尚海霞 ,楊 弘 ,靳祎祎 ,彭 軍 ,2,褚劍鋒 ,2,莊群川 ,2,林久茂 ,2
(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院,福建 福州 350122;2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 福州 350122)
胃癌是起源于胃黏膜上皮細(xì)胞的惡性腫瘤,是世界上常見(jiàn)的惡性消化道腫瘤之一,嚴(yán)重威脅人類健康[1]。近年來(lái)其發(fā)病率逐年上升,并呈年輕化趨勢(shì)[2]。目前胃癌的主要治療方法有手術(shù)、化療、放療等,化療易對(duì)藥物產(chǎn)生耐藥性而使患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,臨床療效不佳,成為腫瘤治療的疑難點(diǎn)。中醫(yī)藥治療惡性腫瘤療效顯著,毒副作用小,具有整體調(diào)節(jié)的特點(diǎn),成為腫瘤治療的重要手段,備受關(guān)注。八寶丹(BBD)在臨床上治療胃癌等惡性腫瘤,可提高癌癥患者的化療耐受、減輕化療藥物的毒副反應(yīng)、提高生活質(zhì)量、延長(zhǎng)生存期等[3]。但八寶丹對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制作用及其分子機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng),探討八寶丹對(duì)胃癌細(xì)胞AGS和MGC-803增殖的抑制作用及其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用,為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株 人胃癌細(xì)胞株AGS和MGC-803購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物研究所,保存于福建中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。
1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 八寶丹(麝香、羚羊角、牛黃、蛇膽、三七、珍珠)購(gòu)自廈門中藥廠股份有限公司。
1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、雙抗(青霉素、鏈霉素)、0.25%胰蛋白酶、二甲亞砜(DMSO)均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)干粉購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;磷酸鹽緩沖液(PBS)購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司;Hoechst 33258染色試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。
1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備公司);二氧化碳培養(yǎng)箱、-80℃超低溫冰箱(美國(guó)Thermo公司);倒置顯微鏡系統(tǒng)(德國(guó)Leica儀器有限公司);形態(tài)學(xué)顯微圖像分析系統(tǒng)LAS V4.1、Countes?全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(美國(guó) Life公司)。
2.1 BBD溶液的制備 將八寶丹粉末用PBS配制成 25 mg/mL的藥液,超聲溶解、高壓滅菌后于4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>
2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將胃癌細(xì)胞株AGS、MGC-803置于含 10%滅活 FBS、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2和飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng),當(dāng)匯合度至80%~90%時(shí),加入1 mL胰蛋白酶(含0.25%EDTA)消化后,加入2 mL完全培養(yǎng)基中和以終止消化,1000 r/min離心3 min,棄上清液,收集沉淀細(xì)胞,用完全培養(yǎng)基重懸制成新細(xì)胞懸液后傳代。
2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AGS和MGC-803胃癌細(xì)胞,接種于96孔培養(yǎng)板中,調(diào)整細(xì)胞密度為 1×105個(gè)/mL,每孔 100 μL,置 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到50%~60%時(shí),棄掉原培養(yǎng)基,分別加入含有不同濃度BBD(終濃度分別為 0、0.25、0.5、0.75、1 mg/mL)的培養(yǎng)基,每孔 100 μL,分別干預(yù) 24 h和 48 h后吸棄各孔溶液,每孔加入 0.5 mg/mL的MTT溶液100 μL,37℃孵育4 h后吸棄各孔中的液體,加入DMSO 100 μL/孔,室溫靜置 10 min,充分振蕩混勻,使結(jié)晶充分溶解并混勻,采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各組吸光度值(A值),并計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。
細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。
