胡安妮 張凌云

(北京林業(yè)大學(xué)，北京，100083)

VQ蛋白是一類轉(zhuǎn)錄輔助蛋白，含有一段保守的VQ基序FxxxVQxhTG，其中x代表任意一種氨基酸，h表示疏水性氨基酸[1]。VQ蛋白最初在擬南芥中被鑒定出來(SIB1，也稱為VQ23)[2-3]。之后，VQ在擬南芥、水稻、玉米、葡萄、毛白楊、毛竹等植物中陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)并鑒定。

研究發(fā)現(xiàn)，VQ蛋白不僅可以參與植物的生長發(fā)育和光形態(tài)建成過程，還響應(yīng)多種非生物脅迫[4-8]。如擬南芥AtVQ29能參與幼苗的去黃化過程，是光形態(tài)建成的一個調(diào)節(jié)因子[9]。擬南芥AtVQ21的異源表達導(dǎo)致高涼菜和矮牽牛植株矮化和開花延遲[10]。AtVQ10、AtVQ11、AtVQ23基因的表達受到高鹽、高滲透壓、低溫及高溫的誘導(dǎo)[11]。此外，VQ蛋白還能通過保守的V和Q殘基與WRKY互作，共同調(diào)控植物的生命活動[12]。在模式植物擬南芥中，AtVQ14通過與WRKY10互作調(diào)控種子大小和胚乳發(fā)育[5]。過表達AtVQ15提高了植株對鹽脅迫和滲透脅迫的敏感性[4]。AtVQ23和AtVQ16與WRKY33互作，增加其與W-box的結(jié)合能力來影響植株的抗病能力[12]。擬南芥AtVQ9蛋白通過與AtWRKY8轉(zhuǎn)錄因子互作，參與鹽脅迫的負(fù)調(diào)控[13]。在香蕉中，MaVQ5通過和MaWRKY26相互作用，使MaWRKY26激活茉莉酸合成基因的作用減弱，從而參與冷脅迫過程[14]。

青杄(PiceawilsoniiM.)又名華北云杉，屬于松科(Pinaceae)云杉屬(Picea)喬木，是中國特有的常綠針葉樹種，對惡劣的環(huán)境有較好的適應(yīng)能力。本文以植物所多年生青杄和6周大青杄幼苗為試驗材料，從其cDNA中克隆得到一個VQ基因，將其命名為PwVQ1。并對PwVQ1進行了生物信息學(xué)分析。對PwVQ1進行了序列對比、理化性質(zhì)和親/疏水性、無序化和蛋白二級/三級結(jié)構(gòu)等方面的分析。通過實時熒光定量實驗檢測PwVQ1在不同組織中及非生物脅迫處理下的表達模式，旨在為后期PwVQ1的功能研究提供理論參考，以期豐富VQ在青杄響應(yīng)逆境脅迫中的理論機制。

1 材料方法

1.1 材料與試劑

組織表達試驗中多年生青杄的花、果實、種子、根、莖、葉均取于中國科學(xué)院植物研究所。將青杄種子點播于培養(yǎng)皿中后于溫室中培養(yǎng)至6周大，以用于逆境脅迫試驗。溫室中的培養(yǎng)條件控制為16 h光照、8 h黑暗的光周期，溫度21 ℃，空氣濕度50%～60%。pEASY-T1載體購自全式金生物技術(shù)(北京)有限公司、大腸桿菌菌株DH5α感受態(tài)和熒光定量PCR試劑盒(SYBR Green Supereal Premix)購于天根生化科技(北京)有限公司，RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購于艾德萊(北京)生物技術(shù)有限公司。引物合成和測序由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司完成。

1.2 青杄PwVQ1基因引物序列

取正常生長的6周大青杄幼苗6株，通過EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒(艾德萊)提取青杄的RNA，并利用TRUE script 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(艾德萊)合成第1鏈cDNA，合成引物選用Oligo dT。反轉(zhuǎn)錄后的cDNA作為模板備用。

