孫賢久 秦先鋒 郭少卿 劉思純 左海軍 張 莉

中山大學(xué)附屬東華醫(yī)院消化科，廣東東莞 523110

胃食管反流（gastroesophageal reflus disease，GERD）主要是指由于各種因素造成十二指腸或胃的內(nèi)容物返回到食管中進(jìn)而引發(fā)的并發(fā)癥或癥狀[1]。臨床上GERD主要表現(xiàn)為燒心、惡心和發(fā)酸等癥狀，重者還會(huì)導(dǎo)致食管狹窄、出血、糜爛等嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。目前臨床上關(guān)于GERD的治療有許多種方法，包括內(nèi)科治療（藥物治療）、外科治療以及微創(chuàng)治療等。內(nèi)科治療通常無(wú)法根治，患者需要長(zhǎng)期服藥，且易復(fù)發(fā)因此臨床上主要用于輕度胃食管反流患者的治療；外科治療雖然效果顯著，但是對(duì)患者創(chuàng)傷較大，易引起各類手術(shù)并發(fā)癥，近年來(lái)隨著微創(chuàng)技術(shù)的不斷發(fā)展，逐漸被微創(chuàng)治療所取代。目前關(guān)于GERD的內(nèi)鏡治療是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)，但其安全性及療效仍需大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)[2-3]。而制備合適的胃食管反流并動(dòng)物模型對(duì)于實(shí)驗(yàn)研究的準(zhǔn)確性至關(guān)重要[4-5]。本研究中提出了一種內(nèi)鏡下環(huán)形肌切開(kāi)術(shù)制備胃食管反流病動(dòng)物模型的方法，具體報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選取健康6～12月齡的Beagle實(shí)驗(yàn)犬12只，其中雌犬和雄犬各6只，體質(zhì)量10～12kg。速眠新II麻醉藥，甲醛溶液，腎上腺素，靛胭脂，多導(dǎo)腸胃功能測(cè)定儀，pH動(dòng)態(tài)檢測(cè)記錄儀，光學(xué)顯微鏡。

1.2 方法

采用內(nèi)鏡下環(huán)形肌切開(kāi)術(shù)制備胃食管反流病動(dòng)物模型，具體步驟如下：（1）術(shù)前準(zhǔn)備：實(shí)驗(yàn)犬在術(shù)前禁食禁水1d，以0.1～0.15mg/kg的速眠新II號(hào)對(duì)實(shí)驗(yàn)犬進(jìn)行靜脈全麻，無(wú)需進(jìn)行氣管插管，使所有實(shí)驗(yàn)犬可以進(jìn)行自主呼吸，若實(shí)驗(yàn)犬在麻醉后仍然存在躁動(dòng)等狀態(tài)，應(yīng)適當(dāng)增加麻醉藥的使用劑量。在內(nèi)鏡下測(cè)量門齒到賁門之間的距離，在胃和食管交界處的上端7～10cm處切開(kāi)黏膜層，并在右后壁黏膜處注射腎上腺素和靛胭脂，采用Hook刀將黏膜層切開(kāi)1～3cm的開(kāi)口，暴露黏膜的下層組織，并進(jìn)行相關(guān)的分離操作。（2）食管黏膜下隧道的建立：食管黏膜下隧道建立的核心原則是與食管環(huán)形肌層保持垂直的角度，確保黏膜隧道始終處于直線型。（3）切開(kāi)環(huán)形?。涸谖哥R下采用Hook刀在GEJ上端7～9cm處切入，從上到下垂直切至GEJ下段1～3cm處，暴露縱行肌，再采用Hook刀從環(huán)形肌和縱行肌的空隙中伸入，切入環(huán)形肌，在胃鏡的引導(dǎo)下，逐步將整個(gè)環(huán)形肌切開(kāi)。

1.3 指標(biāo)測(cè)定方法

1.3.1 食管壓力測(cè)定 于制備前7d和后7d分別采用多導(dǎo)腸胃功能測(cè)定儀測(cè)定實(shí)驗(yàn)犬的食管壓力。具體測(cè)定方法如下：采用多導(dǎo)胃腸功能測(cè)定儀，使用高分辨四道毛細(xì)灌注測(cè)壓系統(tǒng)，以實(shí)驗(yàn)犬胃內(nèi)正常的壓力作為基準(zhǔn)線，測(cè)定其食管壓力。

1.3.2 食管pH測(cè)定 于制備前7d和后7d分別采用pH動(dòng)態(tài)檢測(cè)記錄儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)犬食管pH值。采集實(shí)驗(yàn)犬食管酸反流（pH值＜4）次數(shù)，長(zhǎng)時(shí)間酸反流（pH＜4持續(xù)5min以上）次數(shù)，最長(zhǎng)反流時(shí)間（pH＜4持續(xù)的最長(zhǎng)時(shí)間）以及酸反流率。

1.3.3 病理學(xué)檢查 將實(shí)驗(yàn)犬處死，取其食管組織，用甲醛溶液固定，再用石蠟進(jìn)行包埋，經(jīng)蘇木精-伊紅染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察其食管組織變化情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Epidata 3.0對(duì)本研究數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入校對(duì)，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS19.0版對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)犬結(jié)果

