曹慧玲， 杭 鳴， 趙蘇瑛， 楊 琳， 吳 玲， 李 岷， 汪小蓉

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 江蘇省中醫(yī)院檢驗(yàn)科，南京，210029）

痰標(biāo)本的涂片染色鏡檢和分離培養(yǎng)是病原學(xué)診斷的常用方法，對(duì)于診斷呼吸系統(tǒng)感染及指導(dǎo)臨床用藥具有重要價(jià)值。下呼吸道標(biāo)本取樣應(yīng)用最廣泛、最簡便的方法為自然咳痰法，此法無創(chuàng)、標(biāo)本易獲得，然而其影響因素較多，尤其易受上呼吸道正常定植菌群的影響，因此經(jīng)常出現(xiàn)致病菌與定植菌難以區(qū)分的情況[1]，在臨床工作中則往往會(huì)遇到用藥效果和痰培養(yǎng)藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果不一致的現(xiàn)象[2]。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，大量抗菌藥物的使用，呼吸道正常定植菌群作為條件致病菌，已成為下呼吸道感染的主要致病菌，也給臨床治療帶來較大的困擾，迫切需要微生物檢驗(yàn)提供可靠的病原學(xué)資料指導(dǎo)臨床診斷及用藥[3]。痰涂片不僅可以用來篩選合格痰標(biāo)本，其鏡下內(nèi)容也為下呼吸道感染診斷提供一定的參考依據(jù)[4]。本研究用合格痰標(biāo)本，鏡下觀察標(biāo)本中白細(xì)胞（white blood cell，WBC）吞噬細(xì)菌情況，探討其在下呼吸道感染診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本及來源 隨機(jī)收集2014年10月—2015年6月南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物室接收的臨床住院患者痰標(biāo)本175份（上皮細(xì)胞≤10或10～25個(gè)/低倍視野，WBC≥25個(gè)/低倍視野[5]）。

1.1.2 儀器及材料 Vitek 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌分析儀（法國生物梅里埃公司），哥倫比亞血瓊脂平板（安圖生物公司），M-H瓊脂平板（鄭州安圖生物公司），中國藍(lán)瓊脂粉（英國Oxoid Limited公司），革蘭染液（珠海BASO公司），顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本處理和鏡檢內(nèi)容 將痰標(biāo)本進(jìn)行涂片，自然干燥，火焰固定后革蘭染色、鏡檢。隨機(jī)收集合格痰標(biāo)本175份，先在低倍鏡下找到合適視野再轉(zhuǎn)為油鏡仔細(xì)觀察至少50個(gè)視野，記錄鏡下觀察到的細(xì)菌或真菌等微生物以及染色性質(zhì)（革蘭陽性或革蘭陰性）和形態(tài)（桿狀、球狀），同時(shí)觀察有無WBC吞噬或伴行細(xì)菌現(xiàn)象，若有此現(xiàn)象，則記錄該細(xì)菌染色性質(zhì)和形態(tài)等，并計(jì)算吞噬WBC所占比例，即50個(gè)鏡下視野中找到吞噬細(xì)菌WBC的個(gè)數(shù)/WBC總數(shù)。最后將所有標(biāo)本進(jìn)行分組，將可見WBC吞噬或伴行細(xì)菌的標(biāo)本為A組，未見WBC吞噬或伴行細(xì)菌的標(biāo)本為B組。

1.2.2 痰標(biāo)本培養(yǎng) 痰標(biāo)本以三區(qū)劃線法分別接種于血平板、巧克力平板、中國藍(lán)平板，置于35 ℃ 5% CO2孵育箱中培養(yǎng)18～24 h（常規(guī)培養(yǎng)）。篩選培養(yǎng)分離的可疑菌落用微量生化管或Vitek 2 Compact系統(tǒng)及配套鑒定卡進(jìn)行鑒定，藥物敏感性試驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法或最低抑菌濃度法。當(dāng)合格痰標(biāo)本中出現(xiàn)肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、β-溶血性鏈球菌（+）～（++++），或金黃色葡萄球菌、腸桿菌科細(xì)菌、不動(dòng)桿菌、假單胞菌或其他革蘭陰性桿菌（++）～（++++）時(shí)，確定為分離的下呼吸道潛在病原菌。

1.2.3 質(zhì)量控制 質(zhì)控菌株為大腸埃希菌（ATCC 25922）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）及金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）。

