解海杰，高宏偉，王 軍，李傳波，張昌文，劉春雨

全世界泌尿系結(jié)石的發(fā)病率已達(dá)10%～15%[1]。一水合草酸鈣（calcium oxalate monohydrate，COM）可刺激腎小管上皮細(xì)胞并引起腎損傷[2]，促進(jìn)草酸鈣結(jié)晶粘附，進(jìn)一步引起結(jié)晶積聚和結(jié)石形成[3]。復(fù)方金錢(qián)草顆粒具有抗腎結(jié)石、利尿、減輕輸尿管張力和抗炎作用,對(duì)尿路結(jié)石有良好的防治作用[4]。最近的研究顯示，金錢(qián)草黃酮提取物能抑制高草酸尿癥大鼠腎臟草酸鈣晶體的形成[5-6]。但金錢(qián)草總黃酮抑制草酸鈣結(jié)石的機(jī)制并不明確，本文探討金錢(qián)草總黃酮提取物對(duì)COM誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡所致腎損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑及藥物 金錢(qián)草總黃酮購(gòu)自于西安天瑞生物技術(shù)有限公司。第一抗體抗人腎損傷分子（kidney injury molecule-1，KIM-1）、抗LC3-II、抗p-p38、抗p38（1:1000）、內(nèi)參β-actin均購(gòu)自于Merck Millipore。

1.2 COM晶體準(zhǔn)備 二水氯化鈣（10 mmol/L,CaCl2·2H2O）和草酸鈉（10 mmol/L, Na2C2O4）購(gòu)自國(guó)藥，加入到緩沖液Tris-HCl（10 mmol/L,pH 7.4）中，使其終濃度分別為5 mmol/L和0.5 mmol/L?；旌弦河谑覝叵逻^(guò)夜，然后在3000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min。棄上清，用甲醇清洗沉淀。3000 r/min離心5 min后去甲醇，沉淀干燥后于37℃過(guò)夜。在紫外線輻射下凈化30 min，即制備成COM晶體。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 腎小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞）購(gòu)自于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，于含有10%胎牛血清（Gibco）、1.2%青霉素/鏈霉素、2mol/L的L-谷氨酸的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于含5%CO2培養(yǎng)箱中于37 ℃孵育。HK-2細(xì)胞接種于24孔板過(guò)夜。COM晶體處理細(xì)胞48 h使其終濃度分別為0.1、0.5、1、2和5 mmol/L。

1.4 儀器 Eppendorf 5418 小型高速離心機(jī)（德國(guó)），BINDER C150二氧化碳培養(yǎng)箱（德國(guó)），賽默飛Multiskan GO全波長(zhǎng)讀數(shù)儀（美國(guó)），BD FACS 420流式細(xì)胞儀（美國(guó)），GE Typhoon FLA 9500 多功能激光成像儀（美國(guó)）。

1.5 分組 將腎小管上皮細(xì)胞分為6組：對(duì)照組、金錢(qián)草總黃酮處理組（TF組）、p38絲裂原活化激酶（p38/MAPK）抑制組（SB組）、COM處理組（COM組）、COM和金錢(qián)草總黃酮處理組（CTF組）、COM和p38/MAPK抑制組（CSB組）。TF組給予50 μg/mL金錢(qián)草總黃酮處理，SB組給予50 μmol/L的SB203580即p38/MAPK抑制劑處理，COM組給予2 mmol/L的COM處理，CTF組給予COM和50 μg/mL金錢(qián)草總黃酮處理，CSB組給予2 mmol/L的COM和50 μmol/L的SB203580處理。

