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        報(bào)告基因法測定聚乙二醇化Ⅰ型干擾素生物學(xué)活性的研究

        2018-03-07 20:03:14裴德寧于雷郭瑩
        中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2018年1期

        裴德寧+于雷+郭瑩

        [摘要] 目的 考察《中國藥典》(2015年版)中報(bào)告基因法測定聚乙二醇化Ⅰ型干擾素生物學(xué)活性的方法適用性。 方法 根據(jù)ICH指導(dǎo)原則,驗(yàn)證報(bào)告基因法的專屬性、線性、準(zhǔn)確性(回收率)、精密度(重復(fù)性、中間精密度)等指標(biāo),并對報(bào)告基因法與病毒抑制法的測定結(jié)果進(jìn)行比較。 結(jié)果 使用報(bào)告基因法測定聚乙二醇Ⅰ型干擾素活性具有良好的專屬性,劑量反應(yīng)關(guān)系符合四參數(shù)方程,回收率為85%~115%,重復(fù)性為6.66%~7.70%,不同測定日期、不同實(shí)驗(yàn)員和不同細(xì)胞代次的中間精密度分別為10.64%~11.01%、13.04%~15.12%和7.61%~8.54%,報(bào)告基因法與病毒抑制法的測定結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。 結(jié)論 報(bào)告基因法可以用于聚乙二醇化Ⅰ型干擾素生物學(xué)活性測定。

        [關(guān)鍵詞] 聚乙二醇化Ⅰ型干擾素;生物學(xué)活性;報(bào)告基因法;方法學(xué)驗(yàn)證

        [中圖分類號(hào)] R978.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210(2018)01(a)-0022-04

        [Abstract] Objective To investigate the applicability of reporter gene assay in Chinese Pharmacopoeia (2015 edition) for determination of the bioactivity of polyethylene glycol (PEG) type Ⅰ interferon. Methods According to ICH guidelines, specificity, linearity, accuracy (recovery) and precision (repeatability and intermediate precisions) of reporter gene assay were validated. The determination results of reporter gene assay and cytopathic inhibition assay were also compared. Results Application of reporter gene assay for determination of the bioactivity of PEG type Ⅰ interferon had good specificity, the dose-response of which was fitted to 4-parameter logistic model. The recovery rate was 85%-115%, the repeatability of the assay was 6.66%-7.70%. The intermediate precision of different dates, laboratory technicians and cell passages was 10.64%-11.01%, 13.04%-15.12% and 7.61%-8.54% respectively. The difference of the determination results between reporter gene assay and cytopathic inhibition assay was not statistically significant (P > 0.05). Conclusion The reporter gene assay is applicable for bioactivity determination of PEG type Ⅰ interferon.

        [Key words] Polyethylene glycol type Ⅰ interferon; Bioactivity; Reporter gene assay; Methodology validation

        干擾素是脊椎動(dòng)物受干擾素誘生劑作用后合成的一類具有細(xì)胞功能調(diào)節(jié)作用的蛋白,根據(jù)受體、結(jié)構(gòu)、來源的不同,分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三型,Ⅰ型干擾素包括α、β、ε、τ、ω、κ等亞型[1-3]。聚乙二醇化Ⅰ型干擾素是將Ⅰ型干擾素分子與聚乙二醇(PEG)分子通過共價(jià)鍵連接形成的化學(xué)修飾蛋白藥物,具有給藥次數(shù)少、血藥濃度波動(dòng)低、治療效果好等優(yōu)點(diǎn)。目前已上市的品種有聚乙二醇干擾素α2a、聚乙二醇干擾素α2b等,聚乙二醇化Ⅰ型干擾素的分子結(jié)構(gòu)、理化特性、生物學(xué)活性與Ⅰ型干擾素相比均有顯著差異[4-6]。

        報(bào)告基因法是通過檢測報(bào)告基因的表達(dá)來評價(jià)蛋白與蛋白之間或蛋白與細(xì)胞之間作用的方法。使用報(bào)告基因法測定干擾素生物學(xué)活性與經(jīng)典的細(xì)胞病變抑制法相比具有以下幾方面的優(yōu)勢:精密度高,耗時(shí)短,操作簡便,不使用病毒,無需在生物安全實(shí)驗(yàn)室操作[7],《中國藥典》三部(2015年版)[8]已將其收錄,用于Ⅰ型干擾素生物學(xué)活性的測定。為了研究聚乙二醇化Ⅰ型干擾素生物學(xué)活性能否使用報(bào)告基因法進(jìn)行測定,本研究將從專屬性、線性、準(zhǔn)確性、精密度等方面進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證?,F(xiàn)報(bào)道如下:

