周賀，莊子昕，查荒源，梁雨婷，徐其征，張蕊，林忠喬，李雅娟

(大連海洋大學(xué)遼寧省省級(jí)高校海洋生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023)

泥鰍Misgurnus anguillicaudatus和大鱗副泥鰍Paramisgurnus dabryanus分別隸屬于鰍科Cobitidae、花鰍亞科Cobitinae的泥鰍屬M(fèi)isgurnus和副泥鰍屬Paramisgurnus[1]，是廣泛分布于中國(guó)各地的兩種小型淡水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)。泥鰍具有多倍體現(xiàn)象，據(jù)報(bào)道，除普通二倍體 (2n＝50)外，還存在天然三倍體(3n＝75)、天然四倍體 (4n＝100)和天然六倍體(6n＝150) 等[2-5]。 賈光風(fēng)等[6]、 李雅娟等[7-9]通過(guò)對(duì)中國(guó)長(zhǎng)江流域特有的天然四倍體泥鰍的起源及形成機(jī)制進(jìn)行研究，證實(shí)了天然四倍體泥鰍是含有四套染色體組的遺傳四倍體 (4n＝100)，且雌雄均能產(chǎn)生正常的2n配子。二倍體和四倍體雜交，理論上可獲得100%的三倍體，而三倍體預(yù)期不育的魚(yú)類(lèi)具有生長(zhǎng)快、抗病力強(qiáng)等特點(diǎn)，在生產(chǎn)上具有一定的應(yīng)用價(jià)值[10]。雜交三倍體魚(yú)類(lèi)將雜交育種和三倍體育種相結(jié)合，是實(shí)現(xiàn)魚(yú)類(lèi)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的一條切實(shí)可行的途徑。因此，2011年筆者利用天然四倍體泥鰍與大鱗副泥鰍雜交獲得了雜交三倍體，并對(duì)雜交后代進(jìn)行了基因組原位雜交 (Genomic in situ hybridization，GISH)分析，為雜交后代是三倍體的結(jié)論提供了分子細(xì)胞學(xué)證據(jù)[6]，但關(guān)于天然四倍體泥鰍與大鱗副泥鰍雜交后代的遺傳構(gòu)成目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究中，以大鱗副泥鰍與天然四倍體泥鰍雜交子代及親本為研究對(duì)象，對(duì)GISH試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立了雜交三倍體泥鰍GISH技術(shù)反應(yīng)體系，并進(jìn)行GISH分析，旨在為雜交后代的鑒定提供最直觀的證據(jù)，也為大規(guī)模生產(chǎn)三倍體泥鰍提供有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用天然四倍體泥鰍采自湖北省武漢市，大鱗副泥鰍購(gòu)自大連市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，均在實(shí)驗(yàn)室水箱中培育，培育溫度為 (25±1)℃。

1.2 方法

1.2.1 人工催產(chǎn)及授精 選取性腺發(fā)育良好的經(jīng)倍性鑒定后的天然四倍體泥鰍雌、雄各3尾，大鱗副泥鰍雌、雄各3尾，試驗(yàn)開(kāi)始后，于當(dāng)日20：00注射絨毛膜促性腺激素 (HCG)，雌魚(yú)注射HCG劑量為20～25 IU/g，雄魚(yú)減半。次日8：00，按照雜交組合 (天然四倍體泥鰍♀×大鱗副泥鰍♂，大鱗副泥鰍♀×天然四倍體泥鰍♂)人工采集精液、卵子，干法授精，并將受精卵置于溫度為 (25±1)℃的曝氣水中培養(yǎng)，每隔1 h挑出死卵，并更換曝氣水。

1.2.2 染色體標(biāo)本制備 受精卵孵化約20 h發(fā)育至眼泡期后期，用0.025 g/L的秋水仙素浸泡1～1.5 h(30個(gè)胚胎/小瓶)后，用8 g/L的檸檬酸鈉溶液 (約5 mL) 低滲20 min，溫度為 (25±1)℃。用-20℃預(yù)冷的卡諾固定液 (甲醇與冰醋酸的體積比為3∶1，現(xiàn)配現(xiàn)用)處理3次。最后將樣品置于卡諾固定液 (-20℃)中保存?zhèn)溆?。采用冷滴片法制備單個(gè)胚胎染色體。參照Levan等[11]方法進(jìn)行核型分析。

