陳 蓉， 應(yīng)詩家， 陳 哲， 于建寧， 施振旦

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，江蘇 南京 210014)

抗繆勒氏管激素(Anti-Mullerian hormone，AMH)，又稱繆勒氏管抑制物質(zhì)(Mullerian-inhibiting substance，MIS)，是轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factorβ，TGFβ)超家族成員[1]，在性腺組織中表達。最初，人們對AMH的理解僅限于其在性別分化中的作用——抑制雄性胚胎繆勒氏管的發(fā)育[2]。直到1999年，Durlinger等通過AMH基因敲除小鼠研究發(fā)現(xiàn)AMH具有抑制原始卵泡募集和降低生長卵泡對促卵泡激素(Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)敏感性的作用[3-4]。體外研究結(jié)果已表明，AMH抑制生長卵泡對FSH敏感性是通過調(diào)控FSH受體(FSH receptor，F(xiàn)SHR)信號通路實現(xiàn)的[5-6]。與其他TGFβ超家族成員一樣，AMH通過與細(xì)胞膜上的2個絲氨酸/蘇氨酸激酶受體(Ⅰ和Ⅱ型)相結(jié)合，激活胞漿內(nèi)Smad分子從而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄[7]。其中，Ⅱ型受體(AMH receptor 2，AMHR2)是AMH特異性的[8]，Ⅰ型受體則與TGFβ超家族另一個成員骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic proteins，BMPs)共享[9]。與哺乳動物相比，AMH基因在禽類卵泡發(fā)育中的功能研究起步較晚，目前主要集中在家雞中。2008年，Johnson等[10]首次檢測了產(chǎn)蛋雞卵巢不同等級卵泡的顆粒細(xì)胞中AMH基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)AMH基因的信使核糖核酸(Messenger ribonucleic acid，mRNA)表達量隨著卵泡的發(fā)育逐漸降低，并且AMH主要由小卵泡的顆粒細(xì)胞表達，與哺乳動物的表達模式相一致，表明AMH基因在禽類中具有保守的生物學(xué)功能。目前，國內(nèi)外尚無AMH基因在水禽卵泡發(fā)育中的功能研究。本研究擬以連城白鴨為研究對象，通過定量PCR技術(shù)檢測卵巢不同等級卵泡中AMH基因及其相關(guān)調(diào)控基因的表達情況，為水禽卵泡發(fā)育的分子機制研究積累基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

選擇同批出雛同條件飼養(yǎng)的200日齡連城白鴨雌性個體8只，分別采集卵巢組織中的等級卵泡F5(最小的等級卵泡)、小黃卵泡(Small yellow follicle，SYF)和大白卵泡(Large white follicle，LWF)，經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃保存。其中，等級卵泡F5去除卵黃蛋白。

1.2 總RNA提取與cDNA第一鏈的合成

采用動物組織總RNA提取試劑盒[DP431，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品]提取總RNA，NanoDrop 2000分光光度計檢測RNA的純度(OD260/OD280≥1.8；OD260/OD230≥1.0)和濃度。采用PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒[RR036A，日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司產(chǎn)品]以總RNA為模板合成互補脫氧核糖核酸(Complementary deoxyribonucleic acid，cDNA)第一鏈。

1.3 mRNA定量PCR分析

根據(jù)GenBank中綠頭鴨或者近緣物種相關(guān)mRNA序列設(shè)計基因特異性引物，引物信息見表1，其中SF1(Steroidogenic factor 1，類固醇生成因子1)、WT1(Wilms tumor 1，Wilms腫瘤基因1)、GATA4(GATA-binding protein 4，GATA結(jié)合蛋白4)基因引物序列引自參考文獻[11]。以β-肌動蛋白(β-actin)為內(nèi)參基因，按照TransStart Top GreenSuperMix試劑盒(AQ131-04，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)的說明書配制反應(yīng)體系并在ABI 7500 Real-Time PCR儀上進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)，每個樣品重復(fù)3次。

