張敬 馮紅兵 李君 羅長軍 熊小奇

[摘要]目的探究參松養(yǎng)心膠囊對心肌梗死模型大鼠心肌細胞的保護作用及其可能的機制研究。方法

采用冠狀動脈前降支結扎術建立心肌梗死模型。將60只SD大鼠隨機分為梗死組與非梗死組，非梗死組采取開胸后冠狀動脈穿線，但不做結扎。模型制作成功后，將兩組隨機平分為對照組10只，美托洛爾組10只，參松養(yǎng)心膠囊組10只，術后分別以普食、普食+美托洛爾、普食+參松養(yǎng)心膠囊原粉喂食。8周后處理大鼠，取心肌梗死周圍組織，檢測各組大鼠心肌縫隙連接蛋白（Cx43）和信使RNA（rnRNA）的表達量。結果在非梗死各組中Cx43蛋白表達強烈，且均勻的分布在細胞與細胞之間的連接處；與非梗死組比較，梗死組的對照組Cx43表達明顯減弱，甚至全部消失，而參松養(yǎng)心膠囊組及美托洛爾組梗死區(qū)的Cx43表達減弱和分布的紊亂彌散程度均較?。环枪Ｋ栏鹘M的蛋白和mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；在梗死組中，對照組Cx43蛋白和mRNA表達明顯低于參松養(yǎng)心膠囊組及美托洛爾組（P<0.05），但參松養(yǎng)心膠囊組與美托洛爾組之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結論參松養(yǎng)心膠囊能夠顯著改善大鼠心肌梗死后Cx43的表達，可能與其報道中能改善心肌梗死后心律失常和心功能不全有關。

[關鍵詞]心肌梗死；參松養(yǎng)心膠囊；美托洛爾；縫隙連接蛋白

心肌梗死是臨床上常見的心臟疾病，多數(shù)患者常常會伴有心率失常，嚴重者會出現(xiàn)心室顫動進而導致猝死。因此心臟梗死嚴重影響患者的生活質量，危害生命。但是目前臨床上常見的抗心律失常的藥物在改善患者心律失常的同時，會出現(xiàn)很多并發(fā)癥導致死亡率的增加。因此尋找一種能夠改善患者心律失常同時，增強療效，改善患者預后，減少患者的死亡率的藥物至關重要。參松養(yǎng)心膠囊由五味子、麥冬、丹參、黃連等多種中藥組成的復方劑。有研究發(fā)現(xiàn)，參松養(yǎng)心膠囊能夠通過抑制離子通道來改善心律失常，并且預后良好，減少了病死率和死亡率。但是具體的作用機制尚不清楚。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，縫隙連接蛋白43（eonnexin43，Cx43）在室性心律失常發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。因此本文建立心肌梗死的模型來研究參松養(yǎng)心膠囊治療對Cx43表達的影響及可能的機制。

1材料與方法

1.1材料：雄性SD大鼠60只，體重250～300g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。Cx43單克隆抗體和辣根酶標記二抗購自美國Abcaln公司；DAB顯色試劑盒，蘇木素購自北京中杉金橋公司；Trizol Reagent購自Invit.mgen公司，逆轉錄試劑盒和擴增試劑盒均購自ThermoFisher Scientific公司，參松養(yǎng)心膠囊購自北京以嶺藥業(yè)有限公司（國藥準字Z20103032，產(chǎn)品批號20160781），酒石酸美托洛爾片購自阿斯利康制藥有限公司（國藥準字H32025392，產(chǎn)品批號20153302L）。

1.2動物模型的建立及分組：取60只sD大鼠，隨機分為非心肌梗死組30只與心肌梗死組30只。梗死組以戊巴比妥（30mg/kg）耳緣靜脈麻醉后，經(jīng)前胸暴露心臟，結扎冠狀動脈左前降支。非梗死組采取假手術，以戊巴比妥（30me_/kg）麻醉后，經(jīng)前胸暴露心臟后在冠狀動脈下穿線，但不結扎。以心電監(jiān)護檢測顯示I、Ⅱ、aVL導聯(lián)sT段抬高0.2mv以模型建造成功的標準。造模成功后，將梗死組與非梗死組分別隨機分為三組（分別為對照組10只，美托洛爾組10只，參松養(yǎng)心膠囊組10只），各以普食（對照組），普食+美托洛爾（美托洛爾劑量0.5g/kg·d），普食+參松養(yǎng)心膠囊（參松養(yǎng)心膠囊原粉0.8g/kg·d）喂養(yǎng)8周后，處死動物，取心肌梗死周圍組織。

