翁騰玉+郭硯

[摘要] 目的 探討水母雪蓮黃酮對(duì)中波紫外線(xiàn)（UVB）輻射人永生化角質(zhì)細(xì)胞（HaCaT）損傷的影響。 方法 將體外培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞株隨機(jī)分為兩組，給予25 mJ/cm2和50 mJ/cm2劑量的UVB進(jìn)行照射，然后將細(xì)胞進(jìn)一步分為四組：對(duì)照組、UVB模型組、水母雪蓮黃酮2 g/L組、水母雪蓮黃酮8 g/L組。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，酶標(biāo)法檢測(cè)超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽（GSH）含量、細(xì)胞丙二醛（MDA）含量及過(guò)氧化氫酶（CAT）活性。 結(jié)果 在不同劑量紫外線(xiàn)輻射組中，與對(duì)照組比較，UVB模型組細(xì)胞吸光度降低，SOD活性、CAT活性及GSH含量明顯下降，MDA含量明顯上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。與UVB模型組比較，水母雪蓮黃酮組細(xì)胞吸光度增加，SOD活性、CAT活性及GSH含量明顯上升，MDA含量明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 水母雪蓮黃酮對(duì)UVB輻射后HaCaT細(xì)胞的氧化損傷有一定的保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 水母雪蓮；黃酮；紫外線(xiàn)；人永生化角質(zhì)細(xì)胞；氧化損傷；活性

[中圖分類(lèi)號(hào)] R758.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）01（a）-0014-04

[Abstract] Objective To investigate the effects of flavones derived from Saussurea medusa Maxim. for the HaCaT cells injury caused by UVB radiation. Methods The HaCaT cells line cultured in vitro was randomly divided into two groups， which were respectively given UVB irradiation at doses of 25 mJ/cm2 and 50 mJ/cm2. Then， the cells were further subdivided into four groups， including control group， UVB model group， 2 g/L of flavones derived from Saussurea medusa Maxim. group， and 8 g/L of flavones derived from Saussurea medusa Maxim. group. The cell proliferation was determined by MTT assay. The activities of superoxide dismutase （SOD）， contents of glutathione （GSH）， malondialdehyde （MDA） and activities of catalase （CAT） were detected by enzyme linked immunosorbent assay. Results In different doses of UVB radiation groups， compared with control group， the absorbance of UVB model group was decreased， the activities of SOD， CAT and the contents of GSH were reduced， while the contents of MDA were increased， the differences were all statistically significant （P < 0.05）. Compared with UVB model group， the absorbance of flavones derived from Saussurea medusa Maxim. group was increased， the activities of SOD， CAT and the contents of GSH were enhanced， while the contents of MDA were decreased， the differences were all statistically significant （P < 0.05）. Conclusion The flavones derived from Saussurea medusa Maxim. have certain protective effects for the oxidative damage of HaCaT cells after UVB radiation

[Key words] Saussurea medusa Maxim.； Flavones； UVB； HaCaT cells； Oxidative damage； Activity

青藏高原地區(qū)海拔高，氣候干燥，空氣稀薄，紫外線(xiàn)強(qiáng)，居民長(zhǎng)期處在該環(huán)境中，可導(dǎo)致皮膚老化加劇[1-2]。由于紫外線(xiàn)輻射是導(dǎo)致皮膚老化的最主要因素，所以皮膚老化又稱(chēng)為光老化（photoaging）[3-5]。日光中的中波紫外線(xiàn)（UVB，290～320 nm）[8]可增加表皮中角質(zhì)形成細(xì)胞（keratinocyte，KC）[6-7]的活性氧含量，生成自由基，導(dǎo)致皮膚氧化損傷[9]。因此，皮膚的光損傷主要是由UVB對(duì)KC的損傷造成的[10-11]。雪蓮是我國(guó)珍稀名貴中藏藥，多分布于高原寒帶，常被用作生藥的雪蓮有12種和1個(gè)變種[12]。藏醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)《四部醫(yī)典》《晶珠本草》中記載其有清熱解毒、補(bǔ)血養(yǎng)顏之功效。雪蓮含有多糖、黃酮等多種成分，能夠增加小白鼠組織內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽（GSH）含量，降低丙二醛（MDA）含量[13-16]。以槲皮素為代表的黃酮類(lèi)物質(zhì)的清除自由基的作用最強(qiáng)[17]。因此，水母雪蓮黃酮可作為清除活性氧自由基的重要手段，但其抗氧化的作用尚未闡明。本研究旨在探討水母雪蓮黃酮是否能減輕UVB輻射后人永生化角質(zhì)細(xì)胞（HaCaT）的氧化損傷。本研究將為高原地區(qū)UVB引起的皮膚損傷疾病治療提供理論依據(jù)。endprint