1.6 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法 （1）測(cè)定細(xì)胞存活率。WST-1法檢測(cè)HK-2細(xì)胞的生存能力，測(cè)定細(xì)胞存活率。不同處理組的HK-2細(xì)胞（對(duì)照組，0.1、0.5、1、2和5 mmol/L COM組）接種于含DMEM（10%胎牛血清）的96孔板中，隨后將WST-1加入培養(yǎng)孔中于37 ℃孵育2 h。分光光度計(jì)設(shè)定測(cè)量波長(zhǎng)450 nm，參考波長(zhǎng)630 nm，讀取各組吸光度值A(chǔ)。各組細(xì)胞活力以其吸光度值與空白對(duì)照組吸光度值的比值表示。（2）測(cè)定細(xì)胞凋亡率，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡數(shù)。收集6組細(xì)胞，1500 r/min離心5 min，PBS液洗滌3次。加入1×Annexin V結(jié)合緩沖液使各組細(xì)胞終濃度為5×105/mL。加入Annexin-V和PI溶液（1 μg/mL，100 μg）于室溫染色15 min。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡數(shù)。細(xì)胞凋亡率（%）=（凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%。（3）蛋白免疫印跡測(cè)定腎損傷標(biāo)志物KIM-1，腎小管細(xì)胞損傷通路相關(guān)分子p38及自噬相關(guān)蛋白LC3-II的表達(dá)。RIPA緩沖液提取來(lái)自于不同組別的HK-2細(xì)胞中的總蛋白。蛋白溶液于12 000 r/min離心15 min，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。10% SDS-PAGE凝膠分離蛋白，轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉封閉2 h。ECL系統(tǒng)（GE）檢測(cè)蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。各組間的比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用bonferroni方法，以P ＜ 0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 COM誘導(dǎo)降低HK-2細(xì)胞存活率 應(yīng)用COM處理HK-2細(xì)胞建立體外泌尿系結(jié)石細(xì)胞模型，與對(duì)照組相比，隨著COM濃度的增加，HK-2細(xì)胞的存活率逐漸下降（圖1）。

圖1 不同濃度COM處理HK-2細(xì)胞后的細(xì)胞存活率

圖2 2 mmol/L COM誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞不同時(shí)長(zhǎng)KIM-1、LC3-II、p-p38和p38蛋白含量的變化

2.2 COM誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞不同時(shí)長(zhǎng)KIM-1，LC3-II，p-p38和p38蛋白含量的變化 應(yīng)用COM處理腎小管上皮細(xì)胞建立體外泌尿系結(jié)石細(xì)胞模型，在2 mmol/L COM處理的腎小管上皮細(xì)胞中，隨著時(shí)間的增加， KIM-1、p-p38、LC3-II表達(dá)增加（圖2）。

2.3 阻斷p38/MAPK通路對(duì)COM誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡的影響 COM可誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡增加，CSB組細(xì)胞凋亡率較COM組細(xì)胞凋亡率降低，應(yīng)用p38/MAPK抑制劑SB203580可抑制COM誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（圖3、4）。

圖3 各組HK-2細(xì)胞凋亡率的變化

圖4 阻斷p38/MAPK通路對(duì)COM誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡的影響

2.4 阻斷p38/MAPK通路對(duì)COM誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞自噬的影響 COM可誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞過(guò)度自噬，CSB組自噬相關(guān)蛋白LC3-II較COM組細(xì)胞降低（圖5、6）。

圖5 各組LC3-II/actin表達(dá)水平

圖6 阻斷p38/MAPK通路對(duì)COM誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞LC3-II/actin表達(dá)水平的變化

2.5 金錢(qián)草總黃酮對(duì)COM誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞p-P38蛋白表達(dá)的影響 Western blotting結(jié)果顯示，CTF組較COM組p-p38蛋白水平降低，說(shuō)明金錢(qián)草總黃酮可阻斷p38/MAPK通路（圖7）。2.6 金錢(qián)草總黃酮對(duì)COM誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞存活率的影響 隨著金錢(qián)草總黃酮濃度的增加，HK-2細(xì)胞存活率也逐漸增加，說(shuō)明金錢(qián)草總黃酮對(duì)HK-2細(xì)胞具有保護(hù)作用（圖8）。

圖7 金錢(qián)草總黃酮對(duì)COM誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞p-P38蛋白表達(dá)的影響

圖8 不同濃度金錢(qián)草總黃酮對(duì)COM誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞存活率的影響

2.7 金錢(qián)草總黃酮對(duì)COM誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡的影響 CTF組細(xì)胞凋亡率較COM組細(xì)胞凋亡率降低，金錢(qián)草總黃酮可抑制COM誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（圖3、9）。

圖9 金錢(qián)草總黃酮對(duì)COM誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡的影響