根據(jù)青杄轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選到一個青杄PwVQ轉(zhuǎn)錄本序列，命名為PwVQ1。并據(jù)此序列設(shè)計了一對克隆引物VQ1-F和VQ1-R(見表1)，以青杄cDNA為模板進行擴增，將PCR片段連到pEASY-T1載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過測序驗證。

1.3 生物信息學(xué)分析

通過DNAMAN軟件，分析PwVQ1的CDS區(qū)域，翻譯得到PwVQ1的氨基酸序列。在NCBI網(wǎng)站上用Protein Blast搜索其他物種中PwVQ1基因的同源序列，用軟件ClustalX生成aln文件，通過BOXSHADE(http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html)進行氨基酸多序列比對分析，并用ClustalX和MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。用ExPASy分析氨基酸的組成和理化性質(zhì)、等電點和分子質(zhì)量(http://web.Expasy.org/protaram/)。ProtScale分析蛋白疏水性(http://web.expasy.org/protoscale)。用SignalP工具做信號肽預(yù)測(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)。通過Iupred工具進行蛋白無序化特征預(yù)測(http://iupred.enzim.hu/)。并利用TMHMM對蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進行預(yù)測(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)，用GOR4(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_gor4.pl)對蛋白二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，SWISS(http://swissmodel.expasy.org)對蛋白三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測。

1.4 非生物脅迫試驗

選取長勢大小均一致的6周大青杄幼苗(選取整株幼苗)。參考周燕妮等[15]的方法對植株進行脅迫處理。低溫處理：將幼苗置于冰箱4 ℃保存0、3、6、12 h，高溫處理：將幼苗置于金屬浴42 ℃保存0、3、6、12 h。干旱處理：將青杄幼苗放在吸水紙上0、3、6、9、12 h。鹽處理：將青杄幼苗根浸入200 mmol·L-1的鹽溶液0、3、6、9、12 h。ABA處理：將青杄幼苗根浸入100 μmol·L-1的ABA溶液中0、3、6、12 h。對照組為沒有進行處理的植株，將所有處理完的植物材料和對照組植物材料用液氮速凍，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?，用于逆境響?yīng)分析，試驗重復(fù)3次。

1.5 組織特異性表達檢測

分別提取多年生青杄的花粉、果實、種子、根、莖、葉各樣品的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA第1條鏈，用于后期的表達量的檢測。提取RNA和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購于艾德萊公司，其中反轉(zhuǎn)錄過程中選用Oligo dT為引物。qRT-PCR反應(yīng)在ABI的Step One Plus Real Time RT-PCR儀器上進行，反應(yīng)體系為20 μL分別為0.5 μL正向引物和反向引物，10 μL 2×Fastfire qPCR PreMix，2 μL 50×ROX Reference Dye，1 μL模板和6 μL RNase-free ddH2O。試驗程序采用兩步法：95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s(40個循環(huán))。根據(jù)PwVQ1基因設(shè)計特異性引物VQ-RT-F和VQ-RT-R內(nèi)參基因為EF1-α-F和EF1-α-R(登錄號為AJ132534)[16]，試驗進行3次重復(fù)，引物見表1。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 青杄PwVQ1基因的克隆

提取青杄嫩苗的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板，PCR擴增目的序列，測序結(jié)果與編碼區(qū)比對，結(jié)果一致。PwVQ1(登錄號為MF624271)的開放閱讀框為819 bp，共編碼272個氨基酸。用NCBI網(wǎng)站上用BLAST工具分析結(jié)果表明，PwVQ1含有VQ結(jié)構(gòu)域FxxxVQxLTG，屬于VQ蛋白家族。

2.2 青杄PwVQ1蛋白氨基酸理化性質(zhì)

