金紅峰 曾廣忠 徐晨凱 王云龍 劉小偉 唐禮江

[摘要]目的通過微栓塞球聯合凝血酶粉制劑栓塞冠狀動脈制作Beagle犬急性心肌梗死模型的可行性以及安全性。方法選用體重10～12kg的30只Beagle犬經股動脈行左冠狀動脈前降支造影，經微導管先把聚乙烯微球2ml（4x104/ml）懸浮制劑快速注入，隨后注入凝血酶粉制劑2ml（1000u/ml）栓塞左前降支來建立心肌梗死模型。行心臟超聲檢查測量左心室舒張末內徑（LVEDd）、左心室收縮末內徑（LVEDs）、左心室射血分數（LVEF）等參數。結果

全部Bea-gle犬均行左冠狀動脈造影成功，栓塞即刻成功率為83.33%，術中死亡率為16.67%，2周的存活率為70.00%。術后1小時心臟超聲檢查提示心臟前壁心尖部、室間隔前1/3收縮減弱，LVEF值明顯下降。術后1周示左心室前壁出現節(jié)段性運動減弱及反向運動，LVEDd增大，LVEF值恢復正常范圍。結論微栓塞球聯合凝血酶粉制劑行冠狀動脈介入封堵法建立Beagle犬心肌梗死模型，具有建模成功率高、操作簡單快速、動物創(chuàng)傷小、術后恢復快及成活率高，且具有可逆性等優(yōu)點，是一種新型有效的犬急性心肌梗死造模方法。

[關鍵詞]心肌梗死模型；凝血酶粉；微栓塞球；冠狀動脈栓塞

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是常見的致命性疾病之一，隨著生活水平的提高，生活方式的改變，研究顯示心肌梗死的發(fā)病率逐年升高。在心肌梗死研究中，動物模型被廣泛用于發(fā)病機制和藥物手術治療研究。不同的動物模型制備過程適應不同的研究目的，心肌梗死動物模型的有效建立是完成相關實驗的前提。目前心肌梗死的造模方法多采用開胸結扎法和介入栓塞法。開胸結扎法創(chuàng)傷大，恢復慢。隨著冠狀動脈造影、經皮冠狀動脈介入等技術日益成熟，為避免開胸手術建立模型，且達到同樣的效果，介入法建立心肌梗死模型的研究越來越多，本研究擬用微栓塞球聯合凝血酶凍干粉聯合栓塞冠狀動脈法建立beagle犬的急性心肌梗死模型，并通過手術前后冠狀動脈造影、實驗室檢查、心電圖、超聲心動圖等檢查驗證造模是否成功。

1材料及方法

1.1實驗動物：選擇10～13月齡健康普通級Beagle犬30只，體重10～12kg的（均購自上海新岡實驗動物場（許可證號：SCXK（滬）2012-0009），由浙江大學實驗動物中心飼養(yǎng)），雌雄各半。

1.2實驗儀器：C型臂x光機H5000：（荷蘭，Philips）；超聲多普勒診斷儀：（Philips Sonos 7500）；心電監(jiān)護（Prucka Enginerring公司的多導生理記錄儀器），Med-lab生物信號采集處理系統(tǒng)：（南京美易科技有限公司），心導管介入器械：BL 3.0 Guiding，Finecmss微導管、直徑為0.036cm的導絲（0.014 inch Runthmughguidewire）、泰爾茂5F多功能造影導管，泥鰍導絲（均為日本Temmo公司產品）、Boston 2.0x20mm預擴球囊。微栓塞球（聚乙烯微球X直徑90～125um）：美國Bangs Laboratories公司，凝血酶凍干粉（5000u）：浙江杭康藥業(yè)有限公司（H33021734），碘普羅胺注射液（優(yōu)維顯）：上海旭東海普藥業(yè)有限公司生產，戊巴比妥鈉：北京普博斯生物科技有限公司。