1.2.3 親本DNA提取及濃度和質(zhì)量檢測(cè) 采用傳統(tǒng)的酚仿抽提法提取親本基因組DNA，并利用Eppendorf D30核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其濃度和質(zhì)量。

1.2.4 探針DNA和封阻DNA片段化 以大鱗副泥鰍DNA為探針DNA，天然四倍體泥鰍DNA為封阻DNA。具體方法如下：將大鱗副泥鰍和天然四倍體泥鰍DNA分裝于6支離心管中，每管5 μL。將盛有大鱗副泥鰍DNA的3支離心管置于高壓蒸汽滅菌鍋中，設(shè)置梯度試驗(yàn)溫度分別為100、105、110℃，持續(xù)時(shí)間依次設(shè)為1、2、3 min(片段化DNA持續(xù)的時(shí)間不包括前期升溫及后期降溫的時(shí)間)。將盛有天然四倍體泥鰍DNA的3支離心管置于高壓蒸汽滅菌鍋中，設(shè)置試驗(yàn)溫度分別為110、115、120℃，持續(xù)時(shí)間依次設(shè)定為5、10、15 min(片段化DNA持續(xù)的時(shí)間不包括前期升溫和后期降溫的時(shí)間)。隨后用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，分析不同溫度及持續(xù)時(shí)間條件下DNA片段長(zhǎng)度。

1.2.5 探針DNA與封阻DNA濃度比例 (probe/blocking DNA radio，P/B)的優(yōu)化 P/B比設(shè)為1 ∶10、 1∶20、 1∶25、 1∶50。

1.2.6 GISH分析

1.2.6.1 探針DNA標(biāo)記 對(duì)經(jīng)檢測(cè)合格的大鱗副泥鰍DNA采用優(yōu)化后處理溫度為105℃、處理時(shí)間為2 min進(jìn)行探針DNA片段化。利用缺口平移試劑盒 (Roche 11745824910)在15℃低溫水浴鍋中進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記時(shí)間為120 min。標(biāo)記后放入烘箱 (65℃)中，處理時(shí)間20 min，使酶失活。

1.2.6.2 封阻DNA的片段化 采用優(yōu)化后處理溫度為110℃、處理時(shí)間為10 min，對(duì)檢測(cè)合格的天然四倍體泥鰍全基因組DNA進(jìn)行封阻DNA片段化。

1.2.6.3 基因組原位雜交

(1)雜交液制備。將標(biāo)記后的探針DNA與片段化后的封阻DNA按照篩選出的最佳混合比，即1∶25進(jìn)行混合，加入體積分?jǐn)?shù)為100%酒精60 μL和3 mol/L醋酸銨3 μL沉淀后于-30℃下靜置30 min，以15 000 r/min離心30 min，去掉上清液；加入150 μL體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精再次以15 000 r/rim離心3 min，去掉上清液；室溫下晾干后加入50 μL雜交緩沖液 (50%硫酸葡聚糖 10 μL+20×SSC 1.83 μL+100%去離子甲酰胺 27.5 μL+ddH2O 10.67 μL)。

(2)探針DNA變性。于83℃下處理7 min，迅速移到冰水中10 min以上 (變性過(guò)程中的溫度與時(shí)間控制需要精確)。

(3)染色體標(biāo)本變性。取出老化完成的染色體標(biāo)本，放入提前65℃下預(yù)熱的變性液 (pH為7.0的70%甲酰胺/2×SSC)中3 min，迅速移入-20℃預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精中7 min，再依次移入體積分?jǐn)?shù)為90%的酒精中7 min、體積分?jǐn)?shù)為100%的酒精中10 min。

(4)雜交。室溫下晾干染色體標(biāo)本，將50 μL雜交液全部滴加在事先標(biāo)記好的染色體區(qū)域，覆蓋20 mm×20 mm的封口膜，放入2×SSC濕盒，于37℃培養(yǎng)箱中孵育18 h以上。

