胡秀彩，呂愛軍，孫敬鋒，石洪玥，YEONG Yiksung，裴超，張超，李莉

(1.天津農(nóng)學院水產(chǎn)學院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津300384；2.河南師范大學水產(chǎn)學院，河南新鄉(xiāng)453007)

斑馬魚Danio rerio個體較小，性成熟期短，繁殖力強，胚胎透明且體外發(fā)育，易于活體觀察，便于研究其遺傳發(fā)育、生理病理和疾病免疫功能[1]。目前，斑馬魚已成為研究人類、動物和魚類疾病的一種水生模式動物[1-2]。

魚類腸道微生物是影響其生長發(fā)育等生命活動的重要因素之一。研究表明，魚類腸道正常菌群在營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收、免疫反應和器官發(fā)育等方面具有重要作用，且影響魚類的生長、發(fā)育、生理和病理[3-4]。目前，國內(nèi)外對腸道微生物的研究主要集中在畜禽動物，而對魚類腸道菌群組成的研究報道尚少[3-5]。對于魚類腸道微生物群落結構的分析鑒定需要建立快速、準確的研究技術，其中單鏈構象多態(tài)性分析 (SSCP)是一種基于DNA構象差別來檢測點突變的方法[6]。而PCR-SSCP方法被廣泛用于未知基因突變的檢測，近年來在腸道微生物多樣性的分析上也有應用[7-11]。為此，本試驗中通過對斑馬魚腸道細菌進行分離純化、16S rDNA基因克隆和V3區(qū)的PCR-SSCP等系統(tǒng)研究，揭示斑馬魚腸道細菌種類，旨在為探討魚類腸道菌群結構對其生命活動的影響提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用斑馬魚購自江蘇省徐州市某花鳥市場。

LB固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、4%NaCl嗜鹽菌培養(yǎng)基由天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室配制。

TCBS瓊脂、SS瓊脂、伊紅美藍EMB選擇培養(yǎng)基購自杭州微生物試劑公司。UNIQ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒購自上海生工生物工程公司，dNTP、Taq DNA聚合酶、10×PCR反應試劑、PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒購自上海捷瑞生物工程公司，pMD 18-T載體購自大連寶生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 斑馬魚腸道細菌的分離與培養(yǎng)特性 參照胡秀彩等[5]的方法，在無菌條件下分別將菌落接種到 LB平板、4%NaCl營養(yǎng)瓊脂、TCBS瓊脂、SS瓊脂、EMB選擇培養(yǎng)基上，于29℃下倒置培養(yǎng)24 h。分別挑取菌落形態(tài)特征不同的單個菌落接種到LB平板上，無菌條件下挑取單菌落多次劃線進行分離純化。獲得純化細菌菌株于4℃下保存(試管斜面)。觀察細菌在普通瓊脂培養(yǎng)基與選擇培養(yǎng)基上的生長情況，并記錄菌體培養(yǎng)特性。

1.2.2 細菌基因組DNA提取及16S rDNA基因PCR擴增 根據(jù)斑馬魚腸道菌株在不同平板上的菌落形態(tài)、顏色、大小等，選取12株細菌進行16S rDNA序列測定，采用UNIQ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖電泳后，將12株細菌的總DNA于-20℃下保存?zhèn)溆?。采用大腸桿菌通用引物對16S rDNA進行擴增，正向引物序列為 5′AGAGTTTGATCATGGCTCAG 3′， 反向引物序列為 5′TACGGTTACCTTGTTACGACTT 3′。 PCR反應體系 (共 15 μL)： 模板1.0 μL， 正、 反向引物各 0.5 μL， Taq PCR Master Mix 7.5 μL， 加 ddH2O 5.5 μL。 反應條件： 94 ℃下預變性4 min；94℃下變性30 s，55℃下退火30 s，72℃下延伸1 min，共進行30個循環(huán)；最后在72℃下再延伸10 min，于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

