劉建平，何建峰

邯鄲市中醫(yī)院，河北 邯鄲 056001

肺缺血再灌注損傷是臨床上開展肺移植、體外循環(huán)心臟手術(shù)以及機(jī)體大出血時常發(fā)生的并發(fā)癥，病理機(jī)制非常復(fù)雜，其中再灌注后肺水腫的出現(xiàn)、氧自由基的大量生成與過剩而誘發(fā)的氧化應(yīng)激損傷以及繼發(fā)性肺細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是造成肺缺血再灌注損傷的關(guān)鍵因素［1-2］。黃芪甲苷為我國傳統(tǒng)中藥黃芪的主要有效成分之一，具有抗炎、降血脂等多種藥理學(xué)活性［3-4］。近年來，李鐵成等［5］和馬小亮等［6］通過動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷能夠通過改善抗氧化酶活性、提高自由基清除能力、抑制細(xì)胞凋亡而表現(xiàn)出對肝組織缺血在灌注損傷大鼠和心肌缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用，但黃芪甲苷是否對肺缺血再灌注損傷大鼠具有保護(hù)作用尚未見文獻(xiàn)報道。本實驗通過夾閉左肺門45分鐘后松夾的方法制備肺缺血再灌注損傷大鼠模型，研究黃芪甲苷對大鼠肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 黃芪甲苷(成都錦泰和醫(yī)藥化學(xué)技術(shù)有限公司，批號：150114，純度≥98%)；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)、髓過氧化物酶(MPO)、丙二醛(MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；HE、TUNEL試劑盒購于北京博奧森生物工程有限公司。

1.2 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠7周齡，體質(zhì)量220～260 g，由河北省實驗動物中心提供［動物實驗許可證號：SCXK(冀)2013-1-003，動物實驗合格證號：201410012］。

1.3 動物分組與模型制備 取50只實驗用大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和黃芪甲苷低、中、高劑量組(20、40、80 mg/kg)組，每組 10 只；黃芪甲苷各治療組分別于術(shù)前30分鐘由腹腔注射給藥，假手術(shù)組和模型組分別給予等體積的生理鹽水。除假手術(shù)組外，其余各組大鼠均參照Xia ZY等［7］報道的方法制備肺缺血再灌注損傷大鼠模型：經(jīng)腹腔注射烏拉坦實施麻醉后，行氣管插管，連接動物呼吸機(jī)(設(shè)置頻率為50次/min，呼吸比例為1∶1，潮氣量為10 mL/kg)，于左胸第4肋和第5肋間開胸，游離左肺門后，用無創(chuàng)血管夾閉左肺門，45分鐘后松夾以恢復(fù)血流，整個過程輔助機(jī)械通氣；假手術(shù)組行手術(shù)通路，除不夾閉左肺門外，其余操作同手術(shù)組。再灌注2小時后，實施麻醉后開腹經(jīng)輔助動脈取血，1 500 rpm離心10分鐘取上層血清；開胸取左肺下葉組織，進(jìn)行各指標(biāo)的檢測。

1.4 肺組織W/D的測定 肺組織經(jīng)生理鹽水沖

洗干凈并用濾紙吸干后，稱重為濕重(W)；置于60℃烘干箱 24小時后稱重為干重(D)，平行計算各組大鼠兩者之比為肺組織W/D。

1.5 肺組織中抗氧化酶活性的檢測 肺組織用冷生理鹽水沖洗干凈后，加入適量冷裂解液行研磨勻漿，按照各試劑盒操作方法步驟，通過紫外-可見分光光度計平行測定各組大鼠肺組織中抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性。

1.6 血清中M PO活性、M D A含量的檢測 然后按照試劑盒操作步驟，通過紫外-可見分光光度計平行測定各組大鼠血清中MPO活性、MDA含量。

1.7 肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察 肺組織經(jīng)4%多聚甲醛固定、石蠟包埋、切片(厚度為5 μm)和展片處理后，行常規(guī)HE染色，然后通過光學(xué)顯微鏡觀察各組大鼠肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。