1.2.6.4 漂洗、對(duì)比染色與觀察 具體步驟如下：

(1)洗脫。揭掉封口膜，染色體標(biāo)本放入50%甲酰胺/2×SSC溶液中，42℃下手動(dòng)漂洗20 min，再放入1×SSC溶液中42℃下手動(dòng)漂洗7 min，重復(fù)3次，于2×SSC溶液中室溫下靜置20 s。

(2)滴加100 μL染色封阻液 (0.05 g BSA+1 mL 20×SSC+10 μL Tween20)， 蓋上封口膜， 放在2×SSC濕盒中，于37℃下恒溫避光孵育30 min。

(3)FITC熒光信號(hào)檢出。去除封口膜，加入100 μL Avidin-FITC 液 (PBS+1%BSA 與 Alexa-Fluor488的體積比為200∶4)，蓋上封口膜，于37℃下避光溫育80 min。

(4)漂洗。揭掉封口膜，放在4×SSC/0.1%Tween20溶液中42℃下避光漂洗5 min，重復(fù)3次，再于4×SSC溶液中避光漂洗10 min。

(5)信號(hào)放大。滴加 100 μL信號(hào)增幅液(PBS+1%BSA與Biotinylated Anti-avidin D的體積比為125∶0.5)，蓋上新的封口膜，放在2×SSC濕盒中，于37℃下避光溫育45 min。

(6)漂洗。步驟同本節(jié)中 (4)。

(7)加入100 μL Avidin-FITC液，于37℃下避光培養(yǎng)1 h。

(8)漂洗。步驟同本節(jié)中 (4)。

(9)對(duì)比染色。依次將染色體標(biāo)本放入盛有體積分?jǐn)?shù)為70%、90%、100%酒精的染色缸中常溫脫水各 5 min， 再加入 50 μL 2.5 μg/mL的 DAPI/antifade溶液，用指甲油封片。水平放置于冰箱(-4℃)中避光保存。次日在熒光顯微鏡 (Leica DM2000)下觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA電泳

提取的親本DNA的OD260nm/OD280nm值為1.8～2.0，符合試驗(yàn)要求。如圖1所示，擴(kuò)增出的條帶清晰、完整。

圖1 基因組DNA瓊脂糖電泳結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis of genomic DNA

2.2 GISH體系的建立

2.2.1 探針DNA的片段化 本研究中以大鱗副泥鰍為探針，片段化結(jié)果如圖2所示。105℃高壓滅菌2 min時(shí)，探針DNA片段顯示亮度較高的彌散狀條帶，長(zhǎng)度為500～1000 bp，保證了其可以在染色體DNA中穿梭，使之定位在同源序列處并與之雜交 (圖2-A)；而110℃高壓滅菌3 min時(shí)，探針DNA片段長(zhǎng)度位于500 bp以下，片段長(zhǎng)度太短易導(dǎo)致特異性弱且信號(hào)不強(qiáng) (圖2-B)。

2.2.2 封阻DNA的片段化 本研究中以天然四倍體泥鰍為封阻DNA，片段化結(jié)果如圖3所示，120℃高壓滅菌5 min處理的封阻DNA片段長(zhǎng)度僅在100 bp左右 (圖3-A)；110℃高壓滅菌10 min處理的封阻DNA片段為100～500 bp時(shí)顯示亮度較高的彌散狀條帶，符合要求 (圖3-B)；120℃高壓滅菌15 min處理的DNA片段長(zhǎng)度在100 bp以下，片段長(zhǎng)度均太短，不符合要求 (圖3-C)。

圖2 探針DNA片段化電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Electrophoresis of probe DNA fragmentation

圖3 封阻DNA片段化電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Electrophoresis of blocking DNA fragmentation

2.2.3 探針DNA與封阻DNA濃度比例 (P/B)

從圖4可見(jiàn)：當(dāng) P/B值為1∶10(圖4-A)和1∶20(圖4-B)時(shí)，雜交信號(hào)不清晰；當(dāng)P/B值為1∶25(圖4-C) 和1∶50(圖4-D) 時(shí)， 均可以得到較好的雜交信號(hào)，但P/B值為1∶25時(shí)效果最好。

