE染色及Masson染色 采用HE染色及Masson染色觀察4組大鼠干預(yù)后肝臟組織形態(tài)。取肝臟常規(guī)石蠟包埋切片，觀察肝細(xì)胞排列及膠原纖維的表達(dá)量。

2.4.4 肝纖維化四項(xiàng) 采用ELISA法檢測(cè)4組大鼠干預(yù)后血清肝纖維化四項(xiàng)（HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ）。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（）表示，采用單因素方差分析，非正態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 4組干預(yù)前后血糖濃度比較 見表1。

表1 4組干預(yù)前后血糖濃度比較（）mmol／L

表1 4組干預(yù)前后血糖濃度比較（）mmol／L

注：與正常對(duì)照組比較，1）P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，2）P＜0.01；與干預(yù)前比較，3） P＜0.01。

干預(yù)后4.78±0.41 19.80±4.761）7.10±1.852）3）6.56±4.882）3）組 別正常對(duì)照組模型對(duì)照組石斛合劑組二甲雙胍組n 8 8 8 8干預(yù)前4.76±0.37 21.12±6.571）17.35±7.251）21.68±6.571）

3.2 4組干預(yù)后AST、ALT濃度比較 見表2。

表2 4組治療后AST、ALT濃度比較（）mmol／L

表2 4組治療后AST、ALT濃度比較（）mmol／L

注：與正常對(duì)照組比較，1） P＜0.01，2） P＜0.05；與模型對(duì)照組比較，3） P＜0.01。

ALT 55.26±3.76 165.81±4.501）77.73±6.862）3）91.86±13.242）3）組 別正常對(duì)照組模型對(duì)照組石斛合劑組二甲雙胍組n 8 8 8 8 AST 76.30±5.54 283.10±15.501）108.23±5.722）3）102.76±15.502）3）

3.3 肝臟形態(tài)學(xué)觀察

3.3.1 HE染色 如圖1所示，正常對(duì)照組肝細(xì)胞排列整齊、結(jié)構(gòu)完整；模型對(duì)照組肝細(xì)胞排列紊亂，有大量炎性浸潤(rùn)，且在匯管區(qū)可見大量纖維組織；二甲雙胍組和石斛合劑組炎性浸潤(rùn)減少，纖維組織較模型對(duì)照組明顯減少。

3.3.2 Masson染色 如圖2所示，正常對(duì)照組中央靜脈區(qū)少量膠原纖維沉積；模型對(duì)照組匯管區(qū)合中央靜脈區(qū)有大量膠原纖維沉積；二甲雙胍組與石斛合劑組中央靜脈區(qū)雖仍有膠原纖維沉積，但與模型對(duì)照組比較明顯減少，且石斛合劑組減少更明顯。

3.4 4組干預(yù)后肝纖維四項(xiàng)指標(biāo)比較 見表3。

圖1 4組大鼠肝臟HE染色圖（×20）

圖2 4組大鼠肝臟Masson染色圖（×20）

表3 4組干預(yù)后肝纖維四項(xiàng)指標(biāo)比較（）ng／mL

表3 4組干預(yù)后肝纖維四項(xiàng)指標(biāo)比較（）ng／mL

注：與正常對(duì)照組比較，1） P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，2）P＜0.01。

LN 65.13±6.54 350.51±31.841）79.52±5.942）87.70±8.942）組 別正常對(duì)照組模型對(duì)照組石斛合劑組二甲雙胍組n 8 8 8 8 HA 126.73±9.62 367.95±10.741）175.72±3.821）2）183.00±13.181）2）PC-Ⅲ39.94±1.71 243.46±31.671）48.12±2.552）43.44±3.282）C-Ⅳ70.79±3.38 124.83±47.951）84.46±2.982）81.04±11.772）

