武謙虎+徐衛(wèi)東+李偉東

[摘要] 目的 研究空心蓮子草總黃酮對乙肝病毒的體外抑制作用。 方法 將HepG2.2.15細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，然后隨機(jī)分為陰性對照組、實驗組和陽性對照組。陰性對照組用100 mL/L DMSO處理；各實驗組分別加入800、400、200、100 mg/L的空心蓮子草總黃酮，陽性對照組用800、400、200、100 mg/L的拉米夫定共培養(yǎng)；應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和光密度測定法研究空心蓮子草總黃酮對HepG2.2.15細(xì)胞系HBsAg與HBeAg表達(dá)的影響。 結(jié)果 各實驗組對HepG2.2.15細(xì)胞中HBsAg的抑制率均有明顯的升高，實驗組與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），實驗組與陽性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），實驗組中HBsAg的抑制率跟藥物劑量呈正相關(guān)；實驗組各劑量對HepG2.2.15細(xì)胞中HBeAg的抑制率均有明顯的升高，實驗組與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01），實驗組與陽性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），實驗組中HBeAg抑制率跟藥物劑量呈正相關(guān)。 結(jié)論 空心蓮子草總黃酮對HepG2.2.15細(xì)胞中HBsAg和HBeAg表達(dá)均有明顯的抑制作用。體外細(xì)胞培養(yǎng)證實空心蓮子草總黃酮有較強(qiáng)的抗乙肝病毒作用。

[關(guān)鍵詞] 空心蓮子草；總黃酮；HepG2.2.15細(xì)胞；HBsAg；HBeAg

[中圖分類號] R969 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）01（a）-0034-04

[Abstract] Objective To study the anti-HBV action of total flavonoids extracted from Alternanthera philoxeroides in vitro. Methods HepG2.2.15 cells were inoculated into the cell culture plates and then randomly divided into negative control group， experimental group and positive control group. The negative control group was treated with 100 mL/L DMSO， the experimental groups were treated with 800， 400， 200 and 100 mg/L total flavonoids extracted from Alternanthera philoxeroides. In the positive control groups， lamivudine was added at the concentration of 800， 400， 200 and 100 mg/L. Cell culture and optical density assay were used to study the effects of total flavonoids from Alternanthera philoxeroides on the expression of HBsAg and HBeAg in HepG2.2.15 cell line. Results The inhibit the expression of HBsAg in HepG2.2.15 cells in each experimental group was obviously higher， compared with the negative group， the difference was statistically significant （P < 0.01） and compared with the positive control group， the difference was statistically significant （P < 0.05）， the inhibition rate of HBsAg in the experimental group was positively correlated with the dose of the drug. Each dose of the experimental groups had obvious inhibitory effects on the expressions of HBeAg in HepG2.2.15 cells， compared with the negative control group， the difference was statistically significant （P < 0.01） compared with and positive control group， the difference was statistically significant （P < 0.05）， the inhibition rate of HBeAg in the experimental group was positively correlated with the dose of the drug. Conclusion Total flavonoids extracted from Alternanthera philoxeroides has obvious inhibitory effects on the expressions of HBsAg and HBeAg in HepG2. 2. 15 cells. Total flavonoids extracted from Alternanthera philoxeroides has strong anti-HBV action in vitro.endprint

[Key words] Alternanthera philoxeroides； Total flavon?oids； HepG2. 2. 15 Cells； HBsAg； HBeAg

空心蓮子草為莧科植物空心蓮子草Alternanthera philoxeroides（Mart.）Griseb.的干燥全草，又名空心莧，水花生。原產(chǎn)巴西，后隨植物種子帶入我國成為農(nóng)業(yè)有害雜草。我國自20世紀(jì)70年代起，開始空心蓮子草防治感染性疾病的臨床應(yīng)用研究。據(jù)《中藥大辭典》記載，本品性寒、味苦；具有清熱、涼血、解毒的功效?，F(xiàn)代臨床用于治療麻疹、乙型腦炎、流行性出血熱、急性肝炎等病毒性疾病。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)空心蓮子草對四氯化碳、半乳糖胺、乙醇所致的化學(xué)性肝損傷和卡介苗+脂多糖所致的免疫性肝損傷均具有一定的保護(hù)作用[1-3]；臨床觀察也表明空心蓮子草能有效改善慢性乙肝患者的肝臟功能和臨床癥狀[4]；尚有文獻(xiàn)報道其提取物體外具有抗多種病毒[5]和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[6]等作用。為探討空心蓮子草對乙肝病毒體外抑制作用，為空心蓮子草用于治療乙型肝炎提供理論依據(jù)，本研究提取分離了空心蓮子草的總黃酮部位，且用該提取物做了HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)試驗，現(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 藥物、主要試劑和儀器