2.3 天然四倍體泥鰍與大鱗副泥鰍正、反雜交子代的GISH分析

利用已建立的GISH技術(shù)反應(yīng)體系對(duì)天然四倍體泥鰍與大鱗副泥鰍的正、反雜交子代進(jìn)行GISH分析，結(jié)果如圖5所示。天然四倍體泥鰍♀×大鱗副泥鰍♂的雜交子代，存在有雜交信號(hào)的染色體24條，來(lái)源于親本大鱗副泥鰍，且雜交信號(hào)均位于著絲點(diǎn)處，而無(wú)雜交信號(hào)染色體50條，來(lái)源于親本天然四倍體泥鰍 (圖5-A、B)；大鱗副泥鰍♀×天然四倍體泥鰍♂雜交子代也存在有雜交信號(hào)的染色體24條，來(lái)源于親本大鱗副泥鰍，且雜交信號(hào)均位于著絲點(diǎn)處，而無(wú)雜交信號(hào)染色體也為50條，來(lái)源于親本天然四倍體泥鰍 (圖5-C、D)。

圖4 大鱗副泥鰍♀×天然四倍體泥鰍♂后代P/B試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 GISH of chromosomes in embryos from loach Paramisgurnus dabryanus♀×natural tetraploid loach♂

3 討論

3.1 影響基因組原位雜交的因素

基因組原位雜交 (GISH)是以基因組DNA為探針與染色體標(biāo)本進(jìn)行的原位雜交，是用于檢測(cè)目標(biāo)DNA的一種技術(shù)，也是研究雜交物種染色體構(gòu)成及進(jìn)化的有效方法[12]。GISH試驗(yàn)有許多影響因素，但探針DNA和封阻DNA的制備及使用濃度是決定GISH成功與否的關(guān)鍵因素。GISH中無(wú)論是探針還是封阻均須通過(guò)染色體的立體結(jié)構(gòu)完成雜交，探針DNA過(guò)長(zhǎng)則會(huì)影響探針在雜交過(guò)程中無(wú)法正常移動(dòng)到染色體需要雜交的位置上，導(dǎo)致雜交信號(hào)缺少或不清晰等問(wèn)題；探針DNA長(zhǎng)度過(guò)短，則會(huì)導(dǎo)致雜交信號(hào)無(wú)代表性，雜交信號(hào)過(guò)多且不清晰。因此，優(yōu)化探針長(zhǎng)度，是研究基因組原位雜交的一項(xiàng)必要技術(shù)，完善和發(fā)展該技術(shù)可顯著提升GISH技術(shù)的成功率和分辨率。