表1定量PCR引物信息表

Table1PrimersinformationforquantitativePCR

基因名稱 序列(5'→3')產(chǎn)物長度(bp)退火溫度(℃)AMHF:CTCGGATGACAAATGCTTCA11160R:ACTCCATCAGCGGAGAGGTASOX9F:GCTGAATGAGAGCGAGAAGC11960R:CGTTCTTCACCGACTTCCTCSF1F:GCTCAGTACCTTTGGCCTCA12260R:GCAGCAGCTTCATCTGGTCTGATA4F:TTTCTGCTAACGGGAGGGAGCAAT10260R:AAGTCCAAGTGGTGGCCATTTCAGWT1F:TCTGAAGACTCATACCAGGACTCA13660R:CATGTTCCTCTGGTGCATGTAMHR2F:CTGATGGAGCACGAGAACG9060R:GTAGAGCTGCAGGACCAGGAFSHRF:CCTAGCCATTGCTGTGCATTT10660R:TGCCAGGTTGCTCATCAAGGCYP19A1F:AGAAGCGACAACAGCTTTCC12660R:TCTCCAGCACACACTGGTTCβ-actinF:GAGAAATTGTGCGTGACATCA15260R:CCTGAACCTCTCATTGCCA

1.4 總蛋白提取

將卵泡組織置于適量的組織細(xì)胞裂解液(WB-0061，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)中，勻漿，冰上靜置至充分裂解，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，保留上清液，BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白的濃度(BCA01，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司)。取適量的上清液與蛋白上樣緩沖液混勻，煮沸5 min，冷卻至室溫。

1.5 蛋白質(zhì)印跡檢測

總蛋白質(zhì)經(jīng)濃度為12%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)分離后，電轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride，PVDF)膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入鼠抗人AMH單克隆抗體(稀釋比例為1∶100，sc-166752，Santa Cruz公司產(chǎn)品)，4 ℃孵育過夜。洗膜緩沖液(Tris-buffered saline with 0.05% Tween 20，TBST)洗滌后，加入過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(稀釋比例為1∶2 000，CW0103S，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司產(chǎn)品)，室溫孵育1 h。TBST洗滌后，加入EasySee? Western Blot Kit發(fā)光液(DW101-02，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)，置于ImageQuant LAS 4000化學(xué)發(fā)光成像儀中曝光，拍照。同時，使用兔抗人β-actin單克隆抗體(稀釋比例為1∶1 000，Cat No. 4970，Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品)進行內(nèi)參蛋白的檢測。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用2-△△Ct法進行mRNA定量PCR試驗數(shù)據(jù)處理，目的基因的相對表達量采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。采用Image J軟件對蛋白質(zhì)印跡條帶進行灰度值分析，目的蛋白的相對表達水平采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。采用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析，均值比較采用單因素方差分析法，兩兩比較采用LSD法。

2 結(jié)果與分析

2.1 AMH基因在鴨不同等級卵泡中的表達量

本研究分別通過定量PCR和蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測了AMH基因在鴨不同等級卵泡中的表達情況。在mRNA水平上，AMH基因在大白卵泡中的表達量顯著高于等級卵泡F5，在小黃卵泡中的表達量也顯著高于等級卵泡F5(圖1A)。在蛋白質(zhì)水平上，AMH蛋白在大白卵泡中的表達量顯著高于小黃卵泡和等級卵泡F5，但是在小黃卵泡中的表達量與等級卵泡F5無顯著差異(圖1B)。此外，AMH基因在蛋白質(zhì)水平上的差異程度要低于mRNA水平。這些結(jié)果表明，隨著卵泡的發(fā)育，AMH基因的表達量逐漸降低。

A：AMH基因的mRNA表達量；B：AMH蛋白的表達量。F5：等級卵泡F5；SYF：小黃卵泡；LWF：大白卵泡。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖1 鴨不同等級卵泡中AMH基因的表達量Fig.1 Expression of AMH gene in various-sized follicles of duck

2.2 AMH基因啟動子區(qū)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在鴨不同等級卵泡中的表達量

本研究通過定量PCR技術(shù)分別檢測了SOX9(Sex determining region Y-box 9，SRY相關(guān)基因9)、SF1、GATA4和WT1這4種轉(zhuǎn)錄因子在鴨卵巢不同等級卵泡中的表達量。在mRNA水平上，SOX9基因在不同等級卵泡中的表達量無顯著差異(圖2A);SF1和GATA4基因在大白卵泡和小黃卵泡中的表達量顯著高于等級卵泡F5(圖2B和圖2C)；WT1基因在大白卵泡和小黃卵泡中的表達量也顯著高于等級卵泡F5(圖2D)。這些結(jié)果表明，隨著卵泡的發(fā)育，SF1、GATA4和WT1基因的表達量逐漸降低。