PwVQ1的理化分析結(jié)果顯示，PwVQ1的理論分子質(zhì)量為69.05 ku，PI值為5.03，蛋白分子質(zhì)量為C2408H3999N819O990S274，無負(fù)電殘基(Asp+Glu)和正電氨基酸殘基(Arg+Lys)。肽鏈含有19% Ala，33.5% Cys，26.7% Gly，20.8% Thr。該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為50.97，預(yù)測該蛋白不穩(wěn)定。PwVQ1不含有信號肽，不屬于分泌蛋白。ProtScale工具分析顯示，多肽鏈第49位纈氨酸(Val)有最高分值2.478，多肽鏈第191(Glu)和192(Glu)位谷氨酸有最低分值-3.111。PwVQ1的總平均親水性數(shù)值為-0.44，親水區(qū)域大于疏水區(qū)域，整條肽鏈表現(xiàn)出輕微的親水性(圖1-a)。TMHMM工具預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域顯示，整條肽鏈都在細胞膜外，該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)域。Iupred工具對蛋白無序化進行進行長無序性預(yù)測類型分析，結(jié)果如圖1-b所示，PwVQ1含有5個無序化區(qū)域，無序化區(qū)域含有119個氨基酸，無序化的比例為43.75%，預(yù)測此蛋白有較強的動態(tài)結(jié)構(gòu)，推測該蛋白在行使功能時構(gòu)象容易發(fā)生變化。

2.3 PwVQ1二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

用GOR4工具分析二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)(圖1-c)，PwVQ1中α-螺旋含量為23.90%，無β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量達到62.13%。用SWISS-MODEL預(yù)測得到的三級結(jié)構(gòu)(圖1-d)和二級結(jié)構(gòu)結(jié)果相似，有α螺旋，無β折疊。

圖1 PwVQ1理化性質(zhì)分析及蛋白結(jié)構(gòu)

2.4 PwVQ1多序列對比和系統(tǒng)進化樹

根據(jù)PwVQ1的氨基酸序列，在NCBI上通過在線數(shù)據(jù)庫BLAST其同源序列，共找到8個同源基因，分別是辣椒(CapsicumannuumCaVQ， XP_016575020.1)、番茄(Solanumlycopersicum， SlVQ， XP_019070125.1)、煙草(Nicotianatabacum， NtVQ， XP_018631968.1)、牽牛(Lpomoeanil， LnVQ， XP_019156681.1)、核桃(Juglansregia， JrVQ， XP_018817571.1)、花生(Arachisipaensis， AiVQ， XP_016201112.1)、油菜(Brassicanapus， BnVQ， CDY31674.1)、甜橙(Citrussinensis， CsVQ， XP_006466466.1)8種同源物種的VQ基因，用ClustalX和BOXSHADE進行序列對比(圖2)，發(fā)現(xiàn)不同物種的VQ都有一定的相似性，都具有一個保守結(jié)構(gòu)域FRxxVQxLTG。

為了進一步了解PwVQ1與其他物種的關(guān)系，將PwVQ1與模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)中已知的全部34個VQ基因進行比較，用MEGA5.0進行系統(tǒng)進化樹分析(圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PwVQ1蛋白與擬南芥AtVQ4、AtVQ13、AtVQ19、AtVQ33、AtVQ11、AtVQ31蛋白聚為一族。

2.5 PwVQ1組織特異性表達

實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，PwVQ1在不同組織中均有表達。根、莖、葉中的表達量明顯高于PwVQ1在花粉、種子、果實中的表達量。其中，在葉中的表達量最高，其次是根中的表達量(表2)。