4 討論

血糖升高是糖尿病的主要特征，在其發(fā)病的過程中會(huì)產(chǎn)生諸多并發(fā)癥，如視網(wǎng)膜、腎臟、心臟、腦及足等發(fā)生病變，同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生許多有害因子。糖基化終產(chǎn)物在糖尿病患者體內(nèi)過度累積，引起肝組織中氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)而損傷肝細(xì)胞［3］，當(dāng)肝臟受到炎性損傷時(shí)，肝星狀細(xì)胞由靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)。肝星狀細(xì)胞激活后轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞是肝纖維化必經(jīng)途徑，這一觀點(diǎn)得到大多數(shù)人的認(rèn)可，肝星狀細(xì)胞被激活，分泌細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，大量合成α-SMA，最后導(dǎo)致肝纖維化。有研究發(fā)現(xiàn)，肝臟疾病也是糖尿病發(fā)病率較高的一個(gè)并發(fā)癥，糖尿病性肝病發(fā)病率為7.24%，2型糖尿病并發(fā)脂肪肝患病率高達(dá)55%［4-5］。在糖尿病與肝纖維化關(guān)系的廣泛研究中，已有證據(jù)顯示糖尿病是肝纖維化及肝硬化發(fā)生的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素［6-8］。

糖尿病核心病機(jī)是由各種病因引起全身氣機(jī)阻滯，釀生痰濕，郁而化熱，灼傷津液，導(dǎo)致陰虛燥熱，繼而引起痰濕熱交結(jié)，滋生濁毒加重痰濕熱，最終導(dǎo)致陰陽(yáng)兩虛，且瘀血、尤其是經(jīng)脈瘀阻貫穿整個(gè)發(fā)病始終。石斛合劑序貫方由石斛合劑1方和石斛合劑2方組成。石斛合劑1方由石斛、黃芪、丹參、知母、生地、葛根、五味子、地龍等組成，益氣養(yǎng)陰，活血通絡(luò)。石斛中潤(rùn)胃陰，下滋腎陰，滋而不膩；黃芪托毒又補(bǔ)脾肺之氣，兩藥合用，肺脾腎三臟之氣陰同補(bǔ)，上中下三焦兼顧，共為君藥。知母、生地清熱涼血，滋陰生津潤(rùn)燥，壯水制火；丹參活血涼血，祛瘀生新；地龍清熱息風(fēng)，通絡(luò)利尿，共為臣藥。葛根升發(fā)脾胃之清陽(yáng)，生津止渴；五味子斂肺滋腎生津，寧心澀精，一散一收，化而能守，佐助君藥滋陰益氣之功效，共為佐使藥。諸藥相須為用，上中下兼顧，甘溫化氣，酸甘養(yǎng)陰，苦寒清熱，潤(rùn)燥解毒，三消分治兼清瘀血。石斛合劑2方由茵陳、梔子、大黃、柴胡、滑石、甘草等組成，清肝泄?jié)幔謇麧駸?。茵陳清利濕熱，清熱解毒；梔子通利三焦，引濕熱自小便而出，二者共為君藥。大黃煬灶減薪，瀉熱逐瘀，祛其西道壅塞；柴胡疏肝解郁，清其東道邪熱，共為臣藥?；屎瓭B，以佐清利濕熱之力。甘草調(diào)和諸藥。全方藥簡(jiǎn)力專，使二便通利，前后分消，濕熱得行，痰瘀得化，濁毒得去。

本研究通過高脂高糖聯(lián)合腹腔注射STZ及皮下注射CCl4建立糖尿病合并肝纖維化模型。高脂高糖飼喂6周后聯(lián)合小劑量STZ（25 mg／kg）建立糖尿病模型，在此過程中，3只大鼠因空腹血糖＜11.1 mmol／L，不符合糖尿病模型篩選標(biāo)準(zhǔn)，舍去，造模成功率為89.29%；糖尿病成模后，再以2 mL／kg CCl4皮下注射，建立糖尿病合并肝纖維化模型，1只大鼠因皮下注射過程中操作不當(dāng)死亡。經(jīng)過石斛合劑序貫方治療6周后，大鼠空腹血糖、肝功能（AST、ALT）明顯改善，肝纖維化四項(xiàng)也明顯降低，且石斛合劑組優(yōu)于二甲雙胍組。病理活檢是診斷肝纖維化金指標(biāo)，從肝臟組織形態(tài)學(xué)可知石斛合劑組和二甲雙胍組膠原纖維蛋白沉積明顯較模型對(duì)照組減輕，且石斛合劑組減輕更明顯，其具體可能的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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