李偉偉 耿曉松 申保生 楊玉新 宋新文

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院感染疾病科，衛(wèi)輝 453100)

肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是我國常見的惡性腫瘤，發(fā)病率位居所有腫瘤的第五位，死亡率位居第三位[1]。侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因[2]。因此，明確腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵調(diào)控基因及其相應(yīng)的信號通路，并進行相應(yīng)的阻斷是腫瘤治療的重要措施[3]。在腫瘤的發(fā)展過程中，因自身血管供應(yīng)不能滿足快速生長的腫瘤細胞的需要，逐漸形成低氧環(huán)境，腫瘤細胞能通過一系列自我調(diào)節(jié)以適應(yīng)低氧微環(huán)境，其中發(fā)揮核心調(diào)控作用的因子為HIF-2α[4，5]，激活后啟動下游多種基因和蛋白質(zhì)的表達，參與細胞增殖、代謝、血管生成、腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移等，加速疾病惡化[6]。因此，本實驗應(yīng)用特異性HIF-2α siRNA下調(diào)低氧誘導(dǎo)下人肝癌細胞株HepG2細胞中HIF-2α表達，研究其表達下調(diào)對低氧環(huán)境下的HepG2細胞體外增殖、凋亡和遷移侵襲等生物學(xué)行為的影響，為肝癌的分子靶向治療提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 RT-PCR 試劑盒、LipofectamineTM2000和Trizol Reageat購自美國Invitrogen公司；CoCl2購自美國Sigma公司；HIF-2α引物由上海生工生物工程有限公司合成，特異性siRNA由廣州市銳博生物科技有限公司合成，兔抗人HIF-2α單克隆抗體為美國Santa Cruz 公司產(chǎn)品；BCA蛋白定量試劑盒、增強化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色液購自中國南京凱基生物公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自美國Biovision公司；Transwell 小室購自美國Corning 公司。

1.1.2細胞 人肝癌細胞株HepG2由中國科學(xué)院上海細胞庫提供。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)、誘導(dǎo)低氧環(huán)境 肝癌HepG2細胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液(37℃培養(yǎng)箱、5%CO2)培養(yǎng)，胰酶消化傳代。取24孔板接種對數(shù)生長期細胞1×104個/孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)基分別調(diào)換成CoCl2濃度為50、100、200、400 μmol/L的缺氧培養(yǎng)箱，誘導(dǎo)HepG2細胞處于低氧環(huán)境，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細胞用于檢測。

1.2.2不同低氧濃度誘導(dǎo)下HepG2細胞HIF-2α mRNA表達 收集各組HepG2細胞，按照Trizol RNA試劑盒說明書步驟操作，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后以cDNA為模板，以熒光定量PCR的方法擴增HIF-2α mRNA，Real-time PCR方法檢測各組細胞中HIF-2α mRNA表達。HIF-2α引物序列：上游5′-GGTGAAAGTCTACAACAACTGCC-3′，下游5′-ATGGGTGCTGGATTGGTTC-3′，GAPDH引物序列：上游5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。Real-time PCR 擴增條件：95℃預(yù)變性5 min、95℃變性30 s、60℃退火30 s 和 72℃延伸30 s，共 40 個循環(huán)。所有標本均重復(fù)檢測3次，計算Ct值，采用2-ΔΔCt法進行計算分析。

1.2.3細胞轉(zhuǎn)染及分組 選擇合適低氧濃度(加200 μmol/L CoCl2)誘導(dǎo)細胞后，在RPMI1640培養(yǎng)液中(37℃培養(yǎng)箱、5%CO2)培養(yǎng)，細胞融合度達到85%左右時，在LipofectamineTM2000脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染細胞。實驗分為四組，常氧組、低氧組、低氧+Control siRNA組、低氧+HIF-2α siRNA組。

1.2.4轉(zhuǎn)染后HepG2細胞HIF-2α mRNA表達 收集轉(zhuǎn)染后48 h的各組HepG2細胞，按照1.2.2步驟檢測HIF-2α mRNA表達。