1.2.4 臨床資料收集 查閱電子病歷，包括患者年齡、性別、基礎(chǔ)疾病、是否具有感染癥狀（體溫、咳嗽咳痰等）及其他輔助診斷指標(biāo)如血常規(guī)、胸片等，患者痰標(biāo)本培養(yǎng)前抗菌藥物使用情況及培養(yǎng)后依據(jù)藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果用藥后感染癥狀的改變。

1.2.5 病原菌的確定 患者具有感染指征并且依據(jù)藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果指導(dǎo)臨床用藥后治療有效。

1.2.6 定植菌的確定 患者無感染指征或有感染指征但是依據(jù)藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果指導(dǎo)臨床用藥后治療無效。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定性資料用率表示，率之間比較用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床資料

175例患者的年齡為2～95歲，其中70歲以上的老年患者99例，占56.6%，其他臨床資料見表1。

表1 患者的臨床資料

2.2 涂片中WBC吞噬或伴行細(xì)菌的確定及比例

WBC吞噬細(xì)菌的能力對(duì)于抵抗病原微生物的侵入發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。呼吸系統(tǒng)細(xì)菌感染時(shí)，鏡下可在合格的痰涂片中找到大量的WBC，并且WBC的胞質(zhì)中包含有大量細(xì)菌（吞噬）或WBC周圍分布大量細(xì)菌（伴行）（圖1），提示機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)入侵的病原微生物發(fā)揮吞噬殺菌的功能。51份合格痰標(biāo)本涂片中發(fā)生吞噬的WBC比例平均為30%。

2.3 不同分組的痰涂片標(biāo)本與細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果一致性的比較

圖1 痰涂片中WBC吞噬現(xiàn)象

根據(jù)鏡下是否檢出WBC吞噬或伴行細(xì)菌的情況將痰標(biāo)本分為A、B 2個(gè)組，與最終培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行比較。A組痰涂片中可見WBC吞噬或伴行細(xì)菌的有51例，與其相應(yīng)培養(yǎng)結(jié)果一致率達(dá)84.3%，B組痰涂片中未見WBC吞噬或伴行細(xì)菌的有124例，與培養(yǎng)結(jié)果一致率為58.1%，2個(gè)組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），A組與B組痰涂片與細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果的符合性比較見表2。

表2 痰涂片與細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果符合性 [例（%）]

2.4 不同分組的痰涂片標(biāo)本與細(xì)菌感染率和定植率的關(guān)系比較

A組痰涂片標(biāo)本中檢出致病菌（具有其他感染指征并對(duì)抗菌藥物有效）占92.2%，而B組痰標(biāo)本涂片僅為38.7%，61.3%為檢出呼吸道定植菌群，2個(gè)組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。痰涂片鏡檢結(jié)果與細(xì)菌感染和定植的關(guān)系見表3。

表3 痰涂片與細(xì)菌感染和定植的關(guān)系 [例（%）]

3 討論

目前，在我國醫(yī)院臨床微生物實(shí)驗(yàn)室接收的標(biāo)本中，痰標(biāo)本仍然占有很大的比例，然而關(guān)于痰培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)化操作程序還不盡完善。痰標(biāo)本留取不合格[6]、在痰培養(yǎng)前或痰培養(yǎng)的同時(shí)對(duì)痰標(biāo)本未能進(jìn)行革蘭染色鏡檢、盛行以優(yōu)勢(shì)菌來判別致病菌、不注重與臨床實(shí)際情況相結(jié)合等不規(guī)范操作，不僅存在誤導(dǎo)臨床診斷的可能，而且也加重了抗菌藥物濫用的現(xiàn)象。由于口咽部有大量正常生理菌群，咳痰標(biāo)本受口咽部生理菌群的污染不可避免。隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的飛速發(fā)展，各種抗菌藥物的大量使用，下呼吸道感染病原菌的種類不斷變遷。過去典型的致病菌如白喉棒狀桿菌、百日咳鮑特菌等已顯著減少，相反由條件致病菌引起的感染卻不斷增多，成為下呼吸道感染的主要病原菌。條件致病菌為人體正常菌群的成員，在合適的定居部位不會(huì)引起感染，在機(jī)體因各種因素造成的抵抗力下降、菌群失調(diào)或天然屏障結(jié)構(gòu)破壞時(shí)可引起感染發(fā)生[7]。因此，條件致病菌引起下呼吸道感染的病原學(xué)診斷已成為目前臨床醫(yī)學(xué)的難點(diǎn)。

