侯金鳳+李珉+齊麟

[摘要] 目的 建立衍生化氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)甲磺酸左氧氟沙星片中甲磺酸乙酯的含量。 方法 采用柱前NaI-H2O碘化衍生，甲磺酸乙酯和內(nèi)標(biāo)化合物甲磺酸正丁酯分別經(jīng)衍生化反應(yīng)后得到碘乙烷和碘丁烷，經(jīng)聚乙二醇為固定相的熔融石英毛細(xì)管柱（0.32 mm× 60 m，0.25 μm）分離，質(zhì)譜法SIM模式下檢測(cè)衍生化產(chǎn)物碘乙烷和碘丁烷，以碘乙烷和碘丁烷的峰面積比值計(jì)算甲磺酸乙酯的含量。 結(jié)果 方法在2.5～150 ng/mL范圍之間，具有良好的線性（r = 0.9999）；檢測(cè)限為0.5 ng/mL，回收率為100.5%（RSD = 1.2%），重復(fù)性RSD為0.6%（n = 6），方法耐用性好，1批原料和3批樣品中均未檢出甲磺酸乙酯。 結(jié)論 該方法靈敏、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速，能夠用于測(cè)定甲磺酸左氧氟沙星合成和制劑過(guò)程中有可能產(chǎn)生的甲磺酸乙酯基因毒性雜質(zhì)含量的測(cè)定。

[關(guān)鍵詞] 甲磺酸左氧氟沙星；甲磺酸乙酯；基因毒性雜質(zhì)；氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法

[中圖分類(lèi)號(hào)] R917 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）01（c）-0126-04

[Abstract] Objective To establish a derivative gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） method for analyzing the contents of ethyl methanesulfonate （EMS） in Levofloxacin Mesylate Tablets. Methods Pre-column NaI-H2O derivating method was used， and the derivatives ethyl iodide and iodine butane were obtained from EMS and n-butyl methanesulfonate （BMS） derivatization. The derivatives were separated on a DB-WAX （0.32 mm×60 m， 0.25 μm） fused-silica capillary column firstly， and then detected by mass spectrometry under single ion monitoring （SIM） mode. The content of EMS was calculated by the area ratio of ethyl iodide to iodine butane. Results The method showed good linearity （r > 0.9999） over the range of 2.5-150 ng/mL. The limit of detection was 0.5 ng/mL， the recovery was 100.5% （RSD = 1.2%） and the repeatability RSD was 0.6% （n = 6）. The method also showed good robustness. No ethyl methanesulfonate was detected in one batch of API and three batches of tablets. Conclusion The method is sensitive， simple， accurate and rapid， and it can be used for the determination of genotoxic impurity EMS， which may be generated in the synthesis and preparation of Levofloxacin Mesylate.

[Key words] Levofloxacin Mesylate； Ethyl Methanesulfonate； Genotoxic impurity； Gas chromatography-mass spectrometry

甲磺酸左氧氟沙星是左氧氟沙星甲磺酸鹽的一水合物，抗菌活性是氧氟沙星的2倍，毒性低[1]。左氧氟沙星最早由日本第一制藥研制開(kāi)發(fā)，1996年，北京雙鶴藥業(yè)研制開(kāi)發(fā)了甲磺酸左氧氟沙星，并于1998年在國(guó)內(nèi)上市，商品名為利復(fù)星[2-3]。甲磺酸左氧氟沙星在合成和制劑過(guò)程中用到甲磺酸和乙醇，可能導(dǎo)致甲磺酸乙酯（EMS）的生成[4]。而甲磺酸酯類(lèi)作為遺傳毒性雜質(zhì)[5]，研究表明可能會(huì)誘發(fā)基因突變和染色體畸變，并且對(duì)大鼠和小鼠有致癌作用[6-7]。歐洲藥品局（EMEA）和美國(guó)FDA相繼出臺(tái)了基因毒性雜質(zhì)限度的指導(dǎo)原則，對(duì)基因毒性雜質(zhì)做出限度規(guī)定[8-10]。目前，已報(bào)道的EMS測(cè)定方法有氣相色譜法（GC）[11-13]、液質(zhì)聯(lián)用法（LC-MS）[14-16]和氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）[17-19]。由于GC法本身的缺陷，使得該法的靈敏度較低，而LC-MS法操作較為繁瑣。本文參考?xì)W洲藥典8.0版《甲磺酸甲酯、甲磺酸乙酯、甲磺酸異丙酯在原料藥中的測(cè)定》[20]，建立簡(jiǎn)便、快速的衍生化GC-MS法，測(cè)定甲磺酸左氧氟沙星原料和片劑中可能存在的EMS。

