申小惠，張文君，楊新蔚，展 銳，溫少瑾甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA)是一組以造血干祖細(xì)胞損傷、全血細(xì)胞減少為主要臨床表現(xiàn)的骨髓造血功能衰竭性疾病，也是一種以造血組織為靶細(xì)胞的自身免疫性疾病。臨床主要表現(xiàn)為全血細(xì)胞減少導(dǎo)致的貧血、出血和感染。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為AA是一種與CD4+T細(xì)胞亞群功能異常有關(guān)，由T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病［1］。AA患者免疫異常會使機體Th1/Th2 T淋巴細(xì)胞群比例失調(diào)、CD4+/CD8+T細(xì)胞亞群比例嚴(yán)重紊亂，使機體產(chǎn)生各種負(fù)性調(diào)控因子(如IFN-γ和TNF-α等)，抑制正常造血干細(xì)胞生長，最終引起骨髓衰竭［2］。其中Th17細(xì)胞作為促炎細(xì)胞，可誘導(dǎo)自身免疫性疾病的發(fā)生；而Treg細(xì)胞則具有抗炎和維持自身免疫耐受的作用，兩者在細(xì)胞分化發(fā)育過程中存在著制約關(guān)系，Treg/Th17細(xì)胞失衡可導(dǎo)致許多自身免疫性疾病的發(fā)生［3-4］。目前已有研究表明AA外周血中Treg細(xì)胞明顯減少，而Th17細(xì)胞顯著升高［5-6］，可以肯定Treg/Th17細(xì)胞的比例與AA的發(fā)病、預(yù)后密切相關(guān)。近年來，筆者就以健脾補腎、調(diào)氣和血、化瘀解毒為立法依據(jù)的自擬益元生血方對AA患者外周血T細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了觀察，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 臨床資料 根據(jù)隨機對照表選取2014年1月至2016年5月在甘肅省中醫(yī)院腫瘤血液科二部就診的10例AA患者為觀察組，其中男6例，女4例；年齡40～70歲，平均(52.34±16.03)歲。另選健康對照者10例為對照組，其中男5例，女5例；年齡 40～70歲，平均(56.24±14.14)歲。2組性別、年齡等基礎(chǔ)資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 納入：1)符合AA西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］者；2)中醫(yī)辨證屬脾腎虧損，邪毒內(nèi)蘊證型［8］者；3)已停用化療藥物、造血生長因子或糖皮質(zhì)激素2周以上者；4)未經(jīng)抗生素或抗病毒藥物治療的活動性感染者；5)本人同意參與此項試驗研究，依從性好，資料完整，可隨訪者；6)納入者經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會審定同意。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 排除：1)不符合上述納入標(biāo)準(zhǔn)者；2)對本方案治療藥物過敏者；3)妊娠期或哺乳期婦女；4)精神疾病患者；5)合并其他血液系統(tǒng)或非血液系統(tǒng)腫瘤，或有較嚴(yán)重的心、肝、腎等重要臟器器質(zhì)性病變者；6)依從性差或因各種原因終止研究可能性大、不能完成研究流程者；7)病情危重，難以對本次實驗的有效性作出確切評價者。

1.4 實驗藥物 益元生血方藥物組成：黃芪20 g，菟絲子15 g，女貞子20 g，何首烏15 g，丹參10 g，三七10 g，雞血藤10 g，白花蛇舌草10 g，半枝蓮10 g，牡丹皮 15 g，白術(shù) 12 g，黨參 15 g，當(dāng)歸 10 g，生地黃10 g。上述藥物均由甘肅省中醫(yī)院提供。1.5 實驗試劑 人淋巴細(xì)胞分離液(深圳達(dá)科為公司)；FITC anti-human CD4、PerCP/Cy5.5 anti-human CD8、PE anti-human IL-17A、APC anti-human IFN-γ、APC anti-human IL-4、PE anti-human CD25、PMA+Ionomycin淋巴細(xì)胞刺激物、Cell Staining Buffer(美國Biolegend公司)；改良型RPMI-1640培養(yǎng)基(賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)；益元生血方水提物(甘肅省中醫(yī)院制劑中心提供)。

