鄭 琎 傅春燕 陳述政

乳腺癌是女性常見的發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤之一，全球每年乳腺癌發(fā)病人數(shù)有135萬左右，死亡人數(shù)約33萬[1]，尤其是2012年，其發(fā)病人數(shù)高達170萬，且死亡人數(shù)高達52萬[2]。在臨床醫(yī)學(xué)手術(shù)治療、化療、放療、內(nèi)分泌治療、分子靶向治療等手段下，仍為當(dāng)前危害女性健康的頭號殺手。按照2007年發(fā)表于柳葉刀腫瘤學(xué)雜志分型法[3]，將乳腺癌分 為 LuminalA、LuminalB、HER-2positive 和Basal-like 4種亞型。曲妥珠單抗為第一個靶向治療HER-2（人類表皮生長因子受體-2）的人源性單克隆抗體，具有調(diào)控細胞生長因子信號傳導(dǎo)途徑等作用成為乳腺癌靶向治療的基石，在HER-2陽性乳腺癌患者輔助治療中有著重要地位[4]。腫瘤免疫逃逸機制使得免疫治療已成為當(dāng)前研究重點，筆者應(yīng)用溫經(jīng)湯研究中醫(yī)“陰陽平衡”對HER-2陽性的乳腺癌患者機體免疫紊亂的調(diào)節(jié)作用，現(xiàn)報道如下。

1 臨床資料

選取本院2011年1月—2013年12月HER-2陽性乳腺癌手術(shù)后患者共65例，均為女性，分為治療組 33例，年齡 28～74歲，平均（43.5±16.5）歲，平均病程（6.4±3.7）年；對照組 32例，年齡 27～76歲，平均（42.3±17.3）歲，平均病程（5.9±3.1）年。兩組患者年齡及病程等一般資料方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性?；颊呔橥馇液炇鹬橥鈺?，經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準后實施。兩組患者診斷標準參考2011年版《中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范》[5]。中醫(yī)診斷標準參考《中醫(yī)病證診斷療效標準》[6]，符合下焦虛寒、陰陽失調(diào)證型。均為HER-2陽性 [標準免疫組化（IHC）+++，或原位熒光雜交法（FISH）陽性；免疫組化檢測顯示 HER-2（+++），可以直接判斷為HER-2陽性；FISH檢測，比值＞2.2則可判斷為HER-2陽性]，及左心室射血分數(shù)（LVEF）＞60%者。

2 方法

治療組予曲妥珠單抗聯(lián)合中藥“溫經(jīng)湯”治療，對照組給予曲妥珠單抗治療。曲妥珠單抗周療劑量為2mg/kg（首次劑量為4mg/kg），或3周1次劑量為6mg/kg（首次劑量為8mg/kg），共1年。“溫經(jīng)湯”組方：吳茱萸 9g（先煎 30min），桂枝 5g，川芎 6g，當(dāng)歸12g，白芍 9g，丹皮 12g，干姜 3g，麥冬 20g，清半夏10g（水洗），黨參 15g，生甘草 6g，東阿膠（烊化）、重樓各9g。1天1劑，加入700mL飲用水，浸泡30min，自動煎藥機煎煮，文火煎煮40min，液體包裝機灌裝每袋150mL，1天2袋，空腹或餐后1～2h口服?；颊呙恐苋∷?次。兩組其他綜合治療均一致，總治療周期均為48周。

觀察指標：檢測兩組患者治療前、治療后第24周、48周的血常規(guī)、腫瘤指標，外周血程序性死亡因子（PD-1）、程序性死亡因子配體-1（PD-L1），外周血IL-17，心臟彩超，常規(guī)B超；記錄每位患者治療前和治療后第24周、48周的中醫(yī)證候，以“八綱”為目，由副主任及以上中醫(yī)師辨別表里、寒熱、虛實；若左心室射血分數(shù)（LVEF）較治療前絕對數(shù)值下降≥16%或者LVEF＜正常范圍并且較治療前絕對數(shù)值下降≥10%，應(yīng)停止曲妥珠單抗治療；若4～8周內(nèi)LVEF回升至正常范圍或LVEF較治療前絕對數(shù)值下降≤15%，可恢復(fù)使用曲妥珠單抗。LVEF持續(xù)下降（＞8周），或者3次以上因心肌病而停止曲妥珠單抗治療，應(yīng)永久停止使用曲妥珠單抗。常規(guī)B超提示有