1.2.5轉(zhuǎn)染后HepG2細胞HIF-2α蛋白表達 收集轉(zhuǎn)染后各組細胞分別進行培養(yǎng)，48 h后提取各組核蛋白，BCA法測定蛋白濃度。10%的聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白，電泳后轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜上，用含5%脫脂奶粉的PBST于常溫下封閉1 h，分別加入GAPDH和HIF-2α一抗，4℃孵育過夜。次日洗膜后，加入對應(yīng)的第二抗體孵育90 min，加入ECL顯色液顯影。采用Quantity One軟件，對圖片進行分析并測定灰度值。

1.2.6轉(zhuǎn)染后HepG2細胞增殖變化 取對數(shù)生長期HepG2細胞，接種96孔板，接種細胞數(shù)量為：1×104個/孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后，在培養(yǎng)基中加入200 μmol/L CoCl2并進行轉(zhuǎn)染，每組設(shè)4個復(fù)孔，同時設(shè)空白對照。繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72、96、120 h后，每孔加入5 mg/ml的MTT溶液 20 μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去孔內(nèi)上清液，加入150 μl/孔二甲基亞砜(DMSO)，振蕩10 min后，以空白孔為對照，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，檢測波長為490 nm，實驗重復(fù)3次。記錄結(jié)果，根據(jù)公式計算：細胞增殖率(%)=實驗組OD值/對照組OD值×100%，繪制細胞生長曲線圖。

1.2.7轉(zhuǎn)染后HepG2細胞凋亡變化 收集轉(zhuǎn)染48 h 后的各組 HepG2細胞，4℃預(yù)冷的PBS洗滌細胞2次，250 μl 1×緩沖液重懸細胞制備單細胞懸液，調(diào)節(jié)濃度為1×106個/孔。取100 μl細胞懸液5 ml于流式管中，分別加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI混勻，室溫避光孵育20 min，加入400 μl PBS，用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。實驗重復(fù)3 次，取平均值。

1.2.8轉(zhuǎn)染后HepG2細胞周期變化 細胞轉(zhuǎn)染48 h 后，用不含EDTA的胰蛋白酶收集，磷酸鹽緩沖液(PBS)制備成單細胞懸液，800 r/min離心10 min，70%乙醇4℃固定過夜，預(yù)冷的PBS洗滌3次，加入200 μl RNase A(1 mg/ml)，37℃溫育30 min。避光條件下加入PI染色液(100 ng/ml)800 μl 混勻，4℃放置30 min。使用流式細胞儀分析樣品，測定細胞周期。

1.2.9轉(zhuǎn)染后HepG2細胞侵襲遷移力變化 Transwell法檢測細胞遷移：采用24孔板Transwell遷移系統(tǒng)以無血清的DMEM培養(yǎng)基懸浮各組細胞為單細胞懸液(7.5×105個/ml)。在Transwell小室上層加入200 μl懸液，小室下層加入600 μl DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，常規(guī)培養(yǎng)24 h，取出小室，甲醇固定 30 min，蘇木素染色 5 min，流水沖洗，棉簽擦掉未穿過膜的細胞。光鏡下隨機選取6個視野計數(shù)，實驗重復(fù)3次。Transwell法檢測細胞侵襲：Transwell 小室濾膜上室面均勻涂Matrigel膠，紫外線照射殺菌。余下步驟同 Transwell遷移實驗。

2 結(jié)果

2.1不同低氧濃度誘導(dǎo)下HepG2細胞HIF-2α mRNA表達 RT-PCR結(jié)果顯示 HepG2細胞在常氧環(huán)境下有少量HIF-2α表達，當CoCl2濃度為50、100、200、400 μmol/L 時，HIF-2α mRNA相對表達量逐漸遞增，與常氧組比較，均有顯著性差異(P<0.05)。CoCl2濃度為200 μmol/L和 400 μmol/L時，HIF-2α mRNA表達量無顯著性差異，因HepG2細胞在200 μmol/L CoCl2濃度時損傷相對輕，故后續(xù)實驗選擇200 μmol/L CoCl2作為低氧環(huán)境誘導(dǎo)HepG2細胞，見圖1。

圖1 不同濃度CoCl2組HepG2細胞HIF-2α mRNA的表達Fig.1 HIF-2α mRNA expression of HepG2 cells in different concentration of CoCl2 groupNote: Compared with normoxic group,*.P<0.05.