HBeAg、HBsAg試劑盒（上?？迫A公司，批號：2016120066），胎牛血清（上海雙洳生物科技有限公司，批號：20161212），DMEM、G418、谷氨酰胺均為分析純試劑。二氧化碳培養(yǎng)箱（美國HealForce公司），倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司，型號：TS100 Nikon），超凈臺（中國蘇州楓橋凈化設(shè)備有限公司），細(xì)胞培養(yǎng)盒、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國Coming），酶標(biāo)儀（美國molecular device公司，型號：Spectra Max 190）。HepG2.2.15細(xì)胞：南京大學(xué)徐力致老師惠贈。藥物空心蓮子草于2013年11月采集于江蘇省鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)西麓鎮(zhèn)，經(jīng)中國藥科大學(xué)黃達(dá)芳副教授鑒定為空心蓮子草 A. philoxeroides（Mart.）Griseb.。從空心蓮子草中提取分離出總黃酮（經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院江蘇省中藥炮制重點實驗室波譜解析確定其主要成分為黃酮類化合物）。拉米夫定（中國蘇州葛蘭素史克制藥有限公司，批號：16120014）

1.2 方法

1.2.1 藥物制備 ①供試藥制備?？招纳徸硬荽址?00 g，采用回流提取法，分別以藥材量12、10、10倍量60%乙醇溶液提取3次，每次提取1 h，過濾合并濾液，減壓回收溶劑至無醇味。使用D101樹脂精制，上樣液濃度為6 mg/mL，上樣量100 mg/g干樹脂，以50 g/L NaHCO3調(diào)節(jié)pH值至6，上樣液流速2 mL/min，吸附1 h。先用提取物量5倍體積水洗脫，再用10倍體積70%乙醇溶液洗脫，洗脫流速3 mL/min。收集70%乙醇溶液洗脫液，減壓回收至無醇味，經(jīng)波譜解析確定結(jié)構(gòu)，即得空心蓮子草總黃酮。②藥物配制?？招纳徸硬菘傸S酮和拉米夫定分別用1000 mL/L二甲基亞砜（DMSO）溶解，配制成160 mg/L濃度，再以50 g/L NaHCO3調(diào)節(jié)pH值至6.8～7.2，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌備用。

1.2.2 HepG2.2.15細(xì)胞系的培養(yǎng)體系 在DMEM中加入150 mg/L胎牛血清，2 mmol/L谷氨酰胺，380 mg/L G418，10 mL/L鏈霉素、青霉素，以50 g/L NaHCO3調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4培養(yǎng)，每10天傳代一次。

1.2.3 空心蓮子草總黃酮細(xì)胞毒性試驗 將HepG2.2.15細(xì)胞按1×108/L接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，然后隨機(jī)分成陰性對照組、實驗組和陽性對照組，分別在陰性對照組中加入100 mL/L DMSO；實驗組各組中加入800、400、200、100 mg/L濃度的空心蓮子草總黃酮，陽性對照組各組中加入800、400、200、100 mg/L濃度的拉米夫定共培養(yǎng)。參照文獻(xiàn)[7，8]，在其規(guī)定條件下培養(yǎng)、吸去上清液、固定細(xì)胞、洗滌、抽取測試所需細(xì)胞上清液，用自動酶標(biāo)儀于在吸收波長 515 nm條件下，測定該細(xì)胞上清液吸光度（A）。

1.2.4 空心蓮子草總黃酮對HepG2.2.15細(xì)胞系HBsAg與HBeAg表達(dá)的影響 參照文獻(xiàn)[7-8]，按其方法接種和培養(yǎng)HepG2.2.15細(xì)胞，然后以800、400、200、100 mg/L的藥物濃度將實驗組和陽性對照組各組份加入細(xì)胞板中，每個濃度設(shè)2個孔，設(shè)100 mL/L DMSO組8孔為陰性對照組，分別于第3、6、9天取培養(yǎng)基上清液于-200℃凍存，測定A值，計算藥物對HBsAg、HBeAg分泌的抑制率（%）[抑制率（%）=（對照組吸光度值-給藥組吸光度值）/（對照組吸光度值-空白組吸光度值）×100%]、50%抑制濃度（IC50）、治療指數(shù)（TI=CD50/IC50）。當(dāng)TI>2時為有效，TI=1時為毒性作用較強(qiáng)，TI<1時為毒性作用強(qiáng)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗。以P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 空心蓮子草總黃酮對 HepG2.2.15細(xì)胞系 HBsAg表達(dá)的抑制作用

應(yīng)用 HepG2.2.15細(xì)胞系培養(yǎng)系統(tǒng)實驗證明：實驗組中各劑量組對HBsAg的抑制率均有明顯的升高（表1）。實驗組與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；實驗組與陽性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；實驗組中HBsAg的抑制率跟藥物劑量呈正相關(guān)。表明空心蓮子草總黃酮對對HepG2.2.15細(xì)胞中HBsAg表達(dá)有明顯的抑制作用。endprint