1.3 Beagle犬心肌梗死模型的建立：30只Beagle犬，術前禁食12h，禁水4h，用3%戊巴比妥鈉1ml/kg經左前足前靜脈注射麻醉，控制靜推速度，應先快后慢，觀察犬反應程度“寧淺勿深”，根據實驗犬對刺激反應程度調整戊巴比妥劑量。將犬仰臥位固定于導管床上，并將頭部固定側向右側，保持呼吸道通暢，鼻導管吸氧（3L/min）。連接12導聯體表心電圖，記錄心電圖后，接模擬導聯Ⅱ行心電監(jiān)護。常規(guī)雙側腹股溝皮膚消毒、鋪巾。于右側股動脈搏動最強處用Seldinger法穿刺右側股動脈，置入Terumo橈動脈鞘。經鞘管送入泥鰍導絲至主動脈竇底，沿導絲送入BL3.0 Guiding（日本Terumo公司產品）至左冠開口，左冠造影成功后，充分暴露前降支（1eft anterior desendingcoronary artery，LAD），以左頭位暴露最佳。將導絲成功送至前降支遠端，沿導絲送人Boston 2.0x20mm預擴球囊至LAD第二對角支處，以14arm擴張球囊，間隔30s分別先后行1、2、3min預缺血試驗，觀察心電監(jiān)護心率變化。撤出球囊，沿導絲送入Finecross微導管（日本Terumo公司產品），微導管至LAD第二對角支遠端，撤出導絲保留微導管在前降支位置不變，經微導管先把微栓塞球2ml（4×104個/ml）快速注入，隨后經微導管注入凝血酶粉制劑2ml（1000u/ml，用0.9%氯化鈉注射液配制）。觀察5～10min后行冠脈造影確認血流是否阻斷，如阻斷，間隔30min、1h、2h、3h、6h、12h復查冠狀動脈造影，了解血栓栓塞情況。1周后復查冠狀動脈造影，需重復以上冠狀動脈造影步驟，了解血管栓塞情況。結束手術后，拔出動脈鞘，穿刺口近端壓迫30min，并用彈力繃帶加壓包扎，每間隔1小時觀察穿刺點有無滲血血腫等。將實驗犬運回動物中心，注意保溫，待犬完全清醒后喂水，術后24小時解除穿刺點包扎，每日觀察犬精神狀態(tài)、進食量、穿刺處有無感染。

1.4心電圖檢查及心肌酶譜及肌鈣蛋白測定：于術后1小時、6小時、12小時、24小時行心電圖檢查，每次連接心電圖的位置固定不變，記錄體表12導聯心電圖（ECG），以觀察犬心肌梗死超急性期、急性期ECG變化。同時段經前足靜脈抽取血液6ml分別裝于醫(yī)用常規(guī)管、生化管中，靜至30分鐘后，離心分離提取血漿、血細胞、血清保存至-80℃冰箱備用，由浙江醫(yī)院生化室分析儀測肌鈣蛋白I（cardiac tmponin，cTn-I）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶同工酶（creatine kinase isoenzyme，CK-MB）谷草轉氨酶（aLs.oartate aminotransferase，AST）、谷丙轉氨酶（～jutamicpyruvic transaminase，GFF又稱ALT）。

1.5心臟超聲檢查：術前、術后1小時、6小時、12小時、24小時、3天、1周行心臟超聲檢查。取心臟四腔心及兩腔心切面用Simpson法檢測左心室射血分數（LVEF），取兩者平均值。取胸骨旁左心室長軸切面，測得舒張末期室間隔厚度（interventricular septal depth，IVSd）、左心室舒張末內徑（1eft ventricular end diastolicdiameter LVEDd）、左心室收縮末內徑（1eft ventricularend systolic diameter，LVEDs）；并根據LVEDd、LVEDs計算左心室短縮率（FS），所有數據測量3遍，并取3次平均值作為超聲心動圖最終數據。

1.6統(tǒng)計學處理：應用SPSS19.0版統(tǒng)計軟件，計量資料用（x±s）表示；手術前后的實驗室檢查指標及心功能指標采用配對t檢驗；P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 Beagle犬心肌梗死模型的建立：全部Beagle犬均行左冠狀動脈造影成功，未行右冠狀動脈造影（圖1A見封三）。術中有4只犬發(fā)生室性心動過速，心室顫動，3只死亡，1只犬經電除顫及抗心律失常治療成功救活。其中2只犬是微栓塞球和凝血酶制劑推注完后3～5min出現心率加快，經多次除顫及利多卡因抗心律失常治療后仍未搶救成功，1只犬是在3小時復查造影時出現室性心動過速，心室顫動，同樣經搶救無效死亡，只有1只犬搶救成功并直至實驗結束。2只犬在栓塞后出現心率逐漸減慢至30～40次/分，繼而血壓下降，經阿托品、腎上腺素及異丙腎上腺素搶救無效死亡。因此術中3只犬死于室性心動過速，室顫，2只犬死于緩慢性心動過緩，一共5只犬術中死亡。其余的4只術后死亡的犬分別死于術后7h、13h、2d、7d，其中1例出現穿刺點血腫，解剖后可見雙側肺部淤血，考慮可能因急性心力衰竭或失血死亡，具體原因不明?？偟氖中g即刻成功25只，成功率83.33%，術中死亡5只，死亡率為16.67%，術后24h內死亡7只犬，術后2周內死亡9只犬（30.00%），2周的存活率為70.00%。所有犬因手術創(chuàng)口小均未出現創(chuàng)口感染。

冠狀動脈栓塞前完善左冠狀動脈造影；栓塞后30min、1h、2h、3h復查冠狀動脈造影提示LAD近端全閉，無血流通過，6h復查冠狀動脈造影提示近端血流再通，遠端管腔仍完全閉塞；12h及1周后復查冠狀動脈造影提示LAD血流再通，無明顯狹窄（圖1B、C、D、E、F見封三）。

2.2心電圖檢查：術前正常心電圖，犬的12導聯體表心電圖，可見心電圖所有導聯的ST-T段均在基線水平，犬左冠狀動脈前降支被堵塞后的12導聯體表心電圖中可見胸前導聯的ST段明顯抬高成弓背狀。肢體導聯上可見Ⅱ、Ⅲ、aVF導聯ST-T段無明顯抬高，其工、aVL導聯可見ST-T輕度抬高。

