空氣中粒徑在10 μm以下的顆粒物均可被吸入并沉積在呼吸系統(tǒng)中,其中粒徑≤2.5μm的顆粒物(particulate matter 2.5,PM2.5)富集多種重金屬、有機(jī)污染物、酸性氧化物等,且是病原微生物的載體,吸入后可進(jìn)入呼吸道深部,對(duì)人體的毒性和危害性更大[1-4]。近年來(lái),我國(guó)大部分地區(qū)空氣污染嚴(yán)重,呼吸道疾病的患病率呈逐年上升趨勢(shì),其中PM2.5被認(rèn)為是重要的致病物質(zhì)。研究表明:氧化應(yīng)激損傷是PM2.5 損傷呼吸系統(tǒng)的重要機(jī)制之一[5],而N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)具有抗氧化應(yīng)激作用,但對(duì)PM2.5所致肺損傷是否有效,及治療劑量與效果是否具有量效關(guān)系尚不明確。為此,本課題制備PM2.5染毒SD大鼠肺損傷動(dòng)物模型,并給予不同劑量NAC口服治療,檢測(cè)氧化應(yīng)激、肺損傷程度及炎癥反應(yīng)等指標(biāo),探討NAC對(duì)PM2.5染毒SD大鼠肺損傷的治療作用,為NAC治療PM2.5相關(guān)肺損傷提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年健康Sprague-Draw(SD)大鼠50只，均為雄性，體質(zhì)量203～219 g，平均(211.8±7.8)g，購(gòu)入后于室溫22 ℃～28 ℃飼養(yǎng)，供標(biāo)準(zhǔn)口糧，自由飲食，飲用水為無(wú)菌飲用水，日照12 h/d，觀察l周后實(shí)驗(yàn)。

1.2 PM2.5的采集及混懸液制備 應(yīng)用嶗應(yīng)2030型中流量智能TSP采樣器于2016年6月1日至10月30日在市中心采樣,將顆粒物采集在直徑9 cm的玻璃纖維濾膜上,采樣結(jié)束后,將玻璃纖維濾膜剪碎放入50 ml超純水中,超聲震蕩15 min洗脫,吸取洗脫液后再次加入50 ml超純水繼續(xù)超聲震蕩15 min,將兩次洗脫液合并于錐形瓶中,經(jīng)多層無(wú)菌紗布過(guò)濾后用低溫離心機(jī)將洗脫液于4℃、10 000 r/min離心3次,每次20 min。棄上清液，將底層顆粒物進(jìn)行真空冷凍干燥后合并顆粒物,將其低溫冰箱保存。用生理鹽水制備成濃度為40 mg/ml的顆粒物混懸液,超聲振蕩5 min使顆粒物混勻并滅菌。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 成年SD大鼠50只,采用隨機(jī)數(shù)字表法分為5組,每組10只,采用氣道滴入法制備動(dòng)物模型。空白組經(jīng)氣道滴入生理鹽水,對(duì)照組、低劑量治療組、中劑量治療組、高劑量治療組經(jīng)氣道滴入PM2.5滅菌懸液,均制作為PM2.5 染毒肺損傷動(dòng)物模型。對(duì)照組不給予NAC干預(yù)治療,治療組分別給予口服低、中、高劑量NAC治療。以上動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程經(jīng)動(dòng)物倫理委員會(huì)評(píng)議同意實(shí)施。

1.3.1 PM2.5染毒肺損傷大鼠模型的制備:模型制備前大鼠自由進(jìn)水,禁食12 h。稱(chēng)重后腹腔注射10%水合氯醛麻醉,將大鼠仰臥固定于操作臺(tái)上,剪去頸毛消毒頸部皮膚,于頸部中線下段做1 cm切口,鈍性分離皮下組織和肌肉,暴露氣管,灌注針頭于氣管環(huán)狀軟骨間插入,按1 ml/kg劑量注入PM2.5混懸液,注射后將大鼠直立旋轉(zhuǎn)數(shù)次,使PM2.5混懸液均勻分布于大鼠肺部,待大鼠呼吸節(jié)奏平穩(wěn)后縫合切口。10只空白組按1 ml/kg劑量注射生理鹽水,均給予16萬(wàn)U青霉素注射3 d預(yù)防感染。

1.3.2 PM2.5 染毒肺損傷大鼠NAC治療方法:低劑量組給予NAC 300 mg/(kg·bw)口服,中劑量組給予NAC 600 mg/(kg·bw)口服,高劑量組給予NAC 1200 mg/(kg·bw)口服,連續(xù)治療10 d。

1.4 檢測(cè)方法 各組大鼠均于第10天時(shí)腹腔注射10%水合氯醛麻醉,分離出氣管,行氣管插管并固定,收集股動(dòng)脈血送檢。開(kāi)胸完整切除右肺制成肺病理標(biāo)本。左肺用4℃無(wú)菌生理鹽水經(jīng)氣管插管灌洗,回收支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)檢測(cè)谷胱甘肽(glutathione,GSH)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)含量。GSH采用GSH試劑盒檢測(cè)(試劑盒為美國(guó)Cayman Chemical公司生產(chǎn)),LDH采用日立7170A全自動(dòng)生化分析儀及專(zhuān)用試劑盒檢測(cè),將血漿和BALF樣品所測(cè)得A值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算濃度。肺組織腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表達(dá)采用免疫組化法,隨機(jī)選取肺組織切片的5個(gè)視野,應(yīng)用Meta Morph軟件分析陽(yáng)性細(xì)胞的光強(qiáng)度,光強(qiáng)度越高,則TNF-α蛋白表達(dá)越多。采用ELISA法檢測(cè)肺組織勻漿中白細(xì)胞介素-10(interleukin 10,IL-10)和IL-18含量。IL-10、IL-18試劑盒均購(gòu)自北京尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司。