        1 材料與方法

        1.1 材料

        標(biāo)準(zhǔn)品:聚乙二醇干擾素α2b工作標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):J20130018WS,規(guī)格:1.04×107 U/mL),供試品:聚乙二醇干擾素α2b注射液3批(批號(hào):201609JS04,規(guī)格:3.3×105 U/0.5 mL;批號(hào):201609JS01,規(guī)格:5.0×105 U/0.5 mL;批號(hào):201610JS11規(guī)格:6.6×105 U/0.5 mL);Y型聚乙二醇(批號(hào):20160201,規(guī)格:100 mg/支);第3代HEK293puroISRE-Luc細(xì)胞、第5代人羊膜細(xì)胞(WISH細(xì)胞)、第3代水泡性口炎病毒均為中國食品藥品檢定研究院重組藥物室保存;M5型酶標(biāo)儀,購自MD公司;Softmax軟件,購自MD公司;Bright-GloTM熒光素酶檢測系統(tǒng),購自Promega公司。endprint

        1.2 方法

        1.2.1 報(bào)告基因法

        取標(biāo)準(zhǔn)品,用測定培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基)稀釋至每1 mL約含10 000 U,在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中做4倍系列稀釋,共8個(gè)稀釋度,每個(gè)稀釋度做2孔。取供試品,用測定培養(yǎng)液稀釋成每1 mL約含10 000 U,在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中做4倍系列稀釋,共8個(gè)稀釋度,每個(gè)稀釋度做2孔。HEK293 puroISRE-Luc細(xì)胞在完全培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清、2 μg/mL嘌呤霉素的MEM培養(yǎng)基)中貼壁生長,按1∶4傳代,每周2~3次。取培養(yǎng)的細(xì)胞棄去培養(yǎng)液,用PBS洗1次后消化和收集細(xì)胞,用測定培養(yǎng)液配制成每1 mL含3.5×105~4.5×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液。將配制完成的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液移入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔加入100 μL,然后將上述細(xì)胞懸液接種于同一96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔100 μL。于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)18~24 h,小心吸凈96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清液,按Bright-GloTM熒光素酶檢測系統(tǒng)說明書加入細(xì)胞裂解液和熒光素酶底物,用化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀進(jìn)行測定,使用Softmax軟件處理數(shù)據(jù),計(jì)算結(jié)果[8]。

        1.2.2 細(xì)胞病變抑制法

        WISH細(xì)胞在完全培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基)中貼壁生長,按1∶4傳代,每周2~3次。取培養(yǎng)的細(xì)胞棄去培養(yǎng)液,用PBS洗2次后消化和收集細(xì)胞,用完全培養(yǎng)液配制成每1 mL含2.5×105~3.5×105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液,接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔100 μL。于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4~6 h。取標(biāo)準(zhǔn)品,用測定培養(yǎng)液(含有7%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基)稀釋至每1 mL約含1000 U,在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中做4倍系列稀釋,共8個(gè)稀釋度,每個(gè)稀釋度做2孔。取供試品,用測定培養(yǎng)液稀釋成每1 mL約含1000 U,在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中做4倍系列稀釋,共8個(gè)稀釋度,每個(gè)稀釋度做2孔。將配制完成的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液移入接種WISH細(xì)胞的培養(yǎng)板中,每孔加入100 μL。于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)18~24 h,棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清液,將水泡性口炎病毒用攻毒培養(yǎng)液(含有3%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基)稀釋至約100 CCID50,每孔加入100 μL。于37℃、5%CO2培養(yǎng)約24 h(鏡檢標(biāo)準(zhǔn)品溶液的50%病變點(diǎn)在1 U/mL時(shí)終止培養(yǎng)),棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中的上清液,每孔加入染色液(取結(jié)晶紫50 mg,加無水乙醇20 mL溶解后,加水稀釋至100 mL)50 μL,室溫放置30 min后,用流水小心沖去染色液,并吸干殘留水分,每孔加入脫色液(取無水乙醇50 mL、乙酸0.1 mL,加水稀釋至100 mL)100 μL,室溫放置3~5 min。混勻后,用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測定OD值,使用Softmax軟件處理數(shù)據(jù),計(jì)算結(jié)果[8]。

        1.3 考察指標(biāo)

        1.3.1 線性及測定范圍

        按照“1.2.1”的方法進(jìn)行測定,考察標(biāo)準(zhǔn)品及供試品劑量反應(yīng)曲線的擬合方程、濃度范圍、相關(guān)系數(shù)、曲線平行性等指標(biāo)。

        1.3.2 專屬性

        按照“1.2.1”的方法分別測定供試品、測定培養(yǎng)液、Y型聚乙二醇(摩爾濃度與供試品相同),考察HEK293puroISRE-Luc細(xì)胞對它們的反應(yīng)性,評價(jià)方法的專屬性。