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水母雪蓮（青海眾康醫(yī)藥公司）；HaCaT細(xì)胞（上海弘順生物科技有限公司，批號(hào)：C0406）；DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)HyClone公司，批號(hào)：AC10207065）；胎牛血清（美國(guó)GIBCO公司，批號(hào)：1640958）；胰酶（中科邁晨科技有限公司，批號(hào)：G1608200）；MTT（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：771310260）；SOD試劑盒（批號(hào)：20170511）、GSH試劑盒（批號(hào)：20170429）、MDA試劑盒（批號(hào)：20170509）、過(guò)氧化氫酶（CAT）試劑盒（批號(hào)：20170611）均購(gòu)自南京建成生物研究所。

1.2 儀器

X-Mark型酶標(biāo)儀（BIO-RAD公司）；IX72型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；TL20W/12 UVB燈管（德國(guó)Philips公司）。

1.3 水母雪蓮黃酮的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[18]，100 g水母雪蓮中加入70%乙醇[液料比為13∶1（mL/g）]，提取2次，時(shí)間為50 min，提取溫度為60℃，將提取物凍干處理后得黃酮粗品。以10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基為溶劑，按實(shí)驗(yàn)要求分別配制成水母雪蓮黃酮低濃度（2 g/L）和水母雪蓮黃酮高濃度（8 g/L），0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌，需要時(shí)現(xiàn)配。

1.4 HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)與 UVB輻射

根據(jù)文獻(xiàn)[19-20]，HaCaT細(xì)胞在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基（10 U/mL青霉素和10 U/mL鏈霉素）生長(zhǎng)。UVB輻射前，細(xì)胞用PBS清洗后置于UVB輻射燈管下（25 mJ/cm2和50 mJ/cm2 UVB，1 h）。未經(jīng)輻射的細(xì)胞用同樣的方法處理后置于暗處作為對(duì)照組。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組

細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)，每孔按1×106個(gè)細(xì)胞接種于96孔板。用隨機(jī)數(shù)字表法將體外培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞隨機(jī)分為兩組，給予不同劑量的UVB輻射（25 mJ/cm2和50 mJ/cm2 UVB，1 h）。以上兩組進(jìn)一步分為對(duì)照組、UVB模型組、水母雪蓮黃酮2 g/L組、水母雪蓮黃酮8 g/L組。對(duì)照組細(xì)胞不給予水母雪蓮黃酮預(yù)處理，不給予UVB輻射處理；UVB模型組細(xì)胞不給予水母雪蓮黃酮預(yù)處理，將細(xì)胞用PBS清洗后置于UVB輻射燈管下（25 mJ/cm2和50 mJ/cm2）照射1 h；水母雪蓮黃酮組細(xì)胞在UVB照射前1 h分別給予2 g/L和8 g/L的黃酮處理，然后分別給予25 mJ/cm2和50 mJ/cm2的UVB照射1 h，培養(yǎng)基中培育18 h后收集細(xì)胞。

1.6 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖

細(xì)胞以1×106/mL細(xì)胞濃度鋪接種于96孔板，每孔加入MTT溶液20 μL。細(xì)胞在培養(yǎng)箱內(nèi)培育3 h后，在酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm波長(zhǎng)各孔的吸光度。

1.7 SOD、MDA、CAT、GSH的檢測(cè)

在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中培育18 h后，按照SOD、CAT、MDA、GSH檢測(cè)盒上的說(shuō)明分別測(cè)定SOD活性、MDA含量、CAT活性及GSH含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

