高 駿，呂玉華，戴建軍，張德福，易建中，李 紅，劉成倩，孫鳳萍

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海201106）

山羊在動物分類學(xué)上屬于哺乳動物綱Mammalia、偶蹄目Cetartiodactyla、反芻亞目Ruminantia、?？艬ovoidea、綿陽山羊亞科Caprinae、山羊?qū)貱apra，除了家山羊Capra hircus外，山羊?qū)儆嘞碌姆N多為野生種，如羱羊Capra ibex、捻角山羊Capra falconeri、高加索羱羊Capra caucasica等［1］。我國山羊品種豐富，據(jù)統(tǒng)計(jì)現(xiàn)有山羊品種62個，但由于外來品種的引入，許多品種已瀕臨滅絕［1-2］。崇明島白山羊，毛潔白而富有彈性，羊肉味道鮮美，營養(yǎng)豐富，是冬令御寒助暖抗病延年的滋補(bǔ)佳品。崇明島白山羊是特定水土條件下孕育而成的地方特有良種和傳統(tǒng)特產(chǎn)之一，是上海市首批獲得國家工商總局注冊的“地理標(biāo)志特色農(nóng)產(chǎn)品”。但是對于崇明島白山羊的分子遺傳、系統(tǒng)進(jìn)化等相關(guān)研究鮮有報(bào)道。

動物線粒體基因組由于分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、母系遺傳和進(jìn)化速率快等優(yōu)點(diǎn)，常常作為研究物種起源、亞種分化、分子遺傳學(xué)的重要手段之一［3］。對于崇明島白山羊群體在沒有參考基因組信息的前提下，通過對其線粒體基因組的測序和比較分析，可以從分子生物學(xué)的角度提供重要的分子基因序列參考；通過系統(tǒng)進(jìn)化、群體遺傳學(xué)分析，可以了解崇明島白山羊目前的遺傳多樣性現(xiàn)狀。比較不同地理區(qū)域來源的白山羊樣本，可以發(fā)現(xiàn)一定數(shù)量的分子遺傳標(biāo)記，為今后崇明島白山羊的種群鑒定、來源檢測以及種群繁育的多樣性維持提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

圖1 72只白山羊樣本的采樣地點(diǎn)圖示Fig.1 Sketch map of sampling locations（black dots）of 72 white goat individuals

1 材料與方法

1.1 樣品來源和總DNA提取

在2015年7—9月，本研究采集了上海及周邊長三角地區(qū)共14個點(diǎn)的72只白山羊樣本。其中，崇明島上5家羊場（CM＿1—CM＿5）和2家農(nóng)戶（CM＿6、CM＿7）共采集了36個樣本，上海郊區(qū)（除崇明島外）及周邊的江蘇地區(qū)共7個點(diǎn)也采集了36只白山羊樣本，采樣信息見圖1、表1。每個樣本，利用耳標(biāo)打孔器采集少量耳組織樣本，并編號記錄，放入無水乙醇低溫保存。利用SDS/蛋白酶K裂解，酚氯仿提取總DNA［4］，瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA質(zhì)量。

表1 白山羊樣本采樣信息Table 1 Sampling points and quantities of white goats

1.2 PCR擴(kuò)增及測序

根據(jù)GenBank上已報(bào)道的山羊線粒體基因組全長序列（NC＿005044），設(shè)計(jì)2對PCR引物（CF1/CF2，MA1/MA2），對長三角地區(qū)的72只白山羊樣本的線粒體細(xì)胞色素b基因進(jìn)行測序，引物序列及PCR反應(yīng)條件如下。線粒體細(xì)胞色素 b（cyt b）基因的 PCR擴(kuò)增引物：上游引物（CF1）：5’-ATGACCAACATCCGAAAGAC-3’，下游引物（CF2）：5’-TCTTCATTTTAGAAGGTTG-3’，上游引物（MA1）：5’-TCGGAAGTCTCTTCACAGGA-3’，下游引物（MA2）：5’-TGCTGTTATTGTGTCGGATGT-3’。

PCR反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer（Mg2+free）2μL，MgCL2（25 mmol/L）0.6μL，dNTP Mix（2.5 mmol/L）1.6μL，上下游引物（10 pmol/μL）各1μL，DNA模板2μL，rTaq酶0.3μL，用純水調(diào)整體積至20μL/管。PCR反應(yīng)條件：95℃變性3 min；94℃變性20 s，58℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，35個循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳后，檢測有無目的條帶。并將PCR產(chǎn)物－20℃保存，送深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行PCR產(chǎn)物的測序。

1.3 崇明島白山羊線粒體細(xì)胞色素b基因的測序及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

測序獲得的原始序列利用SeqmanTMⅡ（DNASTAR Inc.）和Chromas2.0進(jìn)行序列檢查，并與已報(bào)道的山羊線粒體細(xì)胞色素b基因進(jìn)行BLAST比對和校正。