        1.3.3 加標(biāo)回收率

        按照“1.2.1”的方法測定供試品加標(biāo)回收率,標(biāo)準(zhǔn)品在加標(biāo)供試品中的含量分別為25%、50%和75%,每一個(gè)加標(biāo)供試品分別測定3次,計(jì)算平均值。加標(biāo)回收率計(jì)算公式:(加標(biāo)供試品測定值-供試品測定值)/加標(biāo)量×100%。

        1.3.4 精密度

        1.3.4.1 重復(fù)性 按照“1.2.1”的方法,在同一次試驗(yàn)內(nèi),對供試品進(jìn)行10次測定,計(jì)算10次結(jié)果的變異系數(shù),評價(jià)方法的重復(fù)性。

        1.3.4.2 中間精密度 按照“1.2.1”的方法,在3個(gè)不同的試驗(yàn)日期對供試品進(jìn)行測定,每個(gè)試驗(yàn)日期重復(fù)測定3次,取平均值作為該試驗(yàn)日期的測定結(jié)果,計(jì)算3個(gè)測定結(jié)果的變異系數(shù),評價(jià)不同日期測定結(jié)果的中間精密度。按照“1.2.1”的方法,在同一次試驗(yàn)內(nèi),由3名實(shí)驗(yàn)員對供試品進(jìn)行測定,每名實(shí)驗(yàn)員重復(fù)測定3次,取平均值作為該實(shí)驗(yàn)員的測定結(jié)果,計(jì)算3個(gè)測定結(jié)果的變異系數(shù),評價(jià)不同實(shí)驗(yàn)員測定結(jié)果的中間精密度。按照“1.2.1”的方法,在同一次試驗(yàn)內(nèi),使用不同代次的HEK293puroISRE-Luc細(xì)胞(分別為第5、20、35代)對供試品進(jìn)行3次測定,每個(gè)代次的細(xì)胞重復(fù)測定3次,取平均值作為該代次細(xì)胞的測定結(jié)果,計(jì)算3個(gè)測定結(jié)果的變異系數(shù),評價(jià)不同細(xì)胞代次測定結(jié)果的中間精密度[9-10]。

        1.3.5 報(bào)告基因法與細(xì)胞病變抑制法測定結(jié)果比較

        按照“1.2.1”及“1.2.2”的方法,分別測定供試品各10次,比較兩種方法測定結(jié)果有無差異。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用成組設(shè)計(jì)的兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn),以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 線性及測定范圍

        標(biāo)準(zhǔn)品及供試品的劑量反應(yīng)關(guān)系符合四參數(shù)方程:y=(A-D)/[1+(x/C)B]+D,相關(guān)系數(shù)均大于0.99,標(biāo)準(zhǔn)品及3個(gè)供試品四參數(shù)方程中B值非常接近,分別為1.01、0.95、1.03、1.07,說明標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的劑量反應(yīng)曲線具有較高的平行性。曲線上8個(gè)系列稀釋點(diǎn)的濃度范圍為0.15~2500 U/mL,曲線上直線段濃度范圍為3~150 U/mL。見圖1。

        2.2 專屬性

        使用報(bào)告基因法測定了聚乙二醇干擾素α2b標(biāo)準(zhǔn)品及供試品、測定培養(yǎng)液和Y型聚乙二醇,聚乙二醇干擾素α2b標(biāo)準(zhǔn)品及供試品出現(xiàn)了明顯的劑量反應(yīng)曲線,而測定培養(yǎng)液和Y型聚乙二醇各個(gè)稀釋度均沒有化學(xué)發(fā)光信號(hào),說明HEK293puroISRE-Luc細(xì)胞僅對聚乙二醇干擾素α2b中的干擾素部分具有反應(yīng)性。見圖1。endprint

        2.3 加標(biāo)回收率

        將標(biāo)準(zhǔn)品與供試品按不同的比例混合后測定其生物學(xué)活性,3批供試品的25%、50%和75%加標(biāo)回收率平均值均在85%~115%之間。見表1。

        2.4 精密度

        方法精密度進(jìn)行了重復(fù)性和中間精密度的驗(yàn)證,重復(fù)性以10次測定結(jié)果的變異系數(shù)表示;中間精密度考察了日期、實(shí)驗(yàn)員、細(xì)胞代次等變量對結(jié)果的影響,均以3次測定結(jié)果的變異系數(shù)表示。見表2。

        2.5 兩種方法測定結(jié)果的比較

        使用報(bào)告基因法及細(xì)胞病變抑制法分別測定3批供試品各10次,兩種方法的測定結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。見表3。