2.8 金錢(qián)草總黃酮對(duì)COM誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞自噬的影響 CTF組自噬相關(guān)蛋白LC3-II較COM組降低，金錢(qián)草總黃酮可抑制COM誘導(dǎo)的細(xì)胞過(guò)度自噬（圖5、10）。

圖10 金錢(qián)草總黃酮對(duì)COM誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞自噬LC3-II水平的變化

3 討論

泌尿系結(jié)石是全球性常見(jiàn)病，其發(fā)病率約10%～15%，并有逐年增高的趨勢(shì)[7]。雖然如體外沖擊波碎石術(shù)、經(jīng)皮腎鏡取石術(shù)、經(jīng)尿道輸尿管鏡取石術(shù)等微創(chuàng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用并取得成效，但泌尿系結(jié)石的復(fù)發(fā)率仍然很高[8]。泌尿系結(jié)石成分最常見(jiàn)的是草酸鈣結(jié)石，其中COM約占80%。目前結(jié)石成因最為重要的觀點(diǎn)是草酸鈣對(duì)腎小管上皮細(xì)胞損傷假說(shuō)[9]。本研究發(fā)現(xiàn)隨著COM濃度的升高，細(xì)胞存活率逐漸降低，并且KIM-1、p38及自噬相關(guān)蛋白LC3-II的表達(dá)也增加，抑制p38/MAPK通路可減少細(xì)胞過(guò)度自噬和凋亡。腎損傷標(biāo)志物KIM-1是MAPK的下游基因，推測(cè)草酸鈣通過(guò)激活p38/MAPK通路引起腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)過(guò)度自噬，細(xì)胞凋亡水平增加，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞的損傷。這與Paleerath等[10]研究結(jié)果相一致，其研究發(fā)現(xiàn)COM晶體會(huì)通過(guò)p38 MAPK活化導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞緊密連接屏障功能的破壞。草酸鈣導(dǎo)致的腎損傷與p38/MAPK通路激活有關(guān)，從而導(dǎo)致草酸鈣晶體的沉積，而抑制p38/MAPK通路可減少腎小管上皮細(xì)胞凋亡[11]。

金錢(qián)草作為排石之要藥，其臨床作用已得到不斷地驗(yàn)證，但其作用機(jī)制尚不明確。研究顯示金錢(qián)草可抑制草酸鈣結(jié)晶聚集并減輕腎損傷[12]。Rodgers等[13]報(bào)道，金錢(qián)草湯劑可顯著降低人工合成尿液中草酸鈣結(jié)晶的平均體積，并減少草酸鈣結(jié)晶的飽和率，從而證明金錢(qián)草可能是一種有效的草酸鈣抑制劑。Zhao等[14]發(fā)現(xiàn)黃酮類(lèi)是金錢(qián)草正丁醇部位的主要成分，總黃酮對(duì)OH-和O2-具有清除功能，且能減少乙二醇誘導(dǎo)的大鼠腎結(jié)石的形成。最近研究[15]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)金錢(qián)草總黃酮具有抗氧化應(yīng)激作、抗炎作及堿化尿液的作用，降低單核細(xì)胞趨化蛋白-1、骨橋蛋白的水平，減輕腎損傷，抑制結(jié)石的形成。本研究發(fā)現(xiàn)在COM處理過(guò)的HK-2細(xì)胞中加入金錢(qián)草總黃酮后KIM-1、p38及自噬相關(guān)蛋白LC3-II的表達(dá)水平降低，同時(shí)細(xì)胞凋亡水平降低，推測(cè)金錢(qián)草總黃酮可阻斷p38/MAPK通路，抑制COM誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡和過(guò)度自噬，起到保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞的作用。

綜上所述，草酸鈣可能通過(guò)激活p38/MAPK通路導(dǎo)致腎小管上皮損傷，使草酸鈣晶體發(fā)生黏附，從而形成結(jié)石。而金錢(qián)草總黃酮可通過(guò)阻斷p38/MAPK通路抑制腎小管上皮細(xì)胞的過(guò)度自噬和凋亡，減少腎小管上皮細(xì)胞的損傷，從而抑制泌尿系結(jié)石的形成。

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