本研究在進(jìn)行痰培養(yǎng)檢查的患者中發(fā)現(xiàn)，所有患者均患有不同程度基礎(chǔ)疾?。ǜ哐獕?、糖尿病等），56.6%的患者年齡在70歲以上，85.1%患者具有一定感染癥狀（呼吸道感染、尿路感染或混合感染），而91.4%的患者在留取痰標(biāo)本前均不同程度地使用過抗菌藥物，接受了一定的抗菌治療。以上臨床資料表明，呼吸道感染的患者多為年齡較大，有其他基礎(chǔ)疾病，且接受過一定抗菌藥物治療的患者，這些患者免疫力偏弱，易受到致病細(xì)菌的侵犯或引起條件致病菌感染。細(xì)菌培養(yǎng)是診斷下呼吸道感染疾病的重要手段，但往往存在標(biāo)本合格率低，培養(yǎng)時(shí)間較長，致病菌與定植菌難以區(qū)分等不足，痰涂片為培養(yǎng)結(jié)果提供了較好的輔助性判斷，根據(jù)WBC與上皮細(xì)胞的比例可判斷標(biāo)本是來自下呼吸道，還是非口腔唾液等上呼吸道分泌物[8]。本研究隨機(jī)選取175份合格痰標(biāo)本，比較痰涂片鏡檢結(jié)果與培養(yǎng)結(jié)果的一致性，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示可見WBC吞噬或伴行細(xì)菌的痰涂片標(biāo)本的一致性要顯著高于未見WBC吞噬或伴行細(xì)菌的痰涂片標(biāo)本（P＜0.05），表明在臨床工作中，進(jìn)行痰涂片觀察時(shí)若可見WBC吞噬或伴行細(xì)菌，高度提示有培養(yǎng)的必要性。然而仍有小部分存在不一致，其原因可能為：痰涂片中WBC吞噬為機(jī)體免疫與微生物共同作用的結(jié)果，免疫力較強(qiáng)，細(xì)菌基本被清除，培養(yǎng)為陰性，痰涂片上為殘留死菌；痰涂片或培養(yǎng)時(shí)采集的痰涂片不一致，有些黏稠的痰液未經(jīng)消化處理，不能采集到有效部位；工作人員的工作經(jīng)驗(yàn)不足等因素。

在病菌與宿主相互作用過程中，宿主吞噬細(xì)胞（主要為WBC）大量趨化浸潤至炎癥部位，吞噬殺滅病菌，造成感染癥狀發(fā)生[9]。因此，下呼吸道感染患者，不論是由致病菌還是條件致病菌引起，其來自炎癥部位的痰液中必定含有大量WBC。WBC吞噬異物（包括病原菌）是機(jī)體的一種非特異性免疫防御機(jī)制，即便是健康人群其呼吸道分泌物也會(huì)有少量WBC存在，而且不同的個(gè)體免疫狀態(tài)不同，因此單純的咳痰標(biāo)本細(xì)胞學(xué)計(jì)數(shù)無法確定所培養(yǎng)出的條件致病菌為感染病原菌[10]。本研究將患者具有感染指征并且依據(jù)藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果指導(dǎo)臨床用藥后治療有效的確定為致病菌，患者無感染指征或者有感染指征，但是依據(jù)藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果指導(dǎo)臨床用藥后治療無效的確定為定植菌。結(jié)果顯示A組（痰涂片中可見WBC吞噬或伴行細(xì)菌）的標(biāo)本中（吞噬WBC比例平均為30%）培養(yǎng)出的細(xì)菌確定為致病菌的標(biāo)本有47例（92.2%），而B組（痰涂片中未見WBC吞噬或伴行細(xì)菌）的標(biāo)本培養(yǎng)出的細(xì)菌確定為病原菌的標(biāo)本有48例（38.7%），由此可見痰涂片中可見WBC吞噬或伴行細(xì)菌對(duì)鑒別致病菌和定植菌有較好的提示作用，為臨床醫(yī)生正確認(rèn)識(shí)培養(yǎng)結(jié)果、正確判斷下呼吸道感染并合理使用抗菌藥物提供了依據(jù)。

綜上所述，痰涂片中檢出WBC吞噬細(xì)菌或伴行細(xì)菌對(duì)下呼吸道感染的病原學(xué)診斷具有重要價(jià)值，且革蘭染色鏡檢最為經(jīng)濟(jì)、快速，能在早期為患者的診斷和治療提供重要信息[11-12]，此外，結(jié)合細(xì)菌培養(yǎng)以及藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果可指導(dǎo)臨床用藥，提高臨床診斷的正確性，減輕患者的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

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