將PCR產(chǎn)物連接pMD-18T載體，并轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆，經(jīng)pMD-18T載體 M13的正向引物序列 5′ACTCCTACGGGAGGCAGCAG 3′、 反向引物序列 5′ATTACCGCGGCTGCTGG 3′進行PCR擴增，驗證陽性克隆由上海生工生物工程有限公司測序。采用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，EB染色檢測，用紫外線分析儀拍照觀察。

1.2.3 16S rDNA序列及系統(tǒng)發(fā)育學分析 將測序獲得的16S rDNA序列，利用NCBI進行BLAST序列比對 (http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，基于16S rDNA序列分析，所獲得序列與數(shù)據(jù)庫中的參考序列應用CLUSTALX 1.8軟件進行匹配比對，然后采用MEGA 4.1軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 16S rDNA基因V3序列的PCR-SSCP分析

以細菌總DNA為模板，用正向引物序列5′CAGTCACGACGTTGTAA 3′、 反 向 引 物 序 列5′CAGGAAACAGCTATGAC 3′擴增16S rDNA 序列。PCR反應體系 (共15 μL)：正、反向引物各0.5 μL， Buffer 1.5 μL， Mg2+0.6 μL， dNTP 0.2 μL，Taq 酶 0.1 μL， 模板 1.5 μL， 加 ddH2O 至 15 μL。反應條件：94℃下預變性4 min；94℃下變性30 s，51℃下退火30 s，72℃下延伸1 min，共進行30個循環(huán)；最后在72℃下再延伸10 min，于4℃下保存?zhèn)溆?。PCR擴增產(chǎn)物采用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。

SSCP分析依照文獻[5-6]進行，簡述如下：取6 μL的PCR產(chǎn)物和4 μL變性緩沖液混勻，98℃下變性10 min后立即冰浴10 min，于10%PAGE中電泳，4℃、180 V條件下電泳2.5 h(Bio-Rad)；電泳后先用蒸餾水洗1～2次，再用0.1%AgNO3染色15 min，最后利用2.0%NaOH(0.2%甲醛)顯色，直至條帶清晰為止，拍照進行SSCP帶型分析。

2 結果與分析

2.1 斑馬魚腸道細菌形態(tài)及培養(yǎng)特征

從斑馬魚腸道中分離純化出12株細菌，分別命名為 Zf1、 Zf2、 Zf3、 Zf4、 Zf5、 Zf6、 Zf7、 Zf8、Zf9、Zf10、Zf11和 Zf12，在 LB培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后12株分離細菌均為中小型菌落，多為透明或乳白色菌落。其中，菌株 Zf5、Zf6、Zf7、Zf8、Zf9在4%NaCl平板上生長緩慢，菌落形態(tài)小而圓、多為乳白色，其余7個菌株生長不良；菌株Zf1、Zf2、 Zf3、 Zf4分別在 TCBS、 TCBS、 EMB、 SS選擇培養(yǎng)基上生長較快，并呈現(xiàn)出不同的顏色；菌株Zf10、Zf11和Zf12在LB培養(yǎng)基上生長較快，呈現(xiàn)為乳白色的圓形菌落 (表1)。

2.2 腸道菌株l6S rDNA基因克隆及分子鑒定

斑馬魚腸道細菌基因組總DNA電泳檢測顯示，12株細菌基因組DNA均大于2000 bp，可用作PCR擴增16S rDNA的模板 (圖1)。

以所提取的細菌總DNA為模板進行16S rDNA PCR擴增，PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，表明擴增出Zf1～Zf12菌株的16S rDNA基因片段，大小約為1500 bp(圖2)，用PCR檢測pMD18-T/16S rDNA陽性克隆并進行測序。對斑馬魚腸道細菌測序獲得的7個菌株的16S rDNA序列，利用NCBI進行BLAST序列相似性檢索，結果見表2。同時結合腸道細菌形態(tài)學和培養(yǎng)特征，確定菌株Zf1與Zf11屬于氣單胞菌屬Aeromonas，與菌株Aeromonas veronii為同一種細菌；Zf4與Zf8屬于鞘氨醇單胞菌屬 Sphingomonas，與菌株 Sphingomonas sp.為同一種菌；Zf5屬于芽孢桿菌屬Bacillus，與菌株Bacillus subtilis為同一種菌；Zf7屬于氣單胞菌屬Aeromonas，與菌株Aeromonas sp.M10為同一種菌；而Zf10與非培養(yǎng)菌株uncultured bacterium clone GI3-M-5-G01為同一種菌，可能是一種新的菌種。