利用MEGA 5.0軟件［5］對72只白山羊的cytb序列（表1）以及11條山羊?qū)賱游锛?xì)胞色素b基因的序列（表2）進(jìn)行堿基替換模型檢驗(yàn)。并利用最最大似然法（Maximum likelihood，ML）和鄰接法（Neighbor joining，NJ）分別構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，系統(tǒng)進(jìn)化樹各分支的置信度由Bootstrap法檢驗(yàn)，其中ML法的重復(fù)抽樣次數(shù)為200次，NJ法的重復(fù)抽樣次數(shù)為1 000次。

表2 系統(tǒng)進(jìn)化分析中其他11條山羊?qū)賱游锛?xì)胞色素b基因的序列信息Table 2 Sequences information of Capra genus’other cyt b genes used for phylogenetic analysis

1.4 群體遺傳多樣性檢測

根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹獲得的樣本群體分組信息，利用DnaSP v5［6］軟件統(tǒng)計(jì)72只白山羊樣本不同群體內(nèi)的單倍型（Haplotype）數(shù)量、單倍型雜合度（Hd）以及核苷酸多樣性（π）。利用 Arlequin version 3.5［7］進(jìn)行群體內(nèi)以及群體間的分子變異方差分析。并對各群體的序列進(jìn)行兩種方法的中性檢驗(yàn)（Tajima’s D and Fu’s Fs）和錯配分布（Mismatch distribution）檢驗(yàn)，判斷各群體數(shù)量是否處于穩(wěn)定狀態(tài)還是經(jīng)歷過快速的種群擴(kuò)張事件。

2 結(jié)果與分析

2.1 白山羊樣本線粒體細(xì)胞色素b（cyt b）基因的全長及堿基組成

本研究中72只白山羊線粒體細(xì)胞色素b基因全長序列長度為1 140 bp，平均的堿基組成為：A含量29.6%，G含量19.8%，C含量21.5%，T含量29%。

2.2 白山羊群體系統(tǒng)進(jìn)化樹分析及多態(tài)性位點(diǎn)分析

MEGA序列檢測得到最佳堿基替換模型為GTR+G+I，通過最大簡約法（ML）和鄰接法（NJ）構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹得到相同的分組拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（圖2—3）表明，本研究的72只白山羊樣本，共可分為2個大的分支。其中有40個樣本與江蘇、南京的長江三角洲白山羊樣本聚為一支（取名為YRD），且具有較高置信度（自檢舉置信度Bootstrap＝81%），在這40個樣本中有20個樣本來自于崇明島（CM），而另外20個樣本來自于上海周邊（除崇明島）地區(qū)，該長江三角洲白山羊的40條細(xì)胞色素b全長序列已登錄至Genbank（登錄號：KY348291—KY348330）。而另一支中來自崇明島（16個樣本）以及來自上海周邊地區(qū)（16個樣本）與波爾山羊等聚為一支（取名BOR），具有極高的置信度（自檢舉置信度Bootstrap＝99%）。值得注意的是在YRD支中有6個樣本CM＿F1、CM＿F4以及CM＿G1—G4單獨(dú)地聚為一分支（取名CM），該CM分支中僅包含6個來自于崇明島的白山羊樣本，未出現(xiàn)其他上海周邊地區(qū)的白山羊樣本，提示該6個來自于崇明島的白山羊樣本的母系遺傳來源可能是崇明本地土種白山羊。通過與其他34個YRD支中的長江三角洲白山羊細(xì)胞色素b基因的BLAST比對，共發(fā)現(xiàn)有8個特異的SNP位點(diǎn)（表3）。

2.3 白山羊樣本的群體遺傳學(xué)分析

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，崇明島白山羊以及上海及周邊的長三角地區(qū)白山羊從母系線粒體基因組角度共可分為2個大的群體：1）長江三角洲白山羊（YRD）群體，2）波爾山羊（BOR）群體，還有在YRD群體中，包含有一個小的崇明島群體（CM）。對該3個群體進(jìn)行遺傳多樣性參數(shù)的檢測，發(fā)現(xiàn)3個群體的單倍型雜合度（Hd＝0.600—0.956）均較高，表明3個群體都具有較高的遺傳多樣性（表4）。核苷酸多樣性（π＝0.001—0.003）普遍較低，說明線粒體cyt b基因在各自種群內(nèi)的多樣性較低。群體間遺傳差異的分子方差分析（表5）表明，絕大多數(shù)的遺傳差異來自于群體間（98.98%），而來自于群體內(nèi)的差異很?。?.02%）。中性檢驗(yàn)（Neutrality test）中雖然YRD和BOR群體都呈現(xiàn)負(fù)值，但由于中性檢驗(yàn)P＞0.05，均不顯著，所以不支持群體在歷史上經(jīng)歷過群體擴(kuò)張事件（表6）。