1.6 實驗儀器 顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；低溫冰箱(廣州菱志電子公司)；離心機(北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司)；A06061422超凈工作臺(蘇凈集團(tuán)安泰公司)；酶聯(lián)儀(美國BIO-RAD公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)。

1.7 實驗方法

1.7.1 AA患者外周血T淋巴細(xì)胞與益元生血方水提物共培養(yǎng)后時效量效關(guān)系測定 無菌抽取診斷后治療前AA患者和正常人對照組外周血5mL，用EDTA抗凝后，加入人外周血淋巴細(xì)胞分離液5 mL，1 500 r/min，離心后，沉淀為淋巴細(xì)胞，棄上清液，并加入1 mL培養(yǎng)液于沉淀中，吹勻，調(diào)整細(xì)胞密度為 7×104個 /mL，每孔 100 μL。將益元生血方水提物用完全RPMI-1640稀釋至以下濃度10%、5%、2.5%、1.25%、0.625%，每孔 100 μL 加入到含各組淋巴細(xì)胞懸液的96孔板中，每個濃度梯度設(shè)10個復(fù)孔，同時設(shè)正常人淋巴細(xì)胞懸液+完全RPMI-1640培養(yǎng)液，設(shè)完全RPMI-1640培養(yǎng)液空白對照組、培養(yǎng)時間分別為24、36、48、72小時。培養(yǎng)結(jié)束前4小時各孔加MTS(濃度為5 mg/mL)20 μL，繼續(xù)CO2培養(yǎng)箱孵育4小時后，酶標(biāo)儀570 nm處檢測吸光度值，并用完全RPMI-1640培養(yǎng)液空白對照孔調(diào)零，結(jié)果用OD值表示，依據(jù)MTS的實驗結(jié)果以確定最佳藥物濃度和最佳培養(yǎng)時間，進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.7.2 干預(yù)方法 采集2組研究對象外周血5 mL，制備外周血淋巴細(xì)胞懸液，將制備好的淋巴細(xì)胞混懸液加入到24孔板中，細(xì)胞濃度為2×l07個/mL，每孔500 μL。觀察組淋巴細(xì)胞懸液加入5%益元生血方水提取物、對照組淋巴細(xì)胞懸液予同劑量完全RPMI-1640培養(yǎng)液，每孔500 μL，每組設(shè)10個復(fù)孔，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)36后，各組分別標(biāo)記收集在2 mL離心管中，2 500 r/min，離心5分鐘，棄上清液。1 mol/L PBS洗滌細(xì)胞沉淀，用1 mL PBS重懸細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個/mL。取各組細(xì)胞懸液300 μL分別加入到3個2 mL離心管中，第 1 管加 FITC- 抗人 CD4 0.5 μL，PerCP/cy5.5-抗人 CD8 5 μL；第 2 管加 APC- 抗人 IFN-γ 5 μL，APC-抗人IL-4 5 μL；第3管加PE-抗人IL-17A1.25μL，PE-抗人CD251.25μL，混勻。4℃避光孵育30分鐘后，PBS洗細(xì)胞3次，洗畢，2 500 r/min離心5分鐘，棄上清，加500 μL PBS于細(xì)胞沉淀中，輕輕吹勻，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.8 觀 察 指 標(biāo) 2 組 CD4+、CD8+、IFN-γ、IL-4、IL-17、CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞亞群的分化；益元生血方干預(yù)前后 CD4+、CD8+、IFN-γ、IL-4、IL-17、CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞亞群的分化。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)分析，所有數(shù)據(jù)均以(s)表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A A患者外周血T淋巴細(xì)胞與益元生血方水提物共培養(yǎng)后時量效關(guān)系測定 培養(yǎng)時間為36小時時，各組T淋巴細(xì)胞增殖活性均優(yōu)于24、48和72小時，藥物濃度為5%時各組T淋巴細(xì)胞增殖活性均優(yōu)于 10%、2.5%、1.25%、0.625%，但都達(dá)不到正常組水平，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。因此，后續(xù)實驗研究將培養(yǎng)時間定為36小時，藥物濃度定為5%，見表1。