在25 mJ/cm2和50 mJ/cm2輻射組中：UVB模型組細(xì)胞的吸光度低于對(duì)照組（P < 0.05）；水母雪蓮黃酮2 g/L和8 g/L組吸光度高于UVB模型組（P < 0.05），且水母雪蓮黃酮8 g/L組吸光度明顯高于水母雪蓮黃酮2 g/L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）（圖1）。

2.2 SOD、MDA、CAT、GSH的檢測(cè)

在25 mJ/cm2和50 mJ/cm2輻射組中：UVB模型組SOD活性、CAT活性及GSH含量較對(duì)照組明顯下降，MDA含量明顯上升（P < 0.05）；水母雪蓮黃酮2 g/L和8 g/L組中SOD活性、CAT活性及GSH含量較UVB模型組明顯上升，MDA含量明顯下降（P < 0.05），且水母雪蓮黃酮8 g/L組SOD活性、CAT活性及GSH含量明顯高于水母雪蓮黃酮2 g/L組，MDA含量明顯下降（P < 0.05）（圖 2）。

3 討論

青藏高原地區(qū)平均海拔高，日照長(zhǎng)，年平均濕度低、空氣稀薄，紫外線(xiàn)強(qiáng)。居民長(zhǎng)期處在高海拔、強(qiáng)紫外線(xiàn)和缺氧干燥的環(huán)境中，可導(dǎo)致皮膚提前老化及罹患相關(guān)疾病。皮膚老化分為自然老化和光老化，光老化是主要原因，它由紫外線(xiàn)波譜中的中波紫外線(xiàn)對(duì)皮膚的KC細(xì)胞進(jìn)行靶向損傷造成。機(jī)體在自然狀態(tài)下處于氧化和抗氧化體系的動(dòng)態(tài)平橫中，UVB可增加皮膚組織中的活性氧（ROS）[21]產(chǎn)生，導(dǎo)致自由基生成[22]，誘發(fā)氧化損傷，DNA斷裂，進(jìn)一步導(dǎo)致光老化及相關(guān)皮膚病。

雪蓮系菊科鳳毛菊屬的高山草本植物，主要分布在青藏高原高海拔地區(qū)。已有研究證實(shí)，雪蓮水提物能夠提高小鼠機(jī)體抗氧化酶體系（SOD、GSH）水平，同時(shí)降低MDA含量，表現(xiàn)出抗氧化損傷的能力。

水母雪蓮黃酮對(duì)UVB輻射HaCaT細(xì)胞損傷的影響研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本文旨在探討水母雪蓮黃酮對(duì)UVB輻射后HaCaT細(xì)胞的氧化損傷是否有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在不同劑量UVB輻射組中，UVB模型組吸光度低于對(duì)照組，水母雪蓮黃酮能夠改善細(xì)胞吸光度，水母雪蓮黃酮8 g/L組吸光度明顯高于水母雪蓮黃酮2 g/L組。說(shuō)明水母雪蓮黃酮能夠減輕UVB輻射后HaCaT細(xì)胞的損傷，效果呈劑量依賴(lài)性。其次，在不同劑量UVB輻射組中，與對(duì)照組比較，UVB輻射后各組細(xì)胞SOD、GSH、CAT活性及含量下降，MDA含量增加，但水母雪蓮黃酮能增加SOD、GSH、CAT活性及含量，同時(shí)降低MDA含量。說(shuō)明水母雪蓮黃酮對(duì)UVB介導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化損傷起保護(hù)作用。endprint

綜上所述，水母雪蓮黃酮能增加細(xì)胞吸光度并調(diào)節(jié)抗氧化酶水平，對(duì)UVB輻射后HaCaT細(xì)胞具有一定保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)在國(guó)內(nèi)外首次闡明了水母雪蓮黃酮減輕UVB輻射后HaCaT細(xì)胞氧化損傷，為高原地區(qū)珍貴中藏藥的開(kāi)發(fā)和利用提供理論基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2017-09-12 本文編輯：張秀平）endprint