2.2轉(zhuǎn)染48 h后各組HepG2細胞中HIF-2α mRNA表達 低氧誘導(dǎo)下，HIF-2α mRNA表達顯著上調(diào)，特異性轉(zhuǎn)染HIF-2α siRNA后，HIF-2α mRNA表達顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，低氧組與低氧+Control siRNA組相比，及低氧+HIF-2α siRNA組與常氧組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

2.3轉(zhuǎn)染48 h后各組HepG2細胞中HIF-2α蛋白表達 低氧誘導(dǎo)下，HIF-2α蛋白表達顯著上調(diào)，特異性轉(zhuǎn)染HIF-2α siRNA后，HIF-2α蛋白表達顯著下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，低氧組與低氧+Control siRNA組相比，及低氧+HIF-2α siRNA組與常氧組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

圖2 轉(zhuǎn)染48 h后各組細胞中HIF-2α mRNA的表達Fig.2 Expression of HIF-2α mRNA in each group cell after 48 h transfectionNote: Compared with normoxic group,*.P<0.05;compared with hypoxia+control group,#.P<0.05.

圖3 轉(zhuǎn)染48 h后各組細胞中HIF-2α蛋白的表達情況Fig.3 Expression of HIF-2α protein in each group cell after 48 h transfectionNote: Compared with normoxic group,*.P<0.05;compared with hypoxia+control group,#.P<0.05.1.Normoxic group;2.Hypoxia group;3.Hypoxia+control group;4.Hypoxia+HIF-2α siRNA group.

GroupsApoptosisrate(%)G0/G1phase(%)Sphase(%)G2/Mphase(%)Normoxicgroup9 862±0 62160 257±5 63520 807±1 69718 937±4 689Hypoxiagroup6 840±0 7861)46 108±4 5561)26 048±3 5581)27 843±3 1931)Hypoxia+controlgroup7 118±0 84244 795±4 21525 440±3 23829 765±3 919Hypoxia+HIF?2αsiRNAgroup10 663±0 6932)60 645±4 1992)21 168±2 0072)18 187±5 5002)F40 64520 5606 09011 008

Note：Compared with normoxic group,1)P<0.05;compared with hypoxia+control group,2)P<0.05.

圖4 各組HepG2細胞生長曲線圖Fig.4 HepG2 cell growth curve drawn by MTT methodNote: Compared with normoxic group,*.P<0.05;compared with hypoxia+control group,#.P<0.05.

圖5 轉(zhuǎn)染48 h后各組細胞凋亡率Fig.5 Apoptosis rate in each group cell after 48 h transfection

2.4MTT結(jié)果 低氧誘導(dǎo)下，HepG2細胞在24、48、72、96、120 h光密度值均顯著升高，特異性轉(zhuǎn)染HIF-2α siRNA后，HepG2細胞在對應(yīng)時間點的光密度值均顯著降低(P<0.05)，低氧組與低氧+Control siRNA組相比，及低氧+HIF-2α siRNA組與常氧組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

圖6 Transwell小室檢測各組HepG2細胞的遷移、侵襲結(jié)果Fig.6 Migration and invasion of HepG2 cells were detected by Transwell cellsNote: Compared with normoxic group,*.P<0.05;compared with hypoxia+control group,#.P<0.05.