2.2 外 周 血 CD4+、CD 8+、IFN-γ、IL-4、IL-17、CD 4+CD 25+T淋巴細(xì)胞 與正常對照組比較，觀察組外周血 CD4+、CD4+/CD8+、IL-4、CD4+CD25+的表達(dá)明顯下降(P＜0.05)，CD8+、IFN-γ、IL-17 的表達(dá)顯著升高(P＜0.05)。見表2。

2.3 益元生血方水提物干預(yù)后A A患者外周血CD4+、CD 8+、IFN-γ、IL-4、IL-17、CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞變化 與干預(yù)前比較，干預(yù)后CD4+、CD4+/CD8+、IL-4、CD4+CD25+的 表 達(dá) 下 降 (P ＜0.05)，CD8+、IFN-γ、IL-17 的表達(dá)顯著升高(P＜0.05)。見表3。

3 討論

AA的發(fā)病與免疫紊亂關(guān)系密切，異常的免疫反應(yīng)可損傷造血干細(xì)胞［9］。CD4+T細(xì)胞在維持機體的正常免疫應(yīng)答中起著重要作用，其細(xì)胞的分化和細(xì)胞因子的異常調(diào)節(jié)在炎癥及自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。CD4+T細(xì)胞又分為Th1、Th2、Th17及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，其中Th1主要輔助細(xì)胞免疫，分泌IL-2及IFN-γ等。Th1細(xì)胞激活程度與機體造血功能呈負(fù)相關(guān)，同時IFN-γ可抑制正常骨髓細(xì)胞的分化、增殖、對造血干、祖細(xì)胞生長起抑制作用［10］。Th2則主要輔助體液免疫，分泌IL-4及IL-13等。Th1/Th2細(xì)胞的極化在機體免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，研究發(fā)現(xiàn)AA患者出現(xiàn)Th1細(xì)胞極化現(xiàn)象，呈現(xiàn)Th1細(xì)胞優(yōu)勢反應(yīng)，而Th1/Th2細(xì)胞比例明顯失衡［11］。Th17細(xì)胞與多種自身免疫性疾病關(guān)系密切，主要分泌IL-17等，IL-17可通過刺激內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮TGF-β等細(xì)胞因子，對骨髓造血發(fā)揮抑制作用，且IL-17可直接活化髓系祖細(xì)胞NF-κB，抑制祖細(xì)胞的增殖或促進(jìn)其凋亡［12］。CD4+Treg細(xì)胞大約占CD4+T細(xì)胞的5%～10%，表達(dá)CD25分子和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原(CTLA-4)，活化的CD4+CD25+Treg主要通過接觸抑制的方式抑制T細(xì)胞的活化和增殖，其通過抑制效應(yīng)CD8+T細(xì)胞促進(jìn)骨髓造血恢復(fù)［13］。而CD8+T細(xì)胞被異常激活后，可抑制自體及異體祖細(xì)胞集落形成，說明其與造血功能衰竭密切相關(guān)［14］。

表1 2組A A患者外周血T淋巴細(xì)胞與益元生血方水提物共培養(yǎng)后時效量效關(guān)系測定比較(s)

表1 2組A A患者外周血T淋巴細(xì)胞與益元生血方水提物共培養(yǎng)后時效量效關(guān)系測定比較(s)

注：＊表示與對照組同培養(yǎng)時間比較，P＜0.05；#表示相同濃度間比較，P＜0.05；△表示相同時間點組間比較，P＜0.05

組別 例數(shù) 藥物濃度/% 不同培養(yǎng)時間增殖活性/h 24 36 48 72對照組 10 - 0.236±0.016 0.409±0.007 0.275±0.002 0.230±0.012觀察組 10 10 0.052±0.005＊ 0.082±0.006＊ 0.084±0.003＊ 0.082±0.008＊5 0.128±0.009＊ 0.188±0.008＊#△ 0.125±0.014＊ 0.121±0.008＊2.5 0.109±0.010＊ 0.109±0.012＊ 0.078±0.006＊ 0.078±0.009＊1.25 0.075±0.008＊ 0.078±0.006＊ 0.052±0.006＊ 0.045±0.006＊0.625 0.050±0.004＊ 0.062±0.012＊ 0.044±0.004＊ 0.041±0.003＊

