周 勇,施 紅,林心君,余文珍
(福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院,福建 福州 350122)
據(jù)WHO數(shù)據(jù)顯示1994年糖尿病患者人數(shù)為1.2億,2014年全世界有3.87億糖尿病患者,預(yù)計(jì)到2025年全球?qū)⑼黄?0億人[1]。隨著糖尿病發(fā)病率不斷攀升,死亡率也隨之升高。眾所周知,在糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中,并發(fā)癥也相繼出現(xiàn),如視網(wǎng)膜病變、肝腎病變及周圍神經(jīng)病變等。以往關(guān)于糖尿病相關(guān)并發(fā)癥研究較多,近幾年T2DM合并肝損傷逐漸引起相關(guān)人士關(guān)注,大量研究表明T2DM會(huì)增加肝臟發(fā)生纖維化并進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化或肝癌的風(fēng)險(xiǎn),其成為了糖尿病死亡率升高的一個(gè)重要因素[2]。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 36只SPF級(jí)Wistar雄性大鼠,體質(zhì)量(105±5)g。由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供,許可證號(hào):SCXK(滬)2012—0002。
1.2 實(shí)驗(yàn)藥物和試劑 石斛合劑序貫方(石斛、黃芪、五味子、丹參、川牛膝、生地黃、地龍等)購(gòu)自福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院;鹽酸二甲雙胍片(山東明仁福瑞達(dá)制藥有限公司);鏈脲佐菌素(STZ,美國(guó)Sigma公司);玉米油、CCl4(上海麥克林生化科技有限公司)。
1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 尼康生物顯微鏡(日本尼康公司,55I);低溫離心機(jī)(美國(guó) Thermo 公司,Multifuge X3R);分析天平(奧豪斯儀器有限公司,CP214)。
2.1 石斛合劑序貫方湯劑的制備 石斛合劑序貫方(1方、2方)以常規(guī)水煎2次后合并、過濾。采用旋轉(zhuǎn)濃縮,配制成石斛合劑1方含生藥量1.7 g/mL、石斛合劑 2 方 1 g/mL。
2.2 動(dòng)物模型的建立 將36只大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)抽取 8只作為正常對(duì)照組,其他大鼠先予高糖高脂飼料 (含60.7%基礎(chǔ)飼料、15%蔗糖、10%豬油、10%蛋黃粉、4%膽固醇、0.3%膽酸鹽)飼養(yǎng)42 d后,繼以低劑量STZ(25 mg/kg,檸檬酸緩沖液配制,pH=4.2~4.6,現(xiàn)配現(xiàn)用)一次性腹腔注射,繼予高脂高糖飼料喂養(yǎng),于注射第4、5天用微量血糖測(cè)定儀測(cè)量空腹血糖,篩選出2次連續(xù)測(cè)量血糖≥11.1 mmol/L的大鼠,即為糖尿病模型大鼠,不滿足者剔除。糖尿病模型成功后再按大鼠體質(zhì)量0.2 mL/100 g皮下注射40%CCl4,每周2次,共 6周,建立糖尿病合并肝纖維化模型大鼠。
2.3 分組及干預(yù) 糖尿病模型大鼠按體質(zhì)量和血糖進(jìn)行隨機(jī)分層分組,分為模型對(duì)照組、二甲雙胍組、石斛合劑組各8只。石斛合劑組為先予石斛合劑 1 方按 17 g/(kg·d)灌胃 6 d,繼予石斛合劑 2 方按 10 g/(kg·d)灌胃 3 d,如此循環(huán);二甲雙胍組予二甲雙胍按 0.1 g/(kg·d)灌胃;正常對(duì)照組、模型對(duì)照組予等量生理鹽水灌胃。4組均灌胃干預(yù)6周。
2.4 觀測(cè)指標(biāo)
2.4.1 血糖 采用尾靜脈采血,檢測(cè)4組大鼠灌胃干預(yù)前后的血糖。
2.4.2 血清AST、ALT濃度 采用紫外比色法測(cè)定4組大鼠灌胃干預(yù)前后血清AST、ALT濃度。