1 儀器與試藥

Thermo Scientific氣質(zhì)聯(lián)用儀，Thermo公司產(chǎn)品，配有Trace GC ULTRA氣相色譜系統(tǒng)，包括TriPlus AS頂空進(jìn)樣器、柱溫箱、TSQ Quantum三重四極桿質(zhì)譜及Xcalibur數(shù)據(jù)處理軟件。

甲磺酸乙酯對(duì)照品（EMS，批號(hào)：10315，純度99.5%，Dr.Ehrenstorfer Gmbh公司）；甲磺酸正丁酯對(duì)照品（批號(hào)：0143739-130930000，純度95%，F(xiàn)luorochem有限公司）；甲磺酸左氧氟沙星原料（批號(hào)：AA130337，北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司）；甲磺酸左氧氟沙星片（批號(hào)：120732、120733、120734，北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司）；碘化鈉（批號(hào)：F20110504，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；硫代硫酸鈉（批號(hào)：F20081008，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（HPLC級(jí)，Merck公司）；甲苯（批號(hào)：20121008，分析純，北京現(xiàn)代東方精細(xì)化學(xué)品有限公司）；水（去離子水，Milli Q制備）。endprint

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

氣相色譜，色譜柱：聚乙二醇為固定相的熔融石英毛細(xì)管柱（DB-WAX，0.32 mm× 60 m，0.25 μm）；柱溫：40℃，保持1 min；5℃/min升溫至130℃；30℃/min升溫至210℃，保持7 min；載氣：高純氦氣，流速：0.8 mL/min，恒流模式；進(jìn)樣針溫度：110℃；進(jìn)樣口溫度：130℃；分流流量：10 mL/min；平衡溫度：60℃；平衡時(shí)間：30 min；頂空進(jìn)樣。

質(zhì)譜，傳輸線溫度：210℃；離子源溫度：250℃；電離源：EI源；能量：70 eV；分析器：四極桿質(zhì)量分析器；監(jiān)測(cè)模式：SIM模式下監(jiān)測(cè)m/z156、m/z184和m/z127，其中m/z156和m/z184分別為碘乙烷（甲磺酸乙酯衍生化產(chǎn)物）和碘丁烷（內(nèi)標(biāo)物甲磺酸正丁酯衍生化產(chǎn)物）的定量離子，m/z127為碘乙烷和碘丁烷的定性離子。

2.2溶液配制

2.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液配制 取甲磺酸正丁酯對(duì)照品溶液10 μL，置于10 mL量瓶中，加混合溶劑[水-乙腈（20∶80）]使溶解并稀釋至刻度，搖勻。取該溶液20 μL，置于100 mL量瓶中，加混合溶劑稀釋至刻度，搖勻。

2.2.2 衍生化試液配制 稱(chēng)取無(wú)水硫代硫酸鈉30 mg和碘化鈉60.0 g，置于50 mL量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制 稱(chēng)取甲磺酸乙酯對(duì)照品約25 mg，精密稱(chēng)定，置10 mL量瓶中，加甲苯溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取該溶液1 mL，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋制成濃度為5 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。分別精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，用內(nèi)標(biāo)溶液稀釋制成5、10、25、50、100、150、200、250、300 ng/mL的系列濃度甲磺酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

2.2.4 供試品溶液配制 取甲磺酸左氧氟沙星片20片，精密稱(chēng)定，研細(xì)，精密稱(chēng)取適量（約相當(dāng)于左氧氟沙星25 mg，原料直接稱(chēng)取相當(dāng)于左氧氟沙星25 mg），置20 mL頂空瓶中，分別精密加入內(nèi)標(biāo)溶液0.5 mL和衍生化試液0.5 mL，密封，作為供試品溶液。

2.4 方法驗(yàn)證

2.4.1 專(zhuān)屬性 稱(chēng)取甲磺酸左氧氟沙星片空白輔料適量（約相當(dāng)于左氧氟沙星25 mg），置20 mL頂空瓶中，加內(nèi)標(biāo)溶液0.5 mL和衍生化試液0.5 mL，密封。結(jié)果表明，在碘乙烷出峰處，無(wú)干擾，方法專(zhuān)屬性良好。見(jiàn)圖1。

2.4.2 線性 分別取系列濃度的甲磺酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0.5 mL，置20 mL頂空瓶中，加衍生化試液0.5 mL，密封。以溶液濃度為橫坐標(biāo)，碘乙烷和內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)，線性回歸方程為：Y = 0.002 764+0.016 08X（r = 0.9999）。結(jié)果表明：甲磺酸乙酯濃度在2.5～150 ng/mL之間，線性關(guān)系良好。