        3 討論

        報(bào)告基因法測定Ⅰ型干擾素活性原理是Ⅰ型干擾素與測活細(xì)胞細(xì)胞膜上的Ⅰ型干擾素受體結(jié)合后,通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),激活干擾素刺激反應(yīng)元件,啟動(dòng)熒光素酶的表達(dá),表達(dá)量與干擾素的生物學(xué)活性成正相關(guān),加入細(xì)胞裂解液和熒光素酶底物后,測定其發(fā)光強(qiáng)度,以此測定Ⅰ型干擾素生物學(xué)活性[11]。干擾素經(jīng)聚乙二醇修飾后,分子量顯著增大,構(gòu)象、空間位阻、靜電結(jié)合性質(zhì)、疏水性均發(fā)生改變,不可避免地影響其與受體的結(jié)合,從而影響生物學(xué)活性測定的結(jié)果[12],因此在使用報(bào)告基因法測定聚乙二醇化Ⅰ型干擾素生物學(xué)活性之前,必須進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證[13],驗(yàn)證的結(jié)果應(yīng)能證明該方法具有相當(dāng)?shù)臏?zhǔn)確性和可靠性,并應(yīng)以能夠有效控制產(chǎn)品質(zhì)量為基本標(biāo)準(zhǔn),一般需要驗(yàn)證線性、專屬性、準(zhǔn)確性、精密度等指標(biāo)。

        分析方法的線性是指在給定的范圍內(nèi)檢測結(jié)果與樣品中被分析物的濃度成比例關(guān)系的能力[14]。經(jīng)驗(yàn)證,該方法劑量反應(yīng)關(guān)系符合四參數(shù)方程[15],系列稀釋樣品的濃度范圍為0.15~2500 U/mL,對應(yīng)的發(fā)光強(qiáng)度范圍為300~6000,空白對照發(fā)光強(qiáng)度只有10左右,方法信噪比較高,相關(guān)系數(shù)較高,標(biāo)準(zhǔn)品與供試品曲線平行性較好[16]。

        專屬性是指可能存在某些組分(如雜質(zhì)、降解物、基質(zhì)等)時(shí),對被分析物準(zhǔn)確可靠測定的能力。由于聚乙二醇干擾素α2b注射液中可能含有殘留的Y型聚乙二醇,進(jìn)行專屬性驗(yàn)證時(shí),除了考察測定培養(yǎng)液外,還考察了Y型聚乙二醇是否會(huì)對測定結(jié)果產(chǎn)生干擾,試驗(yàn)結(jié)果表明HEK293puroISRE-Luc細(xì)胞對測定培養(yǎng)液及Y型聚乙二醇均沒有反應(yīng)性。

        評價(jià)方法的準(zhǔn)確性,可以使用回收率試驗(yàn)或者與成熟方法的測定結(jié)果進(jìn)行比較[17]。經(jīng)測定,三個(gè)供試品的25%、50%和75%加標(biāo)回收率均在85%~115%之間。細(xì)胞病變抑制法是測定干擾素生物學(xué)活性的經(jīng)典方法,也被用于聚乙二醇干擾素生物學(xué)活性測定[18],通過比較,報(bào)告基因法與細(xì)胞病變抑制法測定結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而且報(bào)告基因法的重復(fù)性明顯高于病毒抑制法。

        方法的精密度包括重復(fù)性、中間精密度等評價(jià)指標(biāo),與理化測定方法相比,生物學(xué)測定方法的變異均較大,一般情況下,細(xì)胞試驗(yàn)的變異系數(shù)應(yīng)不超過30%[19]。該方法3個(gè)供試品的重復(fù)性為6.66%~7.70%,評價(jià)中間精密度時(shí),選取了3個(gè)可能對試驗(yàn)結(jié)果影響較大的變量進(jìn)行考察:測定日期、實(shí)驗(yàn)員和測活細(xì)胞代次[20],它們的中間精密度分別為10.64%~11.01%、13.04%~15.12%和7.61%~8.54%,不同的實(shí)驗(yàn)員由于操作熟練程度不同,測定結(jié)果的變異度較大,使用不同代次的細(xì)胞進(jìn)行測定時(shí),變異度較小,說明HEK 293puroISRE-Luc細(xì)胞的穩(wěn)定性較高。

        與細(xì)胞病變抑制法相比,報(bào)告基因法用于測定聚乙二醇化Ⅰ型干擾素生物學(xué)活性,具有良好的專屬性、線性、準(zhǔn)確性、精密度,并且具有操作簡便、耗時(shí)短、不使用病毒、無需在生物安全實(shí)驗(yàn)室操作的特點(diǎn),且兩種方法的測定結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,本方法可以用于聚乙二醇化Ⅰ型干擾素產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

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        (收稿日期:2017-09-06 本文編輯:張瑜杰)endprint

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