1.8 肺細(xì)胞凋亡狀況的觀察及凋亡指數(shù) (A I)的計算 取經(jīng)“1.7”項制備的肺組織石蠟切片，按試劑盒操作步驟依次進(jìn)行處理后行TUNEL染色，然后通過光學(xué)顯微鏡平行觀察肺組織細(xì)胞凋亡狀況(細(xì)胞核黃褐色為陽性著色)；AI的計算：每張切片隨機(jī)選取6個視野，計數(shù)每個視野中肺細(xì)胞總數(shù)和陽性凋亡細(xì)胞數(shù)，然后計算各組大鼠肺組織細(xì)胞AI：AI(%)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/肺總細(xì)胞數(shù))×100%

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 15.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以(s)表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料采用 χ2檢驗；P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織W/D 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肺組織W/D顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，黃芪甲苷中、高劑量組(40、80 mg/kg)W/D顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠肺組織W/D比較(s)

表1 各組大鼠肺組織W/D比較(s)

注：與假手術(shù)組比較，△△表示P＜0.01；與模型組比較，＊表示 P＜0.05,＊＊表示 P＜0.01

組別 只數(shù) 劑量/(mg·kg-1) W/D/%假手術(shù)組 10 - 5.1±0.3模型組 10 - 6.4±0.7△△黃芪甲苷低劑量 10 20 6.0±0.5黃芪甲苷中劑量 10 40 5.7±0.4＊黃芪甲苷高劑量 10 80 5.4±0.3＊＊

2.2 各組大鼠肺組織抗氧化酶活性 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肺組織中抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，黃芪甲苷(40、80mg/kg)組SOD、GSH-Px、CAT活性均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

2.3 各組大鼠血清中MPO活性、MDA含量 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中MPO活性、MDA含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，黃芪甲苷(40、80 mg/kg)組MPO活性、MDA含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表3。

表2 各組大鼠肺組織SOD、GSH-Px、CAT活性比較(s)

表2 各組大鼠肺組織SOD、GSH-Px、CAT活性比較(s)

注：與假手術(shù)組比較，△△表示P＜0.01；與模型組比較：＊表示P＜0.05,＊＊表示P＜0.01

組別 只數(shù) 劑量/(mg·kg-1) SOD/(U·mgprot-1) GSH-Px/(U·mgprot-1) CAT/(U·mgprot-1)假手術(shù)組 10 - 16.2±1.4 106.4±13.6 2.0±0.4模型組 10 - 10.7±1.2△△ 83.5±11.7△△ 0.9±0.2△△黃芪甲苷低劑量 10 20 12.0±1.6 87.3±10.9 1.1±0.3黃芪甲苷中劑量 10 40 13.5±1.4＊ 94.2±13.1 1.4±0.5＊黃芪甲苷高劑量 10 80 15.0±1.7＊＊ 102.3±15.0＊＊ 1.7±0.4＊＊

表3 各組大鼠血清中MPO活性、MDA含量比較(s)

表3 各組大鼠血清中MPO活性、MDA含量比較(s)

注：與假手術(shù)組比較，△△表示P＜0.01；與模型組比較，＊表示P＜0.05,＊＊表示P＜0.01

組別 只數(shù) 劑量/(mg·kg-1) MPO(IU·L-1) MDA(nmol·L-1)假手術(shù)組 10 - 3.6±0.5 3.1±0.4模型組 10 - 9.4±1.7△△ 8.5±0.6△△黃芪甲苷低劑量 10 20 7.5±1.8 7.4±0.8黃芪甲苷中劑量 10 40 5.3±1.5＊ 5.6±0.6＊＊黃芪甲苷高劑量 10 80 4.2±1.6＊＊ 4.3±0.5＊＊

2.4 各組大鼠肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu) 假手術(shù)組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)均未見異常；模型組大鼠肺組織呈現(xiàn)肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，上皮細(xì)胞變性、壞死，肺泡內(nèi)有大量的液體滲出，炎癥細(xì)胞浸潤等明顯的病理性形態(tài)學(xué)改變；而與模型組比較，黃芪甲苷(40、80 mg/kg)組肺組織病理性形態(tài)學(xué)變化明顯改善，以黃芪甲苷(80 mg/kg)組效果最為顯著。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)(HE×400)