2.4 細(xì)胞形態(tài)觀察與計(jì)數(shù) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AGS和MGC-803細(xì)胞接種于6孔板,調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×105個(gè)/孔,置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜,細(xì)胞匯合度達(dá)到50%~60%時(shí),用不同濃度 BBD(0、0.25、0.5、0.75、1 mg/mL)干預(yù) 24 h,在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照記錄。拍照后細(xì)胞予消化、中和、離心、重懸處理,臺(tái)盼藍(lán)染色,于Countes?全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對(duì)AGS和MGC-803細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)分析。
2.5 集落形成實(shí)驗(yàn) AGS和MGC-803細(xì)胞以2.5×105個(gè)/孔接種于6孔板,置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜,待細(xì)胞匯合度達(dá)到50%~60%時(shí),加入不同濃度 BBD(0、0.25、0.5、0.75、1 mg/mL)干預(yù) 24 h。吸棄培養(yǎng)液,用PBS清洗,經(jīng)過(guò)消化、中和、離心、重懸操作,將細(xì)胞按500個(gè)/孔接種于12孔板中,2~3 d換液,且換液前于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài),連續(xù)培養(yǎng)7~10 d后,當(dāng)培養(yǎng)板孔中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)克隆時(shí),停止培養(yǎng)。吸棄上清,用PBS清洗2~3次。加入4%多聚甲醛固定10 min,吸棄4%多聚甲醛后用PBS清洗2~3遍,最后每孔用結(jié)晶紫染色液染色20 min,吸棄染色液,用高壓過(guò)的純水清洗3遍,相機(jī)拍照觀察集落形成情況。
2.6 Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 AGS和MGC-803細(xì)胞以1.5×105個(gè)/孔接種于12孔板,置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜,待細(xì)胞匯合度達(dá)到50%~60%時(shí),加入不同濃度 BBD(0、0.25、0.5、1 mg/mL)干預(yù)24 h。用4%多聚甲醛室溫固定10 min,然后吸棄,每孔加入200 μL分裝好的hoechst 33258工作液染色,4℃避光反應(yīng)15 min,用PBS沖洗細(xì)胞3次,最后一次留在孔中。熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況并拍照(×200)。
2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,計(jì)量資料符合正態(tài)分布以()表示,多組比較采用單因素方差分析,組間比較采用t檢驗(yàn)。
3.1 不同濃度BBD干預(yù)后AGS、MGC-803抑制情況比較 MTT檢測(cè)結(jié)果顯示不同濃度的BBD可顯著抑制胃癌細(xì)胞AGS和MGC-803的增殖,具有明顯的劑量依賴和時(shí)間依賴作用。見(jiàn)表1、表2。
表1 不同濃度BBD干預(yù)后AGS、MGC-803抑制率比較(n=8,)
表1 不同濃度BBD干預(yù)后AGS、MGC-803抑制率比較(n=8,)
注:與對(duì)照組比較,1) P<0.01。
組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組BBD 濃度(mg/mL)0 0.25 0.50 0.75 1 AGS抑制率/% MGC-803抑制率/%24 h 0±2.82 7.83±2.331)18.46±5.411)38.95±3.731)68.70±3.531)48 h 0±1.74 27.49±5.701)33.61±6.631)63.16±4.461)88.99±1.671)24 h 0±2.19 6.41±4.261)7.16±4.051)13.43±3.281)41.49±3.421)48 h 0±3.34 22.59±4.321)30.82±3.301)41.56±4.481)53.82±4.851)
表2 不同濃度BBD干預(yù)后AGS、MGC-803細(xì)胞數(shù)比較(n=8,)
表2 不同濃度BBD干預(yù)后AGS、MGC-803細(xì)胞數(shù)比較(n=8,)
注:與對(duì)照組比較,1) P<0.01。
組別對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組BBD濃度(mg/mL)0 0.25 0.50 0.75 1 AGS/×105個(gè)9.59±0.47 8.75±0.381)6.76±0.351)6.35±0.521)0.51±0.041)MGC-803/×105個(gè)18.60±0.66 9.24±0.621)8.24±0.581)7.29±0.611)6.19±0.291)
3.2 BBD對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示胃癌細(xì)胞AGS和MGC-803經(jīng)不同濃度的BBD干預(yù)24 h后,隨著藥物濃度的增加,AGS和MGC-803細(xì)胞密度逐漸減少,懸浮細(xì)胞增多,部分細(xì)胞皺縮變圓。見(jiàn)圖1。
3.3 BBD對(duì)細(xì)胞集落形成能力的影響 集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示BBD對(duì)胃癌細(xì)胞AGS、MGC-803的集落形成能力有明顯的抑制作用,具有一定的劑量依賴性。見(jiàn)圖2。
3.4 BBD對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 Hoechst 33258染色結(jié)果顯示BBD具有誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞AGS、MGC-803凋亡的作用,凋亡細(xì)胞數(shù)隨著BBD濃度增加而逐漸增多,呈現(xiàn)明顯的劑量依賴作用。見(jiàn)圖3。