表1 細菌的形態(tài)和培養(yǎng)特征Tab.1 Morphological and culture characteristics of all strains

圖1 菌株Zf1-Zf12基因組總DNAFig.1 Total DNA of genome from strains Zf1 to strain Zf12 in the intestine of zebrafish

圖2 菌落PCR檢測pMD18-T/16S rDNA陽性克隆Fig.2 Positive clones of pMD18-T/16S rDNA in the strains by PCR

表2 16S rDNA序列測序結果分析Tab.2 Sequencing of the 16S rDNA from different isolates

通過構建16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示，以Zf1、Zf11為代表的菌株與已知種的細菌Aeromonas veronii聚為一支，親緣關系最近，歸在同一類群，且一致性達99%；而菌株Zf5則與Bacillus subtilis聚為一支，一致性達99%；而以Zf4、Zf8為代表的菌株則與Sphingomonas sp.未知細菌聚為一支，歸在同一類群，一致性達99%；Zf7與Aeromonas sp.未知細菌聚為一支，一致性達99%；另外一個代表菌株Zf10則與尚未獲得純培養(yǎng)的菌株聚為一支，一致性達92%。以腸道大腸埃希氏菌Escherichia cdi作為參考菌株，與各菌株分支較遠，可知分離的菌種與大腸埃希氏菌親緣關系較遠(圖3)。

圖3 以斑馬魚腸道細菌16S rDNA基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree analysis of different bacterial isolates from the intestine of zebrafish based on 16S rDNA gene sequence

2.3 16S rDNA基因V3區(qū)的PCR-SSCP分析

對12株分離菌16S rDNA V3區(qū)基因的PCRSSCP圖譜顯示，斑馬魚腸道細菌Zf1～Zf12的16S rDNA V3區(qū)基因存在多態(tài)性：Zf1與Zf11帶型一致；Zf4與Zf8帶型一致；而Zf5、Zf7、Zf10帶型各不相同，與前兩種帶型也有所不同 (圖4)。進一步對其中7株腸道細菌16S rDNA V3區(qū)基因序列進行比對 (圖5)，結果顯示，Zf1、Zf11序列完全相同，表明為同一種菌；Zf4、Zf8序列基本相同，為同一種菌。Zf5、Zf7、Zf10序列互不相同，且與Zf1、Zf11以及Zf4、Zf8均有較大差別，初步鑒定為不同菌種，此結果與16S rDNA-SSCP圖譜一致。

圖4 16S rDNA V3區(qū)基因的PCR-SSCP圖譜Fig.4 PCR-SSCP results of the V3 region gene of l6S rDNA of the bacteria from the intestine of zebrafish

圖5 16S rDNA基因V3區(qū)基因序列比對Fig.5 Homological analysis of 16S rDNA V3 region sequences