2.5 各組大鼠肺細(xì)胞凋亡狀況及A I 經(jīng)TUNEL染色后假手術(shù)組大鼠肺組織可見極少量凋亡細(xì)胞，而模型組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡狀況較假手術(shù)組明顯加重；與模型組比較，黃芪甲苷各組細(xì)胞凋亡狀況呈不同程度改善，其中以黃芪甲苷高劑量組效果最為顯著。見圖2。計算AI發(fā)現(xiàn)：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肺組織細(xì)胞AI明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，黃芪甲苷(40、80 mg/kg)組AI顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表4。

圖2 各組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡狀況(TUNEL)

表4 各組大鼠肺細(xì)胞凋亡率(s)

表4 各組大鼠肺細(xì)胞凋亡率(s)

注：與假手術(shù)組比較，△△表示P＜0.01；與模型組比較，＊＊表示P＜0.01

組別 只數(shù) 劑量/(mg·kg-1) 凋亡率/%假手術(shù)組 10 - 2.3±0.7模型組 10 - 34.8±4.5△△黃芪甲苷低劑量 10 20 37.5±4.1黃芪甲苷中劑量 10 40 26.6±3.2＊＊黃芪甲苷高劑量 10 80 18.0±2.5＊＊

3 討論

肺缺血再灌注損傷病理機(jī)制非常復(fù)雜，廖秀清等［1］和柴軍等［2］研究發(fā)現(xiàn)，再灌注后出現(xiàn)的廣泛的氧化應(yīng)激損傷和肺細(xì)胞凋亡是肺缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展的重要因素。劉國輝等［8］和程建等［9］通過藥物干預(yù)肺缺血再灌注大鼠模型，抑制肺細(xì)胞凋亡從而對大鼠肺缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用，為我們今后研發(fā)緩解肺缺血再灌注損傷的新型藥物提供了新的思路。

黃芪甲苷為我國傳統(tǒng)中藥黃芪的主要有效成分之一，具有多種藥理學(xué)活性。本實驗對采用夾閉左肺門45 min后松夾的方法制備的肺缺血再灌注損傷大鼠模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)黃芪甲苷中、高劑量組(40、80 mg/kg)預(yù)處理能夠顯著降低肺缺血再灌注損傷大鼠W/D、改善肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)病變、抑制肺細(xì)胞凋亡，提示黃芪甲苷對肺缺血再灌注大鼠具有保護(hù)作用。

正常生理狀態(tài)下，體內(nèi)生成的氧自由基能夠在超氧化物歧化酶(SOD)催化作用下還原生成H2O2［10］，并進(jìn)一步在GSH-Px或CAT的作用下還原生成對人體無害的 H2O 和 O2［11］，因此 SOD、GSH-Px、CAT 的活性能夠反映機(jī)體抗氧化能力；脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物丙二醛(MDA)水平能夠間接反映機(jī)體氧化應(yīng)激損傷程度。髓過氧化物酶(MPO)是中性粒細(xì)胞特有的酶，其活性能夠反映中性粒細(xì)胞激活和浸潤，也能間接反映組織氧化應(yīng)激損傷程度［12］。細(xì)胞凋亡是一種可由多種因素誘發(fā)的繼發(fā)性行為，而氧化應(yīng)激損傷正是誘發(fā)細(xì)胞凋亡的重要因素之一。本研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)黃芪甲苷(40、80 mg/kg)預(yù)處理能夠有效改善抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT)活性、降低血清中 MPO 活性和MDA含量；提示黃芪甲苷具有降低肺缺血再灌注損傷大鼠氧化應(yīng)激損傷的作用，從而間接抑制肺細(xì)胞凋亡。

總之，黃芪甲苷對大鼠肺缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與番茄紅素能夠有效改善機(jī)體抗氧化酶活性、抑制肺組織氧化應(yīng)激損傷以及抑制肺細(xì)胞凋亡有關(guān)。

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