圖2 基于最大似然法（M L）構(gòu)建的72個白山羊線粒體細(xì)胞色素b基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of 72 white goat individuals’m itochondrial cyt b genes constructed by maximum likelihood

圖3 基于鄰接法（NJ）構(gòu)建的72只白山羊線粒體細(xì)胞色素b基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of 72 white goat individuals’m itochondrial cyt b genes constructed by neighbor joining

表3 崇明島白山羊群體（CM）線粒體細(xì)胞色素b基因特異性SNP統(tǒng)計(jì)Table 3 Statistic ofm itochondrial cyt b gene’s single nucleotide polymorphism（SNP）of Chongm ing Island’s white goat population

表4 白山羊群體的遺傳多樣性參數(shù)分析Table 4 Genetic diversity parameters of white goat populations

表5 群體間遺傳差異的分子方差分析Table5 Molecular variance analysis of genetic difference between populations

表6 白山羊群體的中性檢驗(yàn)及核酸錯配分布檢驗(yàn)Table 6 Neutrality and m ismatching distribution tests for white goat populations

3 討論

長江三角洲白山羊（原稱海門山羊）是分布在東海之濱的一種優(yōu)質(zhì)的毛、肉兼用的家養(yǎng)山羊品種，具有悠久的歷史。目前，對山羊的品種研究，主要從形態(tài)學(xué)水平進(jìn)行鑒定，如高騰云等［8］選用體高、體長、胸圍等8個指標(biāo)，應(yīng)用系統(tǒng)聚類的方法對我國19個山羊品種進(jìn)行了分析。而對于各山羊品種，通過分子生物學(xué)基因遺傳角度的研究則相對較少。

目前，主要以微衛(wèi)星標(biāo)記、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)（RAPD）［9］、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）［10］等手段進(jìn)行山羊品種的遺傳多態(tài)性研究。近年來，通過線粒體DNA的母系遺傳結(jié)構(gòu)研究，為解析山羊的系統(tǒng)進(jìn)化以及各山羊品種的遺傳進(jìn)化關(guān)系研究提供了重要手段。Luikart等［11］通過對88個山羊品種的線粒體D-loop高變區(qū)測序分析，發(fā)現(xiàn)山羊至少有3個主要的母系起源。Saeid等［12］通過構(gòu)建來自于不同國家的2 430條山羊線粒體序列，在家養(yǎng)山羊中發(fā)現(xiàn)了7個主要的支系。

崇明島白山羊從分類上屬于長江三角洲白山羊，但關(guān)于該群體的分子生物學(xué)研究很少。陳士超等［13］通過12個ISSR分子標(biāo)記研究了崇明島3個群體和1個徐淮山羊群體的遺傳分化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)群體間的遺傳分化水平很低，而遺傳變異主要來自于群體內(nèi)部，不同山羊群體的遺傳分化不符合地理隔離距離模式。

本研究對崇明島的7個點(diǎn)以及上海及周邊地區(qū)7個點(diǎn)的共計(jì)72個白山羊樣本的母系遺傳結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，在崇明島的36個樣本中，僅有20個樣本的線粒體細(xì)胞色素b基因序列符合長江三角洲樣本序列特征，而其余16個與波爾山羊的細(xì)胞色素b基因具有較高的同源性。這種情況在上海及周邊地區(qū)的白山羊樣本中也是如此，所以將72個樣本根據(jù)線粒體cyt b分組后發(fā)現(xiàn)，符合長江三角白山羊樣本（YRD）的共40個樣本，其余32個為波爾山羊群體（BOR），這表明，目前長江三角洲地區(qū)的白山羊存在大量的外源山羊品種的雜交情況，人類活動（羊只的貿(mào)易、引種）等對崇明島本身的山羊群體遺傳結(jié)構(gòu)造成了重要的影響。大量的外來山羊品種基因滲入到原來的本地山羊群體中，而僅通過形態(tài)學(xué)來判斷山羊品種的遺傳背景已變得非常困難和不準(zhǔn)確。在本研究的長江三角白山羊（YRD）群體中，還發(fā)現(xiàn)了有6個樣本（CM群體）與其他崇明島外的長江三角洲白山羊樣本（YRD）群體在線粒體細(xì)胞色素b基因上存在8個SNP位點(diǎn)。且該6個樣本來源于崇明島上2個農(nóng)戶自繁自養(yǎng)的白山羊樣本，提示該6個樣本可能為崇明島本地山羊品種，而存在較小的與外來山羊雜交情況。研究認(rèn)為，該8個位點(diǎn)需要在更大的群體樣本中進(jìn)行驗(yàn)證，有望成為今后崇明島白山羊種群遺傳鑒定等方面的重要分子遺傳標(biāo)記，建議對該兩個采樣點(diǎn)上的崇明島白山羊進(jìn)行種源保護(hù)和進(jìn)一步的研究。

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