丁寶光，露 娜，陳雪龍*

（1.黑龍江鶴崗市蘿北縣寶泉嶺農(nóng)場，黑龍江 鶴崗 154211；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

近年來，我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展迅速，從國外引進種豬的品種和數(shù)量增多。加之飼養(yǎng)管理不當(dāng)，豬病的動態(tài)越來越復(fù)雜，豬病以病原的多重感染和混合感染為主要流行形式，豬病群發(fā)病往往不是由單一病原所致，而是以兩種以上的病原體相互協(xié)同作用所造成的，常常導(dǎo)致豬群的高發(fā)病率和高死亡率，危害嚴(yán)重。細(xì)菌的混合感染主要涉及豬鏈球菌、豬肺炎支原體、副豬嗜血桿菌、傳染性胸膜肺炎放線桿菌、豬多殺性巴氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌等。

豬瘟俗稱“爛腸瘟”是由黃病毒科豬瘟病毒屬的豬瘟病毒引起的一種急性、發(fā)熱、接觸性傳染傳染病，具有高度傳染性和致死性[1]。常常與一種或幾種細(xì)菌、病毒、原蟲混合感染或繼發(fā)感染[2]，1885年首先在美國發(fā)現(xiàn)，以后傳播到世界各大洲。中國大部分省份都有發(fā)生。1903年美國獸醫(yī)學(xué)家德希尼茲和多賽特鑒定本病的病原是披蓋病毒科的瘟病毒屬中的豬瘟病毒[3]。主要通過直接接觸，或由于接觸污染的媒介物而發(fā)病。消化道、鼻腔黏膜和破裂的皮膚均是感染途徑。一年四季都可發(fā)生，以春夏多雨季節(jié)為多。

豬鏈球菌病是集約化養(yǎng)豬場的主要傳染病之一， 世界各地均有發(fā)生，20 世紀(jì)90 年代以前， C 群和D 群的馬鏈球菌獸疫亞種是我國豬鏈球菌病的主要病原。各年齡段的豬都可感染此病， 但多發(fā)于3～12 周齡的豬，尤其是斷奶仔豬易感染此病。由于目前還沒有十分有效的疫苗， 因此該病還在世界范圍內(nèi)廣為流行， 嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。

本文通過對大慶市某豬場送檢仔豬的病理解剖和實驗室診斷，確診這一病豬發(fā)病原因是該豬同時感染豬瘟病毒和鏈球菌，現(xiàn)將診斷過程匯報如下。

1 材料與方法

1.1 病料

大慶地區(qū)某豬場送檢病豬的肺臟、肝臟、脾臟、腎臟等。

1.2 試劑

Marker DL 2000 購自大連寶生物工程有限公司，TIANamp Genomic DNA Kit DNA提取盒購自TIANGEN公司，PCR Master Mix 緩沖液，RNeasy Plus Mini Handbook RNA提取盒購自QIAGEN公司，RevertAid F irst Strand cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄盒購自MBI公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank中已發(fā)表的豬巴氏桿菌、豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、豬藍耳病毒、豬圓環(huán)病毒、豬瘟病毒基因序列設(shè)計特異引物。

引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 細(xì)菌分離培養(yǎng)

無菌剪取一小塊深部組織臟器，接種涂抹于5%兔血瓊脂培養(yǎng)基上，分別做需氧和厭氧培養(yǎng)，置37 ℃ 恒溫箱中24 h，同時用接菌環(huán)挑取腸內(nèi)容物接種在伊紅美藍和麥康凱培養(yǎng)基上，置37 ℃恒溫箱中需氧培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)和溶血情況等，挑取疑似菌的單個菌落進行純培養(yǎng)。

表1 引物設(shè)計

1.5 核酸的提取及鑒定

1.5.1 組織DNA和RNA提取

按照TIANamp Genomic DNA Kit操作進行提取DNA；按照 RNeasy Plus Mini Handbook RNA提取盒進行提取RNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 RNA反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增

按RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄盒說明書操作步驟將病毒提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA 在-20 ℃進行保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 藥敏試驗

將鑒定為鏈球菌的純培養(yǎng)物用接種棒均勻涂布在鮮血培養(yǎng)基上，將藥敏紙片分別貼于平皿中，37 ℃培養(yǎng)24 h，測定抑制菌圈直徑大小，根據(jù)檢測標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果[4]。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀

整群豬精神萎頓、食欲不振，發(fā)病豬只喜臥不動，嗜睡，體溫升高（最高達40.5℃），呼吸困難、急促、結(jié)膜發(fā)紺。尿液發(fā)黃，糞便呈算盤珠樣，也有稀便，糞便中混有腸黏膜。四肢內(nèi)側(cè)及腹部有紫色紅斑，耳尖發(fā)紫。運動失調(diào)。有的不能站立，或爬行，病程3～5 d，衰竭死亡。