A～D：分別為SOX9、SF1、GATA4和WT1基因的mRNA表達量。F5：等級卵泡F5；SYF：小黃卵泡；LWF：大白卵泡。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2 鴨不同等級卵泡中轉(zhuǎn)錄因子SOX9、SF1、GATA4和WT1的表達量Fig.2 Expression of SOX9, SF1, GATA4 and WT1 in various-sized follicles of duck

2.3 AMHR2和AMH相關(guān)調(diào)控基因在鴨不同等級卵泡中的表達量

本研究通過定量PCR技術(shù)分別檢測了AMHR2、FSHR、CYP19A1和BMP6這4種基因在鴨卵巢不同等級卵泡中的表達量。在mRNA水平上，AMHR2基因在小黃卵泡的表達量顯著高于等級卵泡F5(圖3A)；FSHR基因在不同等級卵泡中的表達量無顯著差異(圖3B)；CYP19A1基因在小黃卵泡和等級卵泡F5中的表達量顯著高于大白卵泡(圖3C)；BMP6基因在大白卵泡和小黃卵泡中的表達量顯著高于等級卵泡F5(圖3D)。這些結(jié)果表明，隨著卵泡的發(fā)育，CYP19A1基因的表達量逐漸升高，AMHR2和BMP6基因的表達量逐漸降低。

3 討 論

鑒于AMH基因在哺乳動物和雞卵泡發(fā)育中的重要作用，本研究通過定量PCR技術(shù)檢測了鴨卵巢不同等級卵泡中AMH基因的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)AMH基因的mRNA表達量隨著卵泡的發(fā)育逐漸降低，這與Johnson等在產(chǎn)蛋雞中的研究結(jié)果相一致[10]，表明AMH基因在禽類中具有保守的生物學(xué)功能。鑒于哺乳動物AMH抗體可用于檢測禽類AMH蛋白表達[12]，本研究還從蛋白質(zhì)水平上驗證了AMH基因在卵泡發(fā)育中的表達規(guī)律。在哺乳動物中，AMH基因的起始轉(zhuǎn)錄需要轉(zhuǎn)錄因子SOX9的參與，而轉(zhuǎn)錄因子SF1、WT1和GATA4能夠協(xié)同SOX9增強AMH基因的表達[13]。但是，Oreal等[14]在雞胚中發(fā)現(xiàn)AMH基因的起始轉(zhuǎn)錄不需要轉(zhuǎn)錄因子SOX9的參與，表明AMH基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控機制在禽類與哺乳動物之間是非保守的。本研究通過定量PCR技術(shù)分別檢測了這4種轉(zhuǎn)錄因子在鴨卵巢不同等級卵泡中的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了SOX9基因外，SF1、WT1和GATA4基因的mRNA表達量隨著卵泡的發(fā)育逐漸降低，與AMH基因的表達趨勢相一致，表明這3種轉(zhuǎn)錄因子可能在AMH轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用。其中，Takada等[15]在雞胚中已經(jīng)證實SF1能夠結(jié)合到AMH基因啟動子區(qū)并激活其轉(zhuǎn)錄。因此，下一步我們需要證實WT1和GATA4是否能夠結(jié)合到禽類AMH基因啟動子區(qū)并激活其轉(zhuǎn)錄。

A～D：分別為AMHR2、FSHR、CYP19A1和BMP6基因的mRNA表達量。F5：等級卵泡F5；SYF：小黃卵泡；LWF：大白卵泡。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3 鴨不同等級卵泡中AMHR2、FSHR、CYP19A1和BMP6基因的表達量Fig.3 Expression of AMHR2, FSHR, CYP19A1 and BMP6 genes in various-sized follicles of duck