2.3心臟超聲資料：術前心臟超聲檢查示心臟收縮舒張功能及各階段運動正常（圖2A見封三），成功栓塞造成心肌梗死后可導致實驗犬急性心力衰竭發(fā)作，心臟超聲檢查提示EF值下降明顯，但術后3天后心功能開始恢復，至術后1周后EF值恢復正常范圍，見表1。術后1小時檢查提示心臟前壁心尖部、室間隔前1/3收縮減弱，EF值明顯下降（圖2B見封三）。術后3天檢查示：左室前壁出現節(jié)段性運動減弱，LVDd增大，二維圖像見左室腔擴大（圖2C見封三）。術后1周示左室前壁出現節(jié)段性運動消失及反向運動等現象，梗死區(qū)出現心肌強回聲，室壁變薄，LVEDd增大，EF值恢復正常范圍（圖2D見封三）。

2.4血生化檢查：Beagle犬栓塞后心肌酶譜及cTnI的改變與人類相似，在術后6h已明顯升高，12h左右達到峰值，24h后開始下降，符合心肌梗死的特點，見表2。

3討論

在疾病研究中，動物模型的開發(fā)與應用是研究疾病發(fā)病機制和治療手段的關鍵。隨著介入技術的日益成熟，經心導管介入植入栓塞物或利用球囊等封堵冠狀動脈阻塞血流，定位栓塞冠狀動脈建立心肌梗死模型日益增多。介入封堵避免了開胸手術所造成的創(chuàng)傷，使死亡率明顯下降，是臨床研究心肌梗死比較理想的建模方法。

本實驗全部Beagle犬均行左冠狀動脈造影成功，微栓塞球聯合凝血酶粉制劑能成功地阻斷冠狀動脈前降支血流，且血栓能維持6h～12h。

和以往的不可逆相比較，本實驗的阻斷血流是可逆性的，不過結合心電圖、心肌酶譜、肌鈣蛋白以及心臟超聲等的結果，犬的心肌梗死是非常明確的。這也是一種新的心肌梗死模型。

成功栓塞造成心肌梗死后可導致實驗犬急性心力衰竭發(fā)作，呼吸心率加快，心臟超聲檢查提示LVEF值下降明顯，但術后3天后心功能開始恢復，至術后1周后LVEF值恢復正常范圍。同時心超提示術后心臟前壁及心尖部出現階段運動異常，1周后局部室壁瘤形成。血化驗提示心肌酶及肌鈣蛋白I較術前明顯升高，可以確定利用微栓塞球聯合凝血酶粉制劑行冠狀動脈栓塞法能成功建立心肌梗死模型。術中有3只犬發(fā)生室性心動過速、心室顫動死亡，2只出現心率減慢傳導阻滯死亡，4只死于術后2周內，總的手術成功率83.33%，2周的存活率為70.00%。

凝血酶粉制劑是由凝血酶凍干粉經0.9%氯化鈉注射液配制而成，臨床上多用于消化道出血、手術中不易結扎的小血管及外傷的止血。凝血酶粉是從牛血或豬血中提取的凝血酶原，經激活而得的凝血酶。進入血管能導致血栓形成，但在預實驗時單就冠狀動脈內注射凝血酶制劑較難形成血栓，實驗中顯示要平均注射15萬單位時冠狀動脈內血栓才會形成。但先在冠狀動脈內通過微導管注射微栓球使血流減慢后，再緩慢通過微導管定位注射同樣濃度的凝血酶粉制劑2000u就可使得冠狀動脈內局部形成血栓。不能立即行冠狀動脈造影檢查，因凝血酶反應至形成穩(wěn)定血栓需要時間，觀察5～10min根據心電監(jiān)護上實驗犬的心率、心電圖ST段抬高，此時考慮冠狀動脈可能被完全閉塞。凝血酶凍干粉的特性需要直接與創(chuàng)面接觸，在損傷的內膜上凝血效果比較好。使用球囊預擴張后，可導致局部的內膜損傷，注射微栓塞顆?？勺枞跔顒用}微循環(huán)的作用，減慢血流，為凝血酶凍干粉注射形成血栓奠定基礎。前期的預實驗提示，如果單純只打凝血酶粉，反復注射3次～5次才能形成血栓，且量較大，副作用更大，而先注射微栓塞顆粒后，再注射凝血酶凍干粉后，只需要注射1次凝血酶凍干粉就可快速形成血栓。

綜上所述，微栓塞球聯合凝血酶粉制劑行冠狀動脈介入封堵法建立Beagle犬心肌梗死模型，具有建模成功率高、操作簡單快速、動物創(chuàng)傷小、術后恢復快及成活率高等優(yōu)點，且無需使用呼吸機，可廣泛應用于心肌梗死相關研究，極大地提高實驗進程。微栓塞球聯合凝血酶粉制劑封堵法是一種新型有效的犬急性心肌梗死造模方法。