2.5細胞凋亡及細胞周期分布 低氧誘導(dǎo)下，HepG2細胞凋亡率減少，特異性轉(zhuǎn)染HIF-2α siRNA后，HepG2細胞凋亡率升高(P<0.05)，分布于G0/G1期細胞比率顯著升高，S期及G2/M期細胞比率顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，低氧組與低氧+Control siRNA組相比，及低氧+HIF-2α siRNA組與常氧組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖5、表1。

2.6細胞侵襲遷移力 低氧誘導(dǎo)下，HepG2細胞侵襲遷移數(shù)目增多，特異性轉(zhuǎn)染HIF-2α siRNA后，HepG2細胞遷移力降低，穿過侵襲膜的細胞總數(shù)減少(P<0.05)，低氧組與低氧+Control siRNA組相比，及低氧+HIF-2α siRNA組與常氧組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，見圖6。

3 討論

由于惡性腫瘤生長過快，同時微血管結(jié)構(gòu)異常不能提供充足的氧，導(dǎo)致腫瘤組織存在缺血缺氧區(qū)[7]。在腫瘤的長期慢性缺氧過程中，發(fā)揮主要作用的調(diào)控因子為HIF-2α，通過啟動其下游靶基因，增加腫瘤的惡性生物學(xué)行為[8-10]。因此，本實驗應(yīng)用特異性HIF-2α siRNA轉(zhuǎn)染低氧環(huán)境下HepG2細胞，探討下調(diào)HIF-2α基因?qū)θ烁伟┘毎闔epG2低氧狀態(tài)下增殖、凋亡、細胞周期分布和遷移侵襲力的影響。

目前國內(nèi)實驗室多采用在培養(yǎng)基中加入不同濃度CoCl2的方法來誘導(dǎo)腫瘤細胞體外低氧。通過實驗，我們發(fā)現(xiàn)200 μmol/L的CoCl2作用細胞，可達到理想的低氧狀態(tài)，同時對細胞的損傷也較輕。RNA 干擾(RNA interference,RNAi)是近年來在基因治療研究領(lǐng)域興起的一項新技術(shù)，與傳統(tǒng)的反義寡核苷酸和核酶等基因沉默手段相比，穩(wěn)定性更好，抑制效果更優(yōu)越[11]。實驗中，我們發(fā)現(xiàn)低氧環(huán)境下HepG2細胞HIF-2α mRNA和蛋白表達水平均顯著升高，特異性HIF-2α siRNA轉(zhuǎn)染細胞48 h后，HIF-2α在mRNA及蛋白水平表達均顯著下調(diào)，說明細胞轉(zhuǎn)染成功。

腫瘤的進展離不開腫瘤細胞的過度增殖和凋亡減弱[12]，并與細胞周期的調(diào)控異常有密切關(guān)系。細胞周期遵循G1-S-G2-M的發(fā)展規(guī)律，細胞一旦從G1期跨入S期則不再依靠外來信息刺激而自動完成分裂過程[13,14]。低氧環(huán)境下，肝癌HepG2細胞生長速度加快，處于合成后期的細胞比率明顯增多，細胞凋亡減少，特異性HIF-2α siRNA轉(zhuǎn)染后，HepG2細胞生長速度減慢，增殖能力下降，處于合成前期(G0/G1期)的細胞比率升高，細胞凋亡增加。這表明特異性HIF-2α siRNA 很可能通過調(diào)控其細胞周期來控制腫瘤細胞生長，促進細胞凋亡。侵襲和轉(zhuǎn)移是影響腫瘤預(yù)后的一個重要因素[2]，我們發(fā)現(xiàn)，低氧環(huán)境下，肝癌HepG2細胞侵襲遷移能力增強，特異性HIF-2α siRNA轉(zhuǎn)染后，HepG2細胞侵襲遷移能力受到顯著抑制，從而減緩了肝癌的惡性生物學(xué)行為，改善患者預(yù)后。

綜上所述，特異性HIF-2α siRNA轉(zhuǎn)染低氧環(huán)境下肝癌HepG2細胞后，HIF-2α表達下調(diào)，從而抑制細胞增殖、侵襲遷移，促進細胞凋亡，減緩肝癌的惡性生物學(xué)行為。阻斷HIF-2α是靶向治療缺氧腫瘤細胞的關(guān)鍵，有望成為肝癌治療的新靶點，但其中具體的分子機制仍需要進一步研究探索。

[1] Cervello M,McCubrey JA,Cusimano A,etal.Targeted therapy for hepatocellular carcinoma:novel agents on the horizon[J].Oncotarget,2012,3(3):236-260.