2.6 PwVQ1在逆境脅迫下的表達模式

PwVQ1的表達量受到溫度、鹽脅迫、干旱脅迫、ABA的誘導(dǎo)。4 ℃冷脅迫下，PwVQ1的表達量在3 h時下調(diào)，在6 h時明顯上調(diào)，達到對照組的8倍左右，在12 h時表達量再次下調(diào)(表2)。42 ℃高溫脅迫下的表達模式則與4 ℃不同，和對照組相比，PwVQ1在處理3、6、12 h時的表達量都下調(diào)，其中，在處理3 h后的表達量下調(diào)10倍左右(表2)。鹽脅迫下，PwVQ1的表達量上調(diào)，6 h表達量達到最高，為4.73倍(表2)。干旱脅迫下，PwVQ1的表達量上調(diào)，3 h時的表達量達到最大值，為對照組的13倍左右(表2)。ABA處理下，PwVQ1的表達量呈現(xiàn)上升趨勢，6 h的表達量為對照組的3倍(表2)。

圖2 PwVQ1多序列對比

植物器官及處理PwVQ1平均Ct值EF-α內(nèi)參平均Ct值△Ct△△Ct2-△△Ct花粉34.04±0.4819.96±0.1914.08±0.300 1.00根26.02±0.0620.83±0.115.19±0.07-8.89±0.20474.41±0.09莖25.11±0.0219.32±0.055.79±0.03-8.29±0.10313.00±0.12葉28.90±0.0520.77±0.085.73±0.05-8.35±0.02326.29±0.05果實26.38±0.1519.72±0.086.67±0.14-7.41±0.08170.07±0.08種子30.23±0.0820.94±0.189.29±0.06-4.79±0.0927.67±0.104℃0h32.61±0.2722.76±0.179.86±0.2201.004℃3h35.84±0.4722.97±0.3512.87±0.773.01±0.100.13±0.104℃6h29.18±0.0222.36±0.196.82±0.11-3.04±0.058.20±0.03

續(xù)(表2)

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

圖3 PwVQ1的進化樹分析

3 結(jié)論與討論

VQ是一類特異蛋白，以多基因家族形式廣泛存在植物中[8]，在模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)VQ對植物生長發(fā)育、生物脅迫和非生物脅迫過程都起著十分重要的作用。目前，已經(jīng)分別在擬南芥、葡萄、水稻、玉米、白菜等植物中發(fā)現(xiàn)了34、18、39、61、57個VQ蛋白。但在青杄中，鮮有關(guān)于VQ的報道。

之前研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中有6種AtVQ(LTG，LTS，LTD，F(xiàn)TG，VTG，YTG)蛋白[17]，其中大部分蛋白結(jié)構(gòu)域都是LTG，本實驗的PwVQ1也屬于LTG這一類。組織表達分析發(fā)現(xiàn)，PwVQ1在各個組織中均有表達，但是在花、果實、種子中的表達量顯著低于在根、莖、葉中的表達量。于。PwVQ1在葉和根中的表達量分別是花粉中的494和473倍。據(jù)此推測，PwVQ1可能在植物的根和葉的生長發(fā)育過程中發(fā)揮特定作用。