12只行內(nèi)鏡下環(huán)形肌切開(kāi)術(shù)的實(shí)驗(yàn)犬，無(wú)死亡，全部存活，其中有8只術(shù)后出現(xiàn)反流，另外4只術(shù)后未出現(xiàn)反流，采用內(nèi)鏡下環(huán)形肌切開(kāi)術(shù)制備胃食管反流病動(dòng)物模型的成功率為66.7%。

2.2 食管壓力情況

制備前后實(shí)驗(yàn)犬食管壓力情況如下表1所示，制備前實(shí)驗(yàn)犬食管壓力明顯大于制備后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.112，P ＜ 0.05）。

表1 制備前后實(shí)驗(yàn)犬食管壓力情況比較（x ± s，kPa）

2.3 食管pH情況

制備前后實(shí)驗(yàn)犬食管pH情況如下表2所示，制備后的實(shí)驗(yàn)犬反流次數(shù)、反流最長(zhǎng)時(shí)間和反流率均大于制備前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.968，4.037，4.006，P ＜ 0.05），但反流＞ 5min的次數(shù)制備前與制備后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.651，P＞0.05）。

2.4 病理學(xué)檢查情況

從病理學(xué)檢查情況來(lái)看，制備前的正常實(shí)驗(yàn)犬食管組織呈現(xiàn)明顯的復(fù)層鱗狀結(jié)構(gòu)，上皮層內(nèi)有少量炎癥細(xì)胞存在，其他各層均正常。而制備后的實(shí)驗(yàn)犬的食管組織中上皮層存在明顯的膨脹和增厚，黏膜層有大量的炎癥細(xì)胞存在，此外部分肌層還存在斷裂等情況。

表2 制備前后實(shí)驗(yàn)犬食管pH情況比較（x ± s）

3 討論

從國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道來(lái)看，目前制備胃食管反流病動(dòng)物模型的方法可以分為兩類，即手術(shù)法和非手術(shù)法，其中手術(shù)法又可分為破壞食管下括約肌法、十二指腸或幽門結(jié)扎法、空腸或十二指腸吻合術(shù)法[6-10]。空腸或十二指腸吻合術(shù)法由于完全改變了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的消化道解剖結(jié)構(gòu)，因此通常不能用于療效評(píng)價(jià)試驗(yàn)，因此應(yīng)用相對(duì)較少[11]；十二指腸或幽門結(jié)扎法制備的食管反流病動(dòng)物模型通常存活期較短，多用于短期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，但無(wú)法滿足中長(zhǎng)期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究需求[12]；破壞食管下括約肌法雖然對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的造成的創(chuàng)傷較大，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有較高的死亡率，但是其建模成功率較高，是目前應(yīng)用最廣泛的制備胃食管反流病動(dòng)物模型的方法[13]。非手術(shù)方法主要是指通過(guò)食管關(guān)注胃蛋白酶或酸制備簡(jiǎn)單的食管反流模型，但該法制備的食管反流模型通常僅適用于食管黏膜的損害、防御機(jī)制研究[14-15]。

本研究中提出了一種內(nèi)鏡下環(huán)形肌切開(kāi)術(shù)制備胃食管反流病動(dòng)物模型的方法，為了探討內(nèi)鏡下環(huán)形肌切開(kāi)術(shù)制備胃食管反流病動(dòng)物模型的可行性，本研究選取了健康6～12月齡的Beagle實(shí)驗(yàn)犬12只進(jìn)行研究，結(jié)果表明12只行內(nèi)鏡下環(huán)形肌切開(kāi)術(shù)的實(shí)驗(yàn)犬，無(wú)死亡，全部存活，其中有8只術(shù)后出現(xiàn)反流，另外4只術(shù)后未出現(xiàn)反流，建模成功率為66.7%。備前實(shí)驗(yàn)犬食管壓力明顯大于制備后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.112，P＜0.05）。制備后的實(shí)驗(yàn)犬反流次數(shù)、反流最長(zhǎng)時(shí)間和反流率均大于制備前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.968，4.037，4.006，P＜0.05），但反流＞5min的次數(shù)制備前與制備后差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.651，P＞0.05）。從病理學(xué)檢查情況來(lái)看，制備前的正常實(shí)驗(yàn)犬食管組織呈現(xiàn)明顯的復(fù)層鱗狀結(jié)構(gòu)，上皮層內(nèi)有少量炎癥細(xì)胞存在，其他各層均正常。而制備后的實(shí)驗(yàn)犬的食管組織中上皮層存在明顯的膨脹和增厚，黏膜層有大量的炎癥細(xì)胞存在，此外部分肌層還存在斷裂等情況。

總而言之，內(nèi)鏡下環(huán)形肌切開(kāi)術(shù)是一種簡(jiǎn)單可靠的制備胃食管反流病動(dòng)物模型的方法，該法制備胃食管反流病動(dòng)物模型具有成功率高，不影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物解剖結(jié)構(gòu)，與胃食管反流發(fā)病機(jī)制吻合等特點(diǎn)，可用于評(píng)價(jià)胃食管反流的內(nèi)鏡治療或手術(shù)治療的療效觀察，值得進(jìn)行推廣應(yīng)用。

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