1.3觀察指標：

1.3.1心肌細胞中Cx43的檢測：將取出的心臟組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，包埋后連續(xù)切片，切片厚度控制在4t_tm，采用免疫組織化學sP法檢測心臟心肌細胞中Cx43的表達。染色步驟嚴格參照試劑盒說明書。一抗Cx43（1：300）4℃過夜，DAB染色，蘇木素復染，分化。以磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為實驗的陰性對照。在400倍鏡下隨機選取6個視野，用Image J軟件分析圖片的平均陽性表達面積與積分光密度值。

1.3.2 western blot技術方法檢測心肌細胞中Cx43蛋白的表達：取心臟組織，按照RAPI裂解液說明書提取細胞中的總蛋白?？捡R斯亮藍法對總蛋白進行定量。取30μg總蛋白采用10%SDS-PAGE分離蛋白，電泳1.5小時后轉移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1h，加鼠抗Cx43單克隆抗體（1：2000）4℃過夜，PBS清洗后加入二抗[IgG1：2000）]，37℃孵育2h，最后電化學發(fā)光顯影后用凝膠成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad，USA）測蛋白條帶光密度值。本實驗選用GAPDH作為內(nèi)參對照。以Cx43與GAPDH蛋白的光密度值的比值作為Cx43的相對表達量。

1.3.3 RT-PCR技術方法檢測心肌細胞中Cx43mRNA的表達：取心臟組織，采用Trizol試劑一步法提取細胞中的RNA，嚴格按照逆轉錄試劑盒和PCR擴增試劑盒說明書操作，將細胞RNA反轉錄成eDNA，然后擴增成DNA。

1.4統(tǒng)計學處理：采用SPSS22.0版數(shù)據(jù)分析軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，方差分析比較組間差異性，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1一般情況：各組動物均無死亡、飲食異常和腹瀉等情況，按原定計劃后處死取目標組織。

2.2 Cx43免疫組化染色結果：在非梗死組，各組Cx43蛋白表達強烈，且均勻的分布在細胞與細胞之間的連接處?？梢娝鼈兂首攸S色顆粒狀表達，主要位于閏盤內(nèi)，成線狀排列，與細胞長軸方向垂直。與之比較，在各梗死組Cx43表達明顯減弱且分布紊亂。尤其在梗死組，對照組的Cx43表達明顯減弱，甚至全部消失，而參松養(yǎng)心膠囊組及美托洛爾組梗死區(qū)的Cx43表達減弱和分布的紊亂彌散程度均較?。▓D1、圖2見封三）。

2.3 Cx43免疫組化結果分析：圖象定量分析顯示在梗死組，與對照組相比，參松養(yǎng)心膠囊組和美托洛爾組Cx43陽性表達面積明顯升高（2532.70±282.70）vs（1421.70±326.50）（P<0.05）和（2842.50±336.50）vs（1421.70±326.50）（P<0.05）。同樣兩組測定的積分光密度值也明顯高于對照組（399.24±66.54）vs（223.74±42.15）（P<0.05）和（436.74±78.29）vs（223.74±42.15）（P<0.05）。但參松養(yǎng)心膠囊組與美托洛爾組之間差異無統(tǒng)計學意義。圖象定量分析顯示在非梗死組，三者之間的Cx43陽性表達面積和積分光密度值差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.4 Western blot結果分析：在非梗死組各組的蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。在梗死組中對照組Cx43表達明顯低于參松養(yǎng)心膠囊組及美托洛爾組（0.31±0.12）units vs（1.50±0.21）units（P<0.05）和（0.31±0.12）units vs（1.39±0.16）units（P<0.05），但參松養(yǎng)心膠囊組與美托洛爾組之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.5RT-PCR結果分析：在非梗死組，各組的Cx43mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。但在梗死組中對照組Cx43mRNA表達明顯低于參松養(yǎng)心膠囊組及美托洛爾組（0.29±0.09）units vs（0.56+0.12）units（P<0.05）和（0.29+0.09）units vs（0.57±0.14）tmits（P<0.05），而參松養(yǎng)心膠囊組與美托洛爾組之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