2.4.3 肝臟HE染色及Masson染色 采用HE染色及Masson染色觀察4組大鼠干預(yù)后肝臟組織形態(tài)。取肝臟常規(guī)石蠟包埋切片,觀察肝細(xì)胞排列及膠原纖維的表達(dá)量。
2.4.4 肝纖維化四項(xiàng) 采用ELISA法檢測(cè)4組大鼠干預(yù)后血清肝纖維化四項(xiàng)(HA、LN、PC-Ⅲ、C-Ⅳ)。
2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理,符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以()表示,采用單因素方差分析,非正態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn)。
3.1 4組干預(yù)前后血糖濃度比較 見表1。
表1 4組干預(yù)前后血糖濃度比較()mmol/L
表1 4組干預(yù)前后血糖濃度比較()mmol/L
注:與正常對(duì)照組比較,1)P<0.01;與模型對(duì)照組比較,2)P<0.01;與干預(yù)前比較,3) P<0.01。
干預(yù)后4.78±0.41 19.80±4.761)7.10±1.852)3)6.56±4.882)3)組 別正常對(duì)照組模型對(duì)照組石斛合劑組二甲雙胍組n 8 8 8 8干預(yù)前4.76±0.37 21.12±6.571)17.35±7.251)21.68±6.571)
3.2 4組干預(yù)后AST、ALT濃度比較 見表2。
表2 4組治療后AST、ALT濃度比較()mmol/L
表2 4組治療后AST、ALT濃度比較()mmol/L
注:與正常對(duì)照組比較,1) P<0.01,2) P<0.05;與模型對(duì)照組比較,3) P<0.01。
ALT 55.26±3.76 165.81±4.501)77.73±6.862)3)91.86±13.242)3)組 別正常對(duì)照組模型對(duì)照組石斛合劑組二甲雙胍組n 8 8 8 8 AST 76.30±5.54 283.10±15.501)108.23±5.722)3)102.76±15.502)3)
3.3 肝臟形態(tài)學(xué)觀察
3.3.1 HE染色 如圖1所示,正常對(duì)照組肝細(xì)胞排列整齊、結(jié)構(gòu)完整;模型對(duì)照組肝細(xì)胞排列紊亂,有大量炎性浸潤(rùn),且在匯管區(qū)可見大量纖維組織;二甲雙胍組和石斛合劑組炎性浸潤(rùn)減少,纖維組織較模型對(duì)照組明顯減少。
3.3.2 Masson染色 如圖2所示,正常對(duì)照組中央靜脈區(qū)少量膠原纖維沉積;模型對(duì)照組匯管區(qū)合中央靜脈區(qū)有大量膠原纖維沉積;二甲雙胍組與石斛合劑組中央靜脈區(qū)雖仍有膠原纖維沉積,但與模型對(duì)照組比較明顯減少,且石斛合劑組減少更明顯。
3.4 4組干預(yù)后肝纖維四項(xiàng)指標(biāo)比較 見表3。
圖1 4組大鼠肝臟HE染色圖(×20)
圖2 4組大鼠肝臟Masson染色圖(×20)
表3 4組干預(yù)后肝纖維四項(xiàng)指標(biāo)比較()ng/mL
表3 4組干預(yù)后肝纖維四項(xiàng)指標(biāo)比較()ng/mL
注:與正常對(duì)照組比較,1) P<0.01;與模型對(duì)照組比較,2)P<0.01。
LN 65.13±6.54 350.51±31.841)79.52±5.942)87.70±8.942)組 別正常對(duì)照組模型對(duì)照組石斛合劑組二甲雙胍組n 8 8 8 8 HA 126.73±9.62 367.95±10.741)175.72±3.821)2)183.00±13.181)2)PC-Ⅲ39.94±1.71 243.46±31.671)48.12±2.552)43.44±3.282)C-Ⅳ70.79±3.38 124.83±47.951)84.46±2.982)81.04±11.772)