3 討論

3.1 魚類腸道細菌的多樣性研究

近年來，對動物腸道微生物的研究主要集中于哺乳類動物[12-14]，而對模式生物斑馬魚腸道菌群進行分離鑒定的研究則鮮有文獻報道[1，3]。國內(nèi)對魚類腸道菌群組成的研究起步相對較晚。迄今，相關學者對大彈涂魚[15]、青石斑魚[16]腸道菌群進行鑒定分析，并發(fā)現(xiàn)了腸道優(yōu)勢菌群與細菌種屬，認為這些優(yōu)勢菌群可能是參與消化生理活動的主要菌群。樊海平等[17]研究發(fā)現(xiàn)，日本鰻鱺腸道中細菌數(shù)量與棲息水體、生理狀態(tài)、餌料狀況等有關。趙慶新[18]以草魚、鯉等鯉科Cyprinidate魚類為研究對象，分析了其腸道細菌的菌群結構，結果表明，魚類腸道中主要有致病桿菌屬Xenorhabdus、氣單胞菌屬Aeromonas、檸檬酸桿菌屬Citrobacter、假單胞桿菌屬Pseudomonas等。本研究中，采用PCRSSCP的分子技術鑒定方法研究了斑馬魚腸道細菌多樣性，16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示，以Zf1、Zf11為代表的菌株與已知種細菌Aeromonas veronii，Zf5與 Bacillus subtilis， Zf4、 Zf8與 Sphingomonas sp.，Zf7與Aeromonas sp.分別聚為一支，且16S rDNA序列一致性高達99%；同時從斑馬魚腸道中分離獲得Zf10菌株與uncultured bacterium clone一致性為92%，表明有可能為一種新分離菌株。斑馬魚腸道細菌16S rDNA分子鑒定表明，Zf1、Zf7和Zf11屬于氣單胞菌屬Aeromonas，Zf4、Zf8屬于鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas，Zf5屬于芽孢桿菌屬Bacillus。此外，斑馬魚腸道細菌Zf2、Zf3、Zf6、Zf9和Zf12等分離株構建的陽性克隆，測序尚未成功，這可能與魚類腸道細菌多樣性、菌株生物學特性和試驗技術條件因素有關。已有研究報道，利用宏基因組技術可進行微生物多樣性結構和功能基因組研究[7]。本試驗中通過對斑馬魚腸道細菌16S rDNA的基因克隆測序分析，發(fā)現(xiàn)Zf10與尚未獲得純培養(yǎng)的菌株uncultured bacterium GI3-M-5-G01聚為一支，一致性為92%，推測菌株Zf10可能是一種新分離菌種，有待進一步研究鑒定，以豐富斑馬魚腸道微生物物種資源。

3.2 魚類腸道細菌PCR-SSCP分析

有研究表明，16S rDNA序列分析在細菌鑒定方面具有不可替代的作用，結合SSCP技術可以提高檢測的特異性[9-10]。細菌16S rDNA既有保守區(qū)，也有相對變異區(qū)，因此，可以采用PCR-SSCP技術進行鑒定分析[8]。王永等[9]對于4種食源性致病菌16S rDNA的可變區(qū)進行SSCP分析，結果表明，4種致病菌16S rDNA單鏈構象多態(tài)性具有種屬特異性。本試驗結果表明，斑馬魚腸道分離菌種的SSCP圖譜無論從條帶的數(shù)目、相對遷移率及條帶之間的間距看，相互間均存在明顯差異，其中Zf1與Zf11帶型一致，Zf4與 Zf8帶型一致，而Zf5、Zf7、Zf10帶型各不相同，與前兩種帶型也有所不同。通過構建16S rDNA系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，其SSCP圖譜差異似與親緣關系成正比，即親緣關系越遠，差異越明顯。此外，16S rDNA基因V3區(qū)片段大小約為200 bp，利用SSCP分析V3區(qū)基因片段分辨率較高，得到的圖譜也較清晰；盡管如此，利用SSCP技術進行分析時也有其缺陷，比如，當分離片段較大 (＞400 bp)時，會出現(xiàn)分辨率低、共遷移等現(xiàn)象[9，19]。此外，有學者利用PCR-DGGE、PCR-RFLP技術進行腸道微生物、病原菌分析鑒定研究[19-20]。本研究中，斑馬魚腸道細菌16S rDNA基因V3區(qū)的PCR-SSCP結果與16S rDNA基因序列比對結果一致，值得進一步研究。

綜上所述，本研究中從斑馬魚腸道分離純化出的12株細菌，其中氣單胞菌屬Aeromonas等優(yōu)勢菌株與其他學者研究報道結果一致[15，18]，這為今后進行斑馬魚腸道菌群及其微生態(tài)功能研究提供了科學依據(jù)，也為PCR-SSCP技術應用于斑馬魚腸道細菌多樣性分析提供了參考。

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