2.2 空心蓮子草總黃酮對 HepG2.2.15細(xì)胞系 HBeAg表達(dá)的抑制作用

應(yīng)用HepG2.2.15細(xì)胞系培養(yǎng)系統(tǒng)實驗證明：實驗組各劑量組對HBeAg的抑制率均有明顯的升高。實驗組與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；實驗組與陽性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；實驗組中HBeAg抑制率跟藥物劑量呈正相關(guān)（表2）。表明空心蓮子草總黃酮對對HepG2.2.15細(xì)胞中HBeAg表達(dá)有明顯的抑制作用。

3 討論

本實驗從空心蓮子草中提取分離出空心蓮子草總黃酮，研究發(fā)現(xiàn)其對HBsAg和HBeAg表達(dá)均有明顯的抑制作用（HBsAg和HBeAg的抑制率，實驗組與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；實驗組與陽性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）；實驗組中HBsAg和HBeAg的抑制率跟藥物劑量均呈正相關(guān)），從細(xì)胞藥理學(xué)研究水平上證實空心蓮子草總黃酮具有較強(qiáng)的體外抗HBV活性。本實驗也發(fā)現(xiàn)，空心蓮子草總皂苷對HBsAg和HBeAg表達(dá)均有明顯的抑制作用（與陰性對照組比較，P < 0.01；與陽性對照組比較，P < 0.05），同時采用定量PCR方法檢測，空心蓮子草總皂苷（200 mg/L）可使培養(yǎng)基中HBV-DNA轉(zhuǎn)陰。

曾有學(xué)者從從空心蓮子草中分離鑒定了10個三萜皂苷類化合物，抗HBV活性篩選表明，齊墩果酸（oleanolic acid）和4，5-dihydroblumenol 具有較強(qiáng)的抗HBV活性[4，9]。近年來，對空心蓮子草抗病毒的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行了研究，確定了其有效物質(zhì)部位主要為黃酮和皂苷類化合物[10-12]。以上表明空心蓮子草對乙肝病毒具有較好的體外抑制作用。

既往研究表明，空心蓮子草對呼吸道合胞病毒、甲型H3N2流感病毒等病毒均有抑制作用[13-15]。提示空心蓮子草是具有較好開發(fā)應(yīng)用前景的抗病毒中草藥。空心蓮子草曾以注射劑收錄于中國藥典（一部，1977年版），用于治療麻疹、流行性出血熱、病毒性肝炎等病毒性感染。但其抗乙肝病毒作用的藥效學(xué)作用及物質(zhì)基礎(chǔ)并不十分明確，尤其其抗乙肝病毒作用分子細(xì)胞藥理學(xué)的研究比較欠缺。

乙型肝炎由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的慢性傳染性疾病。全球共有20億人曾感染過HBV，其中3.5億人為慢性HBV 感染者，每年約有78.6萬人死于慢性HBV感染相關(guān)肝病。盡管乙型肝炎疫苗接種已使我國新發(fā)感染者得到明顯控制，但我國仍有慢性HBV感染者約8000萬例，其中慢性乙型肝炎患者高達(dá)2000余萬例[16]。臨床統(tǒng)計資料顯示，在慢性HBV感染者中，15%～25%最終死于與HBV感染相關(guān)的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepatocellular carci?noma，HCC），其中慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）、代償期和失代償期肝硬化患者的5年病死率分別為0～2%、14%～20%和70%～86%[17]，嚴(yán)重危害人類健康，必須盡快接受規(guī)范的抗乙肝病毒治療。僅十多年來，盡管隨著核苷類乙肝抗病毒藥物拉米夫定、阿德福韋酯、替比夫定、恩替卡韋、替諾福韋等不斷上市，對乙肝病毒有較好的抑制作用，但停藥后乙肝病毒變異或復(fù)發(fā)以及徹底從體內(nèi)清除乙肝病毒如HBV-cccDNA模板非常困難等諸多問題，仍然一直困擾著醫(yī)藥學(xué)研究工作者。因此尋找安全有效的抗HBV藥物是醫(yī)藥學(xué)工作者必須攻克一項醫(yī)學(xué)難題。

HepG2.2.15細(xì)胞是人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞衍生，經(jīng)HBV-DNA克隆和轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞HepG2.2.15細(xì)胞系，能轉(zhuǎn)錄、翻譯HBV基因，且其能較為穩(wěn)定、持久地向培養(yǎng)上清液中分泌HBsAg、HBeAg和HBV顆粒，細(xì)胞上清液中也可以測得到HBV-DNA。故HepG2.2.15細(xì)胞系便于應(yīng)用熒光定量檢測儀檢測HBsAg、HBeAg和HBV DNA，并對人有感染性，故是目前體外公認(rèn)的抗HBV藥物體外高通量篩選和評價較好的細(xì)胞模型之一[18-21]。