在哺乳動物中的研究結(jié)果表明，AMH抑制生長卵泡對FSH敏感性是通過調(diào)控FSHR信號通路實現(xiàn)的。因此，本研究通過定量PCR技術(shù)分別檢測了AMHR2、FSHR和CYP19A1基因的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AMHR2基因的mRNA表達量在等級卵泡中顯著降低，與AMH基因的表達趨勢相似，推測AMH在卵泡發(fā)育中的重要作用是由其受體AMHR2介導(dǎo)的。盡管FSHR基因的表達量在不同等級卵泡間無顯著差異，但是CYP19A1基因的表達量隨著卵泡的發(fā)育逐漸升高，與AMH基因的表達趨勢相反，推測AMH基因具有抑制FSHR信號通路的功能，而且這種作用是通過影響FSHR信號通路的下游因子來調(diào)控類固醇激素的合成實現(xiàn)的。在雞中，Ocón-grove等[11]發(fā)現(xiàn)BMP6和AMH基因在卵泡發(fā)育中具有相似的表達模式，并且BMP6能以劑量依賴關(guān)系促進雞等級前卵泡顆粒細(xì)胞中AMH基因的表達，表明AMH基因的表達受到卵巢局部生長因子的調(diào)控。在本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)BMP6和AMH基因在鴨不同等級卵泡中的表達趨勢一致，但是BMP6是否能夠促進AMH基因的表達需要進一步的試驗驗證。

綜上所述，AMH基因在鴨卵泡發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，其在等級前卵泡中的高表達量可能有助于維持顆粒細(xì)胞未分化的狀態(tài)，且可能是通過抑制FSHR信號通路來實現(xiàn)的。

[1] CATE R L, MATTALIANO R J, HESSION C, et al. Isolation of the bovine and human genes for Mullerian inhibiting substance and expression of the human gene in animal cells [J]. Cell, 1986, 45(5): 685-698.

[2] JOST A, VIGIER B,PREPIN J, et al. Studies on sex differentiation in mammals [J]. Recent Prog Horm Res, 1973, 29: 1-41.

[3] DURLINGER A L, KRAMER P, KARELS B, et al. Control of primordial follicle recruitment by anti-Mullerian hormone in the mouse ovary[J]. Endocrinology, 1999, 140(12): 5789-5796.

[4] DURLINGER A L, GRUIJTERS M J, KRAMER P, et al. Anti-Mullerian hormone attenuates the effects of FSH on follicle development in the mouse ovary [J]. Endocrinology, 2001, 142(11): 4891-4899.

[5] PELLATT L, RICE S, DILAVER N, et al. Anti-Mullerian hormone reduces follicle sensitivity to follicle-stimulating hormone in human granulosa cells [J]. Fertil Steril, 2011, 96(5): 1246-1251.

[6] CHANG H M, KLAUSEN C, LEUNG P C, et al. Antimullerian hormone inhibits follicle-stimulating hormone-induced adenylyl cyclase activation, aromatase expression, and estradiol production in human granulosa-lutein cells [J]. Fertil Steril, 2013, 100(2): 585-592.

[7] JOSSO N, CLEMENTE N. Transduction pathway of anti-Mullerian hormone, a sex-specific member of the TGF-beta family [J]. Trends Endocrinol Metab, 2003, 14(2): 91-97.

[8] BAARENDS W M, VAN HELMOND M J, POST M, et al. A novel member of the transmembrane serine/threonine kinase receptor family is specifically expressed in the gonads and in mesenchymal cells adjacent to the mullerian duct [J]. Development, 1994, 120(1): 189-197.

[9] VISSER J A. AMH signaling: from receptor to target gene [J]. Mol Cell Endocrinol, 2003, 211(1/2): 65-73.

[10] JOHNSON P A, KENT T R, URICK M E, et al. Expression and regulation of anti-mullerian hormone in an oviparous species, the hen [J]. Biol Reprod, 2008, 78(1): 13-19.

[12] JOHNSON P A. Follicle selection in the avian ovary [J]. Reprod Domest Anim, 2012, 47(S4): 283-287.

[13] LASALA C, CARRé-EUSBE D, PICARD J Y, et al. Subcellular and molecular mechanisms regulating anti-Mullerian hormone gene expression in mammalian and nonmammalian species [J]. DNA Cell Biol, 2004, 23(9): 572-585.

[14] OREAL E, PIEAU C, MATTEI M G, et al. Early expression of AMH in chicken embryonic gonads precedes testicularSOX9 expression [J]. Dev Dyn, 1998, 212(4): 522-532.

[15] TAKADA S, WADA T, KANEDA R, et al. Evidence for activation ofAmhgene expression by steroidogenic factor 1 [J]. Mech Dev, 2006, 123(6): 472-480.