對PwVQ1在非生物脅迫下的表達模式進行研究發(fā)現(xiàn)，PwVQ1對各種逆境均有響應(yīng)，在4 ℃低溫處理時，PwVQ1的表達量得到上調(diào)，這與Zhang et al.[18]等在白菜中的研究相似，大部分白菜BrVQ能受到冷脅迫的誘導(dǎo)，其中部分基因BrVQ的表達量能在冷脅迫下得到上調(diào)。辣椒CaVQ家族6個亞組中挑選的12個基因在低溫處理后，11個基因均表現(xiàn)出一定的調(diào)節(jié)作用[19]。但是在42 ℃高溫處理下，PwVQ1的表達量下調(diào)。這與白菜BrVQ9-2、BrVQ10-2、BrVQ10-3在高溫脅迫下的表達量下調(diào)的結(jié)論相似[18]。在玉米中，大多數(shù)的ZmVQ基因響應(yīng)NaCl脅迫，其中ZmVQ37能在NaCl處理24 h后顯著上調(diào)。擬南芥中，VQ10、VQ11、VQ23基因的表達明顯受高鹽脅迫誘導(dǎo)[11]。鹽處理下，毛白楊中的大部分VQ基因都得到上調(diào)，如PtVQ4，PtVQ6，PtVQ11，PtVQ37，PtVQ39，PtVQ45和PtVQ46[20]。在鹽脅迫下，PwVQ1的表達量也上調(diào)，可推測其參與鹽脅迫。在干旱處理下發(fā)現(xiàn)，PwVQ1能參與干旱脅迫，且表達量上調(diào)，這和水稻、葡萄、玉米、毛竹等植株中的研究相似，如水稻中有22個VQ基因在干旱脅迫下的表達上調(diào)，其中OsVQ2、OsVQ16、OsVQ20能明顯受到干旱誘導(dǎo)[21]。葡萄中的18個VvVQ基因均響應(yīng)干旱脅迫，其中VvVQ1和VvVQ6能明顯地響應(yīng)干旱脅迫，而VvVQ4對干旱脅迫的響應(yīng)則不明顯[22]。毛竹中的大部分VQ基因也能受到干旱、ABA的誘導(dǎo)[23]。長期干旱處理下的玉米轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明，玉米ZmVQ基因能響應(yīng)干旱脅迫[24]。

此外，PwVQ1還受到外源激素ABA的誘導(dǎo)。其他植物的VQ也能受到ABA的誘導(dǎo)，如實時定量PCR(qRT-PCR)和啟動子分析表明，毛竹中的29個VQ基因都能在脫落酸、水楊酸和聚乙二醇處理后不同程度地上調(diào)[24]。ABA(脫落酸)能誘導(dǎo)氣孔閉合，從而影響植物吸收水分。由于，PwVQ1能受到ABA的誘導(dǎo)，同時在干旱脅迫中響應(yīng)強烈，據(jù)此推測PwVQ1可能是通過ABA的某種信號途徑來參與干旱脅迫，但是具體的作用機理仍需要進一步研究探索。

綜上所述，基于對PwVQ1的研究，我們推測PwVQ1可能參與逆境響應(yīng)，但是其參與逆境的具體機制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)目前仍不明確，后續(xù)工作需要篩選出其互作蛋白以及將該基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，進一步來驗證其抗逆機制及在植物生長發(fā)育過程中的作用。

[1] PECHER P, ESCHEN-LIPPOLD L, HERKLOTZ S, et al. The Arabidopsis thaliana mitogen-activated protein kinases MPK3 and MPK6 target a subclass of ‘VQ-motif’-containing proteins to regulate immune responses[J]. New Phytologist,2014,203(2):592-606.

[2] MORIKAWA K, SHIINA T, MURAKAMI S, et al. Novel nuclear-encoded proteins interacting with a plastid sigma factor, Sig1, in Arabidopsis thaliana 1[J]. FEBS Letters,2002,514(2/3):300-304.

[3] ANDREASSON E, JENKINST, BRODERSEN P, et al. The MAP kinase substrate MKS1 is a regulator of plant defense responses[J]. The EMBO Journal,2005,24(14):2579-2589.

[4] PERRUC E, CHARPENTEAU M, RAMIREZ B C, et al. A novel calmodulin-binding protein functions as a negative regulator of osmotic stress tolerance in arabidopsis thaliana seedlings[J]. The Plant Journal,2004,38(3):410-420.

[5] WANG A, GARCIA D, ZHANG H, et al. The VQ motif protein IKU1 regulates endosperm growth and seed size in Arabidopsis[J]. The Plant Journal,2010,63(4):670-679.

[6] XIE Y D, LI W, GUO D, et al. The Arabidopsis gene SIGMA FACTOR-BINDING PROTEIN 1 plays a role in the salicylate-and jasmonate-mediated defence responses[J]. Plant, Cell & Environment,2010,33(5):828-839.