表2 2 組外周血 CD4+、CD8+、IFN-γ、IL-4、IL-17、CD4+CD25+T 淋巴細(xì)胞亞群百分率比較(s)

表2 2 組外周血 CD4+、CD8+、IFN-γ、IL-4、IL-17、CD4+CD25+T 淋巴細(xì)胞亞群百分率比較(s)

注：＊表示與對照組比較，P＜0.05

組別 例數(shù) CD4+/% CD8+/% CD4+/CD8+ IFN-γ/% IL-4% IL-17/%CD4+CD25+/%對照組 10 55.67±3.24 34.81±2.65 1.61±0.17 11.16±0.54 6.24±0.21 2.29±0.23 5.2±0.57觀察組 10 39.29±2.83＊ 40.11±2.41＊ 0.98±0.21＊ 14.16±0.81＊ 3.68±0.39＊ 16.17±0.72＊ 2.98±0.28＊t 11.17 6.76 1.63 10.39 18.18 61.29 12.17

表3 益元生血方水提物干預(yù)前后AA患者外周血CD4+、CD8+、IFN-γ、IL-4、IL-17、CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞變化(s)

表3 益元生血方水提物干預(yù)前后AA患者外周血CD4+、CD8+、IFN-γ、IL-4、IL-17、CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞變化(s)

注：＊表示與益元生血方干預(yù)后比較，P＜0.05

干預(yù)前 10 51.24±2.83＊ 38.52±1.55＊ 1.33±0.08＊ 13.21±0.73＊ 4.68±0.48＊ 12.29±0.41＊ 2.98±0.28＊干預(yù)后 10 39.29±2.83 40.11±2.41 0.98±0.21 14.16±0.81 3.68±0.39 16.17±0.72 2.24±0.31 t 9.30 4.68 1.53 9.16 7.31 11.41 7.74

本實驗研究發(fā)現(xiàn)AA患者外周血中CD4+、IL-4、CD4+CD25+的表達(dá)明顯下降，CD8+、IFN-γ、IL-17 的表達(dá)顯著升高。這與文獻(xiàn)報道一致［15］。AA是通過免疫機制介導(dǎo)的一種自身免疫性疾病，本研究再次證實AA的發(fā)病機制與免疫功能的紊亂有一定的相關(guān)性。AA屬中醫(yī)“虛勞”“血證”范疇,臨床上均有脾腎虧損、瘀毒內(nèi)停的表現(xiàn)。中醫(yī)認(rèn)為脾腎虧損、瘀毒內(nèi)停是AA的主要病機，本研究采用健脾補腎、調(diào)氣和血、化瘀解毒的方法，自擬“益元生血方”治療此病。該方由黃芪、白術(shù)、黨參、菟絲子、女貞子、當(dāng)歸、何首烏、生地黃、丹參、三七、雞血藤、白花蛇舌草、半枝蓮、炒牡丹皮等組成，諸藥相合，甘溫助陽，養(yǎng)血和營，化瘀解毒，使臟腑得以運化，血液得以化生；滋陰與溫陽并舉，補虛而不壅滯，祛邪而不傷正，標(biāo)本兼顧，動靜結(jié)合，寒溫并濟(jì)，共奏健脾補腎，活血解毒之功。益元生血方水提物與AA患者外周血共培養(yǎng)后，AA患者外周血CD4+、IL-4、CD4+CD25+的表達(dá)升高，CD8+T 細(xì)胞，IFN-γ、IL-17的表達(dá)下降。

綜上所述，益元生血方可以增加AA患者外周血 CD4+、IL-4、CD4+CD25+的表達(dá)，下調(diào) CD8+T 細(xì)胞、IFN-γ、IL-17的表達(dá)，益元生血方可能通過調(diào)節(jié)AA患者免疫功能以發(fā)揮治療的作用。益元生血方是我們長期臨床實踐的經(jīng)驗總結(jié)，療效顯著，但限于樣本數(shù)有限，未能進(jìn)行系統(tǒng)全面的分子學(xué)，蛋白組學(xué)研究其機制，在后續(xù)實驗研究中將進(jìn)一步對其機制進(jìn)行深入研究。

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