圖5 雜交三倍體泥鰍GISH分析Fig.5 GISH of chromosomes in embryos from hybrid triploid loach

本試驗(yàn)中利用高溫解旋原理，使基因組DNA片段化，結(jié)果顯示，基因組DNA在105℃、持續(xù)時(shí)間2 min時(shí)，片段化后探針DNA片段長(zhǎng)度為500～1000 bp，封阻DNA在溫度為110℃、持續(xù)時(shí)間10 min時(shí)，片段長(zhǎng)度為100～500 bp，說(shuō)明用高壓滅菌鍋對(duì)基因組DNA進(jìn)行片段化的方法可行。加入封阻DNA后主要有兩方面的作用：首先，由于同源序列雜交，阻止探針DNA與非特異性位點(diǎn)雜交或非目標(biāo)DNA雜交，封閉假陽(yáng)性信號(hào)；其次，封阻DNA可阻止探針DNA與相似DNA雜交，區(qū)分目標(biāo)DNA和非目標(biāo)DNA[13]。探針DNA與封阻DNA濃度比例 (P/B)對(duì)雜交結(jié)果的清晰度及雜交程度均有決定性影響，是決定整個(gè)雜交效果的另一個(gè)關(guān)鍵因素。當(dāng)封阻DNA過(guò)量時(shí)，封阻DNA與目標(biāo)DNA雜交，只有少量的目標(biāo)DNA與探針DNA雜交會(huì)產(chǎn)生雜交信號(hào)。Rampin等[14]曾經(jīng)對(duì)Squalius alburnoides的染色體進(jìn)行GISH分析，使用的P/B值為1∶20至1∶40，但其使用的探針DNA量只有100 ng，由于探針DNA的使用量過(guò)低，不得不減小雜交面積以得到較為清晰的雜交信號(hào)。本研究中，探針DNA與封阻DNA濃度比 (P/B)結(jié)果顯示，當(dāng)P/B＝1∶25或1∶50時(shí)均可以獲得明亮的雜交信號(hào)，P/B值過(guò)高或過(guò)低均使雜交信號(hào)不明顯。另外，本試驗(yàn)中建立的GISH技術(shù)體系有兩個(gè)局限性：其一，所有的特異性雜交信號(hào)均位于染色體著絲點(diǎn)處 (除一條染色體端部額外又有一簇雜交信號(hào)外)，說(shuō)明只有染色體著絲點(diǎn)處的序列與探針DNA產(chǎn)生了特異性反應(yīng)，無(wú)法捕捉到染色體體臂間的交換及染色體變異等，其原因還不清楚；其二，建立的GISH技術(shù)體系現(xiàn)只用于泥鰍不同屬間雜種，對(duì)于親緣關(guān)系更近的種間雜種，該體系試驗(yàn)結(jié)果不能有效分開(kāi)親本染色體組，其原因主要是兩種泥鰍親緣關(guān)系太近。

3.2 基因組原位雜交在水產(chǎn)動(dòng)物雜交育種上的應(yīng)用

雜交育種技術(shù)是新品種開(kāi)發(fā)和品種選育的有效途徑和方法。在雜交育種過(guò)程中，雜交后代的真實(shí)性鑒定是必要的，因?yàn)橹挥兄离s交后代是否真正含有親本血緣，才能確定雜交利用的效果和雜交方法可行性。GISH技術(shù)可以從分子水平上對(duì)染色體直接進(jìn)行原位定位，明確了解雜種的核基因組組成，GISH技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于雜種外緣染色體的檢測(cè)[15-16]，且在水產(chǎn)動(dòng)物的研究中也有應(yīng)用。畢克[17]運(yùn)用GISH技術(shù)對(duì)華貴櫛孔扇貝♀×櫛孔扇貝♂雜交子代的染色體組成進(jìn)行了分析；呂振明[18]對(duì)櫛孔扇貝和蝦夷扇貝雜交后代的染色體來(lái)源進(jìn)行了GISH技術(shù)鑒定；Rita對(duì)櫛水虱Asellus aquaticus進(jìn)行了性染色體的GISH分析，并且捕捉到了來(lái)自Y染色體的變異[19]。綜上所述，GISH技術(shù)在水產(chǎn)物種后代遺傳學(xué)分析中同樣具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。本研究中，以大鱗副泥鰍DNA為探針，自然四倍體泥鰍DNA為封阻，對(duì)大鱗副泥鰍與天然四倍體泥鰍正、反雜交所得的雜交三倍體泥鰍進(jìn)行了原位雜交，在染色體中期可清楚地檢測(cè)到24條染色體具有熒光信號(hào)，來(lái)源于大鱗副泥鰍；另外50條染色體無(wú)雜交信號(hào)，來(lái)源于四倍體泥鰍。原位雜交結(jié)果清晰顯示，后代分別繼承了父、母本的染色體，為真正的雜交三倍體。因此，本試驗(yàn)表明，泥鰍屬間雜種后代的鑒定可用GISH的方法加以有效檢測(cè)。

本研究結(jié)果證明了大鱗副泥鰍與四倍體泥鰍屬間雜交的真實(shí)性，該研究結(jié)果不僅為雜交三倍體泥鰍后代的鑒定提供了最直觀的證據(jù)，也為中國(guó)天然四倍體泥鰍是含有四套染色體組的遺傳四倍體并能產(chǎn)生2n的配子提供了分子細(xì)胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。因此，本試驗(yàn)結(jié)果對(duì)泥鰍三倍體育種研究具有一定的指導(dǎo)意義。

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