3討論

Cx43是心室肌縫隙連接通道的主要構成成分，參與著細胞間的信號傳導。有研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后心肌細胞中的連接蛋白Cx43會發(fā)生數(shù)量，分布等方面的顯著改變。在Peter等的研究中報道，在構建的心肌梗死的犬模型中發(fā)現(xiàn)心外膜梗死邊緣區(qū)的心肌細胞的Cx43數(shù)量顯著降低，而且分布也發(fā)生了顯著的變化；而在離心肌梗死稍遠區(qū)的心肌細胞的Cx43分布未見明顯變化，但是其數(shù)量卻又顯著地降低。而本研究結果顯示在非梗死組，各組Cx43蛋白表達強烈，且均勻地分布在細胞與細胞之間的連接處?？梢娝麄兂首攸S色顆粒狀表達，主要位于閏盤內(nèi)，成線狀排列，與細胞長軸方向垂直。與之比較，在梗死組各組Cx43表達明顯減弱且分布紊亂。尤其在對照組，梗死區(qū)的Cx43表達明顯減弱，甚至全部消失，而參松養(yǎng)心膠囊組及美托洛爾組梗死區(qū)的Cx43表達減弱和分布的紊亂彌散程度均較小，與國內(nèi)外的研究報道一致。

Cx43是構成心室肌細胞間縫隙連接（gap june.tion，GJ）通道最主要的蛋白，也是心室肌細胞間電流傳導的主要導體。有研究報道，縫隙連接的連接蛋白43是冠狀動脈阻塞后心肌梗死范圍大小的最主要的決定因素之一。而本研究結果發(fā)現(xiàn)梗死組的Cx43蛋白的表達明顯高于非梗死組，經(jīng)美托洛爾和參松養(yǎng)心膠囊藥物干預后，心肌細胞中Cx43蛋白的表達出現(xiàn)了明顯的降低。在梗死組，與對照組相比，參松養(yǎng)心膠囊組和美托洛爾組Cx43陽性表達面積明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。同樣兩組測定的積分光密度值也明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。但參松養(yǎng)心膠囊組與美托洛爾組之間差異無統(tǒng)計學意義（P<0.05）。而在非梗死組，三者之間的Cx43陽性表達面積和積分光密度值差異無統(tǒng)計學意義。提示美托洛爾與參松養(yǎng)心膠囊兩藥均能改善心肌梗死后心律失常和心功能不全。

Lindsey等的研究報道在心肌梗死的小鼠模型的心肌連接蛋白Cx43的陽性表達面積明顯減少，而且Cx43蛋白的表達水平也比對照組有明顯的降低，但是Cx43rnRNA的表達卻未見明顯的改變。本研究結構顯示，與對照組相比，SD大鼠心肌梗死模型中心肌連接蛋白Cx43的陽性表達和Cx43mRNA，蛋白的表達均出現(xiàn)了明顯的改變（P<0.05），該結果與Amino等的研究一致，在大鼠心肌梗死后心肌連接蛋白Cx43的分布與mRNA和蛋白的水平明顯減少（P<0.05），提示心肌細胞梗死后心肌連接蛋白發(fā)生了重構現(xiàn)象。在經(jīng)美托洛爾和參松養(yǎng)心膠囊藥物治療后，心肌細胞中的心肌連接蛋白的mRNA和蛋白的水平出現(xiàn)了明顯的升高，提示美托洛爾和參松養(yǎng)心膠囊兩藥均能夠通過調節(jié)心肌連接蛋白Cx43的表達來發(fā)揮改善心肌梗死后心臟重構的作用。但是與美托洛爾相比，參松養(yǎng)心膠囊對Cx43的調節(jié)差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

因此，通過上述實驗結果可推斷，參松養(yǎng)心膠囊能夠通過調節(jié)心肌細胞中心肌連接蛋白Cx43的表達來延緩心肌梗死后心臟重構的病理變化，其作用和美托洛爾相當。但是關于具體的作用機制尚不清楚，有待進一步的研究。