血糖升高是糖尿病的主要特征,在其發(fā)病的過程中會(huì)產(chǎn)生諸多并發(fā)癥,如視網(wǎng)膜、腎臟、心臟、腦及足等發(fā)生病變,同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生許多有害因子。糖基化終產(chǎn)物在糖尿病患者體內(nèi)過度累積,引起肝組織中氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)而損傷肝細(xì)胞[3],當(dāng)肝臟受到炎性損傷時(shí),肝星狀細(xì)胞由靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧せ顮顟B(tài)。肝星狀細(xì)胞激活后轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞是肝纖維化必經(jīng)途徑,這一觀點(diǎn)得到大多數(shù)人的認(rèn)可,肝星狀細(xì)胞被激活,分泌細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積,大量合成α-SMA,最后導(dǎo)致肝纖維化。有研究發(fā)現(xiàn),肝臟疾病也是糖尿病發(fā)病率較高的一個(gè)并發(fā)癥,糖尿病性肝病發(fā)病率為7.24%,2型糖尿病并發(fā)脂肪肝患病率高達(dá)55%[4-5]。在糖尿病與肝纖維化關(guān)系的廣泛研究中,已有證據(jù)顯示糖尿病是肝纖維化及肝硬化發(fā)生的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素[6-8]。
糖尿病核心病機(jī)是由各種病因引起全身氣機(jī)阻滯,釀生痰濕,郁而化熱,灼傷津液,導(dǎo)致陰虛燥熱,繼而引起痰濕熱交結(jié),滋生濁毒加重痰濕熱,最終導(dǎo)致陰陽(yáng)兩虛,且瘀血、尤其是經(jīng)脈瘀阻貫穿整個(gè)發(fā)病始終。石斛合劑序貫方由石斛合劑1方和石斛合劑2方組成。石斛合劑1方由石斛、黃芪、丹參、知母、生地、葛根、五味子、地龍等組成,益氣養(yǎng)陰,活血通絡(luò)。石斛中潤(rùn)胃陰,下滋腎陰,滋而不膩;黃芪托毒又補(bǔ)脾肺之氣,兩藥合用,肺脾腎三臟之氣陰同補(bǔ),上中下三焦兼顧,共為君藥。知母、生地清熱涼血,滋陰生津潤(rùn)燥,壯水制火;丹參活血涼血,祛瘀生新;地龍清熱息風(fēng),通絡(luò)利尿,共為臣藥。葛根升發(fā)脾胃之清陽(yáng),生津止渴;五味子斂肺滋腎生津,寧心澀精,一散一收,化而能守,佐助君藥滋陰益氣之功效,共為佐使藥。諸藥相須為用,上中下兼顧,甘溫化氣,酸甘養(yǎng)陰,苦寒清熱,潤(rùn)燥解毒,三消分治兼清瘀血。石斛合劑2方由茵陳、梔子、大黃、柴胡、滑石、甘草等組成,清肝泄?jié)幔謇麧駸?。茵陳清利濕熱,清熱解毒;梔子通利三焦,引濕熱自小便而出,二者共為君藥。大黃煬灶減薪,瀉熱逐瘀,祛其西道壅塞;柴胡疏肝解郁,清其東道邪熱,共為臣藥?;屎瓭B,以佐清利濕熱之力。甘草調(diào)和諸藥。全方藥簡(jiǎn)力專,使二便通利,前后分消,濕熱得行,痰瘀得化,濁毒得去。
本研究通過高脂高糖聯(lián)合腹腔注射STZ及皮下注射CCl4建立糖尿病合并肝纖維化模型。高脂高糖飼喂6周后聯(lián)合小劑量STZ(25 mg/kg)建立糖尿病模型,在此過程中,3只大鼠因空腹血糖<11.1 mmol/L,不符合糖尿病模型篩選標(biāo)準(zhǔn),舍去,造模成功率為89.29%;糖尿病成模后,再以2 mL/kg CCl4皮下注射,建立糖尿病合并肝纖維化模型,1只大鼠因皮下注射過程中操作不當(dāng)死亡。經(jīng)過石斛合劑序貫方治療6周后,大鼠空腹血糖、肝功能(AST、ALT)明顯改善,肝纖維化四項(xiàng)也明顯降低,且石斛合劑組優(yōu)于二甲雙胍組。病理活檢是診斷肝纖維化金指標(biāo),從肝臟組織形態(tài)學(xué)可知石斛合劑組和二甲雙胍組膠原纖維蛋白沉積明顯較模型對(duì)照組減輕,且石斛合劑組減輕更明顯,其具體可能的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
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