2.4.3 檢測(cè)限與定量限 用內(nèi)標(biāo)溶液分別配制濃度為5、1、0.5、0.25 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別精密量取0.5 mL，置20 mL頂空瓶中，加衍生化試液0.5 mL，密封。碘乙烷色譜峰信噪比約為10時(shí)的濃度為定量限，信噪比約為3時(shí)的濃度為檢測(cè)限。結(jié)果表明，定量限為2.5 ng/mL（圖1），檢測(cè)限為0.5 ng/mL（圖2）。

2.4.4 回收率 取甲磺酸左氧氟沙星片20片，研細(xì)，稱(chēng)取適量（約含左氧氟沙星25 mg），置20 mL頂空瓶中，分別精密加入低、中、高三個(gè)濃度的對(duì)照品溶液（10、50、150 ng/mL）0.5 mL和衍生化試液0.5 mL，密封，每濃度平行3份。另稱(chēng)取本品細(xì)粉適量（約含左氧氟沙星25 mg），制備未加標(biāo)供試品溶液。結(jié)果表明，低、中、高三個(gè)濃度的甲磺酸乙酯平均回收率為100.5%，RSD為1.2%。見(jiàn)表1。

2.4.5 精密度 精密量取濃度為100 ng/mL甲磺酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0.5 mL，置20 mL頂空瓶中，加衍生化試液0.5 mL，密封，平行6份。碘乙烷與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的RSD為0.6%，滿(mǎn)足分析要求。

2.4.6 溶液穩(wěn)定性 新制濃度為100 ng/mL甲磺酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，分別于配制后0、2、4、6、8、24 h精密量取0.5 mL，置20 mL頂空瓶中，加衍生化試液0.5 mL，密封。結(jié)果表明，甲磺酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液在室溫條件下放置24 h穩(wěn)定。見(jiàn)表2。

2.4.7 色譜系統(tǒng)的耐用性 精密量取濃度為100 ng/mL甲磺酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0.5 mL，置20 mL頂空瓶中，加衍生化試液0.5 mL，密封。在其他條件不變的情況下，將40～130℃的升溫速率分別設(shè)為每分鐘4、5、6℃，各平行2份樣品。結(jié)果表明，RSD<10%，方法耐用性良好。見(jiàn)表3。

2.5 供試品溶液測(cè)定

取供試品溶液分別測(cè)定。計(jì)算碘乙烷與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程中，計(jì)算測(cè)定的濃度。按（1）式和（2）式分別計(jì)算甲磺酸左氧氟沙星片和原料中甲磺酸乙酯的含量：

片劑中甲磺酸乙酯含量（%）=（C×W×10-9×100）/（W×L×10-3）（1）；

原料中甲磺酸乙酯含量（%）=（C×10-9×100）/（W×0.76×10-3）（2）。

式中，C為樣品測(cè)定濃度（ng/mL），W為平均片重（g），W為樣品稱(chēng)樣量（mg），L為標(biāo)示量（g/片），0.76為左氧氟沙星與甲磺酸左氧氟沙星的折算系數(shù)。

測(cè)定了1批次原料和3批次的甲磺酸左氧氟沙星片，均未檢出。

3 討論

甲磺酸烷基酯類(lèi)雜質(zhì)具有遺傳毒性，屬于EMEA中明確要求藥品中應(yīng)嚴(yán)格控制的雜質(zhì)，毒理學(xué)關(guān)注閾值（TTC）日最大攝入量為1.5 μg/d[21]。根據(jù)甲磺酸左氧氟沙星最大日服用量為750 mg，計(jì)算甲磺酸酯類(lèi)雜質(zhì)總量的限度為0.0002%。本文所建立方法靈敏度高，檢測(cè)限和定量限分別為0.5 ng/mL和2.5 ng/mL，按照供試品濃度25 mg/mL計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別為0.000 002%和0.000 01%，遠(yuǎn)低于限度值。此外，該方法線性范圍寬，準(zhǔn)確性好，簡(jiǎn)便、快速，成功地實(shí)現(xiàn)了甲磺酸左氧氟沙星合成和制劑過(guò)程中有可能產(chǎn)生的甲磺酸乙酯基因毒性雜質(zhì)的有效控制，為藥物的安全性保障提供了很好的技術(shù)支撐。endprint

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（收稿日期：2017-08-30 本文編輯：張瑜杰）endprint