[2] 李 娜,王洪興,張 潔,等.siRNA干擾缺氧誘導(dǎo)因子2α對乳腺癌細胞侵襲能力的影響及相關(guān)機制[J].中國老年學(xué)雜志,2015,35(8):2171-2173.

Li N,Wang HX,Zhang J,etal.Effect of siRNA interfering with hypoxia inducible factor 2 alpha on invasive ability of breast cancer cells and its related mechanism[J].Chin J Gerontol,2015,35(8):2171-2173.

[3] 曾楷峰,施瑞華,朱 宏,等.RNA 干擾沉默缺氧誘導(dǎo)因子-1α對胃癌細胞生物學(xué)行為的影響[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2010,30(2):144-149.

Zeng KF,Shi RH,Zhu H,etal.Effects of RNA interference targeting HIF-1α gene on the biological behavior of gastric cancer cells[J].Acta Universitatis Medicinalis Nanjing(Natural Science，2010,30(2)：144-149.

[4] 余小慶,蔡 璨,杜 軒,等.低氧誘導(dǎo)因子-2α-?；o酶A去飽和酶-1通路對低氧誘導(dǎo)的肝癌細胞生物學(xué)行為的影響[J].中華肝臟病雜志,2016,24(7):506-512.

Yu XQ,Cai C,Du X,etal.Effect of hypoxia-inducible factor-2α/stearoyl-CoA desaturase-1 pathway on biological behaviors of hepatoma cells induced by hypoxia[J].Chin J Hepatol,2016,24(7):506-512.

[5] Xue X,Taylor M,Anderson E,etal.Hypoxia-inducible factor-2α activation promotes colorectal cancer progression by dysregulating iron homeostasis[J].Cancer Res,2012,72(9):2285-2293.

[6] Cannito S,Turato C,Paternostro C,etal.Hypoxia up-regulates SERPINB3 through HIF-2α in human liver cancer cells[J].Oncotarget,2015,6(4):2206-2221.

[7] Yang SL,Liu LP,Niu L,etal.Downregulation and pro-apoptotic effect of hypoxia-inducible factor 2 alpha in hepatocellular carcinoma[J].Oncotarget,2016,7(23):34571-34581.

[8] Mohlin S,Hamidian A,Phlman S.HIF2A and IGF2 expression correlates in human neuroblastoma cells and normal immature sympathetic neuroblasts[J].Neoplasia，2013，15(3):328-334.

[9] Yao J,Li J,Geng P,etal.Knockdown of a HIF-2α promoter upstream long noncoding RNA impairs colorectal cancer stem cell properties in vitro through HIF-2α downregulation[J].Onco Targets Ther,2015,8:3467-3474.

[10] 王 旎,董超然,唐 萃,等.HIF-1α、HIF-2α 和 MT 在人甲狀腺乳頭狀癌中的表達及其意義[J].中國免疫學(xué)雜志,2014,30(5):662-665.

Wang N,Dong CR,Tang C,etal.Expression and significance of HIF-1α，HIF-2α and MT in human papillary thyroid carcinoma[J].Chin J Immunol,2014,30(5):662-665.

[11] Varshosaz J,Farzan M.Nanoparticles for targeted delivery of therapeutics and small interfering RNAs in hepatocellular carcinoma[J].World J Gastroenterol,2015,21(42):12022-12041.

[12] Cillo U,Giuliani T,Polacco M,etal.Prediction of hepatocellular carcinoma biological behavior in patient selection for liver transplantation[J].World J Gastroenterol,2016,22(1):232-252.

[13] Madan E,Gogna R,Kuppusamy P,etal.TIGAR induces p53-mediated cell-cycle arrest by regulation of RB-E2F1 complex[J].Br J Cancer,2012,107(3):516-526.

[14] Ruijtenberg S,van den Heuvel S.Coordinating cell proliferation and differentiation:Antagonism between cell cycle regulators and cell type-specific gene expression[J].Cell Cycle，2016，15(2):196-212.