2.2 病理學(xué)診斷

經(jīng)剖檢，病死豬多呈現(xiàn)多發(fā)性出血性為特征的敗血性病變。淋巴結(jié)呈急性炎癥變化，淋巴結(jié)腫脹，外觀呈深紅色至紫黑色，切面周邊出血，切口外翻；肝臟腫脹、顏色變淺、質(zhì)地變脆；腎臟實質(zhì)性病變，色澤變淺，可見包膜下有針尖狀出血點，遍布整個腎臟表面；切開腎臟，可見皮質(zhì)層、髓質(zhì)層、腎乳頭及腎盂黏膜上均有數(shù)量不等、大小不一的點狀出血；脾臟表面有微隆起的梗死病灶，呈紫黑色，數(shù)量不等，大小不一，個別有黃豆粒大小，質(zhì)脆；胰腺腫大、出血；胸腹水增多，心肌松馳，心冠脂肪有小出血點；十二指腸潰瘍，有鈕扣狀出血灶、壞死灶；胃黏膜充血，脫落，有出血點；回盲瓣附近淋巴濾泡壞死、潰爛；關(guān)節(jié)腫脹，滑液混濁，關(guān)節(jié)囊內(nèi)有黃色膠凍樣液體，關(guān)節(jié)液增多，個別出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨壞死，關(guān)節(jié)周圍組織有多發(fā)性化膿灶。

3 實驗室診斷

3.1 革蘭氏染色

將病料中所分離的細(xì)菌進行純培養(yǎng)，然后對其革蘭氏染色、涂片、鏡檢[5]?？梢娝{紫色的鏈狀或成雙排列的球菌，疑似鏈球菌。

圖1 細(xì)菌革蘭氏染色10×10倍光學(xué)顯微鏡照片

3.2 PCR結(jié)果

PCR結(jié)果見圖2。

圖2 PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳分析

如圖2所示，第1孔在28 0bp左右有一條帶，與豬瘟病毒片段相符；第6孔在689 bp左右有一條帶，與鏈球菌片段相符。

3.3 藥敏試驗結(jié)果

表2 藥敏結(jié)果

4 討論

4.1 發(fā)病原因

對該豬場仔豬的發(fā)病原因進行調(diào)查。發(fā)現(xiàn)該豬場疫苗免疫不到位或免疫程序不科學(xué)：未作免疫，或疫苗運輸、保存、使用不恰當(dāng)，造成免疫效果差或無效。消毒不到位：鏈球菌病多由外傷感染引起。如器械、環(huán)境消毒不嚴(yán)造成傷口感染，仔豬的斷臍、斷尾，三至四日齡的補鐵、補硒注射，閹割，疫苗的免疫注射等操作過程中消毒不嚴(yán)造成感染。防范不到位：豬瘟病毒侵入豬場、患有免疫抑制性疾病、豬病原蟲感染加之防治不到位，造成繼發(fā)感染等[7]。

4.2 防治措施

做好疫苗免疫注射工作。母豬配種前要做好豬瘟疫苗的免疫，每次產(chǎn)后20 d可隨未做超免的仔豬按4個劑量的兔化豬瘟弱毒疫苗加強免疫1次；仔豬在豬瘟流行期間可做超免，未做超免的20日齡按2個劑量免疫注射，55～60日齡按4個劑量加強免疫1次。母豬產(chǎn)前20 d免疫鏈球菌病滅活苗1次，仔豬20日齡免疫鏈球菌病滅活苗1次[8]。

做好消毒防范工作。搞好環(huán)境衛(wèi)生，嚴(yán)格執(zhí)行消毒制度，健全獸醫(yī)衛(wèi)生防疫制度并執(zhí)行到位，對豬體傷口要及時消毒處理，以防感染，嚴(yán)防豬瘟病毒傳入豬場。

做好藥物保健。每隔1～2周用藍圓熱毒清（抗毒、殺菌、提高免疫力的中藥提取劑）按0.2%的比例拌料2 d，圓藍五肽（提高免疫力的中藥多肽提取劑）100 mL加水25 kg讓豬自由飲用2 d。

落實“五早”措施。對豬病要早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療、早隔離、早滅原，盡早凈化豬場[9]。

5 結(jié)論

通過對該病死豬的病理解剖和實驗室診斷，確診送檢的病死仔豬死亡原因是該病豬感染了豬瘟病毒和鏈球菌。

[1] 盧景華. 豬流行病難治原因及其解決對策[J].當(dāng)代畜牧，2014(15)：11-12.

[2] 侯友. 近幾年豬流行病的發(fā)生特點及防治對策[J].山東畜牧獸醫(yī)，2009(3)：23-25.

[3] 徐建民，周光斌. 豬瘟和鏈球菌病混合感染的診斷與防治[J]. 中國畜牧獸醫(yī)文摘，2011(3)：148.

[4] 郝春燕，王利勤，王晶鈺. 豬鏈球菌的分離鑒定及藥敏試驗[J]. 動物醫(yī)學(xué)進展，2010(5)：124-128.

[5] 李彥華. 革蘭氏染色原理[J]. 遼寧工程技術(shù)大學(xué)學(xué)報， 2006，25 (S2)：335-336.

[6] 尹燕博，徐瑞，李葳，等. 豬鏈球菌病病原和病理學(xué)診斷[J]. 中國動物檢疫，1997（3）：3-5.

[7] 郭志霞. 豬瘟臨床癥狀及防控措施[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘，2013，29（3）：94.

[8] 劉國清.試論豬流行病的發(fā)病原因與防控對策[J].農(nóng)民致富之友，2013（20）：186-189.[9] 楊新立，武文海. 豬瘟和鏈球菌病混合感染的診治[J]. 今日畜牧獸醫(yī)，2013(10)：30-31.