為了闡明空心蓮子草治療慢性乙肝的理論依據(jù)，今后尚需進(jìn)一步從化合物單體水平證明空心蓮子草所含其他有效成分的抗HBV活性，并需對其進(jìn)行體內(nèi)抗HBV活性及機(jī)制的深入探討，然后在充分臨床前研究基礎(chǔ)上進(jìn)行多中心隨機(jī)對照的藥物臨床試驗，爭取開發(fā)出用于臨床乙肝抗病毒治療的天然藥物。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 武謙虎，樊一橋，洪敏，等.空心蓮子草醇提物對小鼠免疫性肝損傷的保護(hù)作用[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2006，26（4）：373-375.

[2] 武謙虎，樊一橋，洪敏，等.空心蓮子草醇提物對化學(xué)性肝損傷的影響[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2006，22（1）：38-41.

[3] 閻納新，武謙虎. 空心蓮子草醇提物對小鼠急性酒精性肝損傷的防護(hù)作用[J].中國藥業(yè)，2015，24（14）：26-28.

[4] 吳翠松.空心蓮子草治療慢性乙肝的臨床療效觀察[J].醫(yī)學(xué)信息旬刊，2011，24（10）：6585.

[5] 方進(jìn)波，劉焱文，張彥文，等.空心蓮子草抗病毒活性成分研究[J].中草藥，2007，38（7）：976.

[6] 王巖.空心蓮子草正丁醇部位免疫調(diào)節(jié)作用研究[J].中國民族民間醫(yī)藥，2011，20（5）：36.

[7] 徐慶，陳全斌，義祥輝，等.荔枝核提取物對HepG2.2.15細(xì)胞系HBsAg與HBeAg表達(dá)的影響[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2004，24（7）：393-395.

[8] 王青青，余海.SRB顯色法用于抗癌藥物敏感性試驗的研究[J].科技通報，2000，16（2）：104-107.

[9] 師磊.空心蓮子草乙酸乙酯提取物抗病毒活性成分及質(zhì)量分析研究[D].武漢：湖北中醫(yī)學(xué)院，2008.endprint

[10] 李森.空心蓮子草抗病毒有效部位群提取物制備工藝及其成分分析研究[D].武漢：湖北中醫(yī)藥大學(xué)，2012.

[11] 廖鵬程.空心蓮子草有效部位凍干粉針劑的藥學(xué)研究[D].武漢：湖北中醫(yī)藥大學(xué)，2013.

[12] 李爽.空心蓮子草有效部位群提取物抗病毒活性及其成分分析研究[D].武漢：湖北中醫(yī)藥大學(xué)，2013.

[13] 蔣文玲，楊占秋，陳文，等.空心蓮子草有效成分抗呼吸道合胞病毒作用的實驗研究[J].廣州：南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2007，27（1）：62-64.

[14] 李爽，彭曉芝，廖鵬程，等.空心蓮子草有效部位提取物抗甲型H3N2流感病毒作用[J].天津中醫(yī)藥，2012，29（5）：478-480.

[15] 張周菊.空心蓮子草抗病毒有效部位群提取物的質(zhì)量評價體系研究[D].武漢：湖北中醫(yī)藥大學(xué)，2012.

[16] 王杰，魯鳳民.再認(rèn)識乙肝病毒實現(xiàn)臨床“治愈”[J].中華醫(yī)學(xué)信息導(dǎo)報，2017，32（1）：20.

[17] 王艷.HepG2.2.15細(xì)胞脂肪變性對HBV基因表達(dá)及SOCS-3和SREBP-1c通路的影響[D].太原：山西醫(yī)科大學(xué)，2011.

[18] 邊中啟，劉霜，劉明秋，等.靶向preC/C基因特異性RNA干擾對乙型肝炎病毒在肝癌細(xì)胞系中復(fù)制與表達(dá)的影響[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2012，92（11）：768-772.

[19] 朱錦宏，王春苗，吳紅，等.乙型肝炎病毒X基因siRNA對HepG2.2.15細(xì)胞的影響[J].實用醫(yī)學(xué)雜志，2016，32（13）：2120-2123.

[20] 楊偉，趙超，李婧，等.恩替卡韋和干擾素序貫作用對HepG2.2.15細(xì)胞HBV DNA復(fù)制的影響[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2016，25（4）：408-410.

[21] Jing-yao PANG，Kui-jun ZHAO，Jia-bo WANG，et al. Green tea polyphenol， epigallocatechin-3-gallate， posse?sses the antiviral activity necessary to fight against the hep?atitis B virus replication in vitro[J].Biomedicine & Biotec?hnology，2014，（6）：533-539.

（收稿日期：2017-09-11 本文編輯：李雅南）endprint