2 結(jié)果

2.1 口服不同劑量NAC對(duì)PM2.5染毒大鼠氧化應(yīng)激及肺損傷治療作用 對(duì)照組與各治療組大鼠血漿和BALF中GSH水平均低于空白組,LDH水平高于空白組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各治療組大鼠GSH水平均高于對(duì)照組,LDH水平低于對(duì)照組(P<0.05)。低、中、高3個(gè)治療組大鼠血漿和BALF中GSH和LDH水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血漿和BALF中LDH、GSH水平比較

注：與空白組比較,*P<0.05;與對(duì)照組比較,△P<0.05;與低劑量組比較,▲P<0.05;與中劑量組比較,#P<0.05

2.2 不同劑量NAC口服對(duì)PM2.5染毒大鼠炎癥反應(yīng)的影響 對(duì)照組與各治療組大鼠肺組織中TNF-α、IL-10、IL-18含量均高于空白組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各治療組大鼠肺組織中TNF-α、IL-10、IL-18含量均低于對(duì)照組(P<0.05)。高劑量組大鼠肺組織中TNF-α、IL-10、IL-18含量低于低劑量組(P<0.05)。低劑量組與中劑量組、高劑量組與中劑量組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠肺組織TNF-α、IL-10、IL-18含量比較

注：與空白組比較,*P<0.05；與對(duì)照組比較,△P<0.05；與低劑量組比較,▲P<0.05

3 討論

3.1 NAC對(duì)炎癥反應(yīng)的作用 TNF-α是重要的前炎性細(xì)胞因子,異常升高的TNF-α可通過(guò)以下途徑或機(jī)制引起肺損傷。(1)與肺組織TNF-α受體結(jié)合,使溶酶體受損外泄，直接損傷肺組織及毛細(xì)血管等;(2)刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞,上調(diào)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞間黏附分子-1表達(dá),增加毛細(xì)血管通透性,致白細(xì)胞等向炎癥部位遷移,引起肺損傷[6-7];(3)TNF-α可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞合成、釋放IL-18等前炎性細(xì)胞因子,促進(jìn)炎癥反應(yīng),并進(jìn)一步放大炎癥信號(hào),產(chǎn)生級(jí)聯(lián)放大作用,加重肺損傷[8]。IL-18也是一種強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫刺激因子,炎癥反應(yīng)時(shí)IL-18可造成組織損傷。IL-10是由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的一種抗炎性細(xì)胞因子,相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),機(jī)體在急性炎癥反應(yīng)出現(xiàn)時(shí),多種細(xì)胞炎癥因子,包括TNF-α、IL-18、IL-10等表達(dá)升高,可在24～72 h達(dá)峰值。本研究結(jié)果顯示,對(duì)照組肺組織TNF-α、IL-10、IL-18含量高于空白組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明PM2.5可導(dǎo)致肺部炎癥,刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生大量的促炎因子和抗炎因子。 NAC治療后,肺組織TNF-α、IL-10、IL-18含量均較對(duì)照組明顯降低,可能是NAC治療后炎癥反應(yīng)減輕,其誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞分泌的IL-10減少。

3.3 NAC對(duì)肺損傷的作用 LDH是一種糖酵解酶,由2種亞基M和H組成,分布于所有組織器官中,而且其分布組織特異性明顯,是臨床診斷組織器官損傷的特異性指標(biāo)之一。正常生理狀態(tài)新陳代謝下,血漿中LDH含量處于正常值范圍,在肝臟和肌肉組織中以LDH5為主,在心臟組織中以LDH1為主,在肺組織中以LDH3為主。一旦組織細(xì)胞非正常大量損傷時(shí),會(huì)有大量LDH分子漏出[11],導(dǎo)致血漿LDH水平升高。PM2.5染毒大鼠發(fā)生肺損傷時(shí),肺間質(zhì)和實(shí)質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生大量LDH3,并釋放至血中,導(dǎo)致血漿和BALF中LDH水平升高。檢測(cè)血漿和BALF中LDH活性可判斷肺組織損傷程度。本研究結(jié)果顯示,對(duì)照組LDH活性明顯高于空白組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示PM2.5可致大鼠肺損傷。NAC治療后LDH活性均低于對(duì)照組,且高劑量、中劑量、低劑量治療組間GSH水平從低到高排列,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示NAC治療可減輕肺損傷。

綜上所述,PM2.5對(duì)呼吸系統(tǒng)有多種損傷作用,氧化應(yīng)激損傷是重要機(jī)制之一。本研究結(jié)果初步證實(shí)了口服NAC對(duì)PM2.5所致的肺損傷具有治療作用,作用機(jī)制可能在于減輕氧化應(yīng)激、控制炎癥反應(yīng)而實(shí)現(xiàn),且治療劑量與效果存在一定的量效關(guān)系。相關(guān)的研究結(jié)果有待于更大樣本實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證,其所涉及的信號(hào)通路值得進(jìn)一步探討。

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