[7] 林淵源,余迪求.擬南芥VQ基因家族響應(yīng)抗性相關(guān)激素表達譜分析[J].植物分類與資源學(xué)報，2012,34(5):509-518.

[8] 張高原,張一卉,李景娟,等.植物VQ蛋白研究進展[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報,2016,25(1):142-149.

[9] 劉清,唐蛟,曾娟，等.擬南芥AtVQ29基因的克隆與植物表達載體構(gòu)建[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展,2014,14(35):6814-6817.

[10] LI Y, JING Y, LI J, et al. Arabidopsis VQ MOTIF-CONTAINING PROTEIN29 Represses Seedling Deetiolation by Interacting with PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR1[J]. Plant Physiology,2014,164(4):2068-2080.

[11] 韓笑,王后平,潘金晶，等.擬南芥WRKY8轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因VQ10和VQ11受多種非生物逆境脅迫誘導(dǎo)表達[J].植物分類與資源學(xué)報,2015,37(6):760-766.

[12] LAI Z, LI Y, WANG F, et al. Arabidopsis sigma factor binding proteins are activators of the WRKY33 transcription factor in plant defense[J]. The Plant Cell,2011,23(10):3824-3841.

[13] CHENG Y, ZHOU Y, YANG Y, et al. Structural and functional analysis of VQ motif-containing proteins in Arabidopsis as interacting proteins of WRKY transcription factors[J]. Plant Physiology,2012,159(2):810-825.

[14] HU Y, CHEN L, WANG H, et al. Arabidopsis transcription factor WRKY8 functions antagonistically with its interacting partner VQ9 to modulate salinity stress tolerance[J]. The Plant Journal,2013,74(5):730-745.

[15] 周燕妮,李艷芳,張通,等.青杄PwUSP2基因的克隆和表達分析[J].植物生理學(xué)報,2015,51(8):1307-1314.

[16] YU Y, LI Y, HUANG G, et al. PwHAP5, a CCAAT-binding transcription factor, interacts with PwFKBP12 and plays a role in pollen tube growth orientation in Picea wilsonii[J]. Journal of Experimental Botany,2011,62(14):4805-4817.

[17] YE Y J, XIAO Y Y, HAN Y C, et al. Banana fruit VQ motif-containing protein5 represses cold-responsive transcription factor MaWRKY26 involved in the regulation of JA biosynthetic genes[J]. Scientific Reports,2016,6(8):591-598.

[18] ZHANG G, WANG F, LI J, et al. Genome-wide identification and analysis of the VQ motif-containing protein family in Chinese cabbage (BrassicarapaL. ssp.Pekinensis)[J]. International Journal of Molecular Sciences,2015,16(12):28683-28704.

[19] 張亞利,謝玲玲,歐陽嫻,等.辣椒VQ基因家族的鑒定與低溫脅迫下的表達分析[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2016,36(7):11-19.

[20] CHU W, LIU B, WANG Y, et al. Genome-wide analysis of poplar VQ gene family and expression profiling under PEG, NaCl, and SA treatments[J]. Tree Genetics & Genomes,2016,6(12):1-17.

[21] KIM D Y, KWON S I, CHOI C, et al. Expression analysis of rice VQ genes in response to biotic and abiotic stresses[J]. Gene,2013,529(2):208-214.

[22] WANG M, VANNOZZI A, WANG G, et al. A comprehensive survey of the grapevine VQ gene family and its transcriptional correlation with WRKY proteins[J]. Frontiers in Plant Science,2015,6(5):417-426.

[23] WANG Y, LIU H, ZHU D, et al. Genome-wide analysis of VQ motif-containing proteins in Moso bamboo (Phyllostachysedulis)[J]. Planta,2017，246(1):165-181.

[24] SONG W, ZHAO H, ZHANG X, et al. Genome-wide identification of VQ motif-containing proteins and their expression profiles under abiotic stresses in Maize[J]. Frontiers in Plant Science,2015,6(4):273-281.