中醫(yī)理論認(rèn)為腫瘤形成多由于氣滯血瘀,或熱毒內(nèi)蘊(yùn),或痰凝濕聚,或正氣虧虛、久之瘀積邪毒而致。腫瘤的化療藥物多為細(xì)胞毒性藥物,大多具有嚴(yán)重不良反應(yīng),直接影響腫瘤的療效,因此從天然藥物中尋找具有抗腫瘤活性且不良反應(yīng)較小的成分是腫瘤治療的研究方向之一。研究證實(shí)中醫(yī)藥具有抑制胃癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡、調(diào)節(jié)免疫、抑制血管新生、抑制端粒酶的表達(dá)、抗侵襲轉(zhuǎn)移及逆轉(zhuǎn)多藥耐藥等方面的作用[4]。BBD以天然牛黃、珍珠、蛇膽、三七、麝香、羚羊角等八味名貴中藥精制而成,諸藥合用共奏清熱解毒、活血化瘀之效,符合中醫(yī)辨證抗腫瘤的機(jī)理,現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明麝香、牛黃、三七等均有明顯抗腫瘤療效[5-7]。在本研究中,MTT結(jié)果顯示,BBD對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用,且呈一定的時(shí)間和濃度依賴性。
近年來(lái),隨著人們對(duì)腫瘤研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展不僅與腫瘤細(xì)胞增殖過(guò)度和分化異常有關(guān),而且與細(xì)胞凋亡受阻密切相關(guān)[8]。細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)是研究腫瘤細(xì)胞存活和細(xì)胞增殖能力最常用的方法之一,且結(jié)果呈現(xiàn)直觀。集落實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示BBD對(duì)胃癌細(xì)胞AGS和MGC-803的集落形成能力具有明顯的抑制作用,進(jìn)一步證實(shí)BBD具有抑制胃癌細(xì)胞增殖的作用。
圖1 不同濃度BBD干預(yù)24 h AGS、MGC-803細(xì)胞形態(tài)圖(×200)
圖2 不同濃度BBD干預(yù)AGS、MGC-803細(xì)胞集落形成染色圖
圖3 不同濃度BBD干預(yù)AGS、MGC-803細(xì)胞Hoechst染色圖(×200)
細(xì)胞凋亡是一種程序化的細(xì)胞死亡過(guò)程,典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變包括細(xì)胞膜出泡、細(xì)胞皺縮、核染色質(zhì)固縮和凋亡小體形成[9]。Hoechst染色是一種經(jīng)典而又快速的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法[10]。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí),與鄰周細(xì)胞脫離,胞漿聚縮,核染色體密度增高呈半月形,且在核膜周邊凝集,核仁發(fā)生裂解,細(xì)胞內(nèi)陷,進(jìn)而形成凋亡小體。本實(shí)驗(yàn)中,熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示,BBD能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞AGS和MGC-803的凋亡,且呈劑量依賴性。
綜上所述,本研究結(jié)果提示BBD抑制胃癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是其治療胃癌的重要作用機(jī)制。但BBD治療胃癌等惡性腫瘤的作用機(jī)制研究尚不深入及不系統(tǒng),亟待進(jìn)一步的研究探索。
[1] VAN CUTSEM E,SAGAERT X,TOPAL B,et al.Gastric cancer [J].Lancet,2016,388(10060):2654-2664.
[2] MCLEAN M H,EL-OMAR E M.Genetics of gastric cancer [J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol,2014,11(11):664-674.
[3] 耿冬梅,張良明,隋銘驊.八寶丹膠囊輔助晚期腫瘤化療的研究[J].山西醫(yī)藥雜志,2010,39(6):562-564.
[4] 王亞坤,謝長(zhǎng)生,樓金杰,等.中醫(yī)藥治療胃癌的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2015,33(11):2743-2745.
[5] 孟照華,單禮成,曾家修,等.皮下埋藏麝香對(duì)BALB/c純系小鼠惡性腫瘤生長(zhǎng)影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)腫瘤臨床,1998,25(11):834-836.
[6] 武凡,張樹三,康格非.三七皂甙對(duì)肝纖維化大鼠分泌型磷脂A2和腫瘤壞死因子表達(dá)的影響[J].中華肝臟病雜志,2003,11(1):51-52.
[7] 李蒙,于建勛.單味中藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究現(xiàn)狀及展望[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,2001,21(1):74-76.
[8] WUCHTER C,KARAWAJEW L,RUPPERT V,et al.Constitutive expression levels of CD95 and Bcl-2 as well as CD95 function and spontaneous apoptosis in vitro do not predict the response to induction chemotherapy and relapse rate in childhood acute lymphoblastic leukaemia [J].Br J Haematol,2000,100(1):154-160.
[9] 孫沛林,金京春,王瑩,等.黃芩素誘導(dǎo)胃癌MGC-803細(xì)胞凋亡[J].腫瘤,2017,37(10):1041-1046.
[10]朱彩平,張聲華,肖軍霞.枸杞多糖誘導(dǎo)人宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)研究[J].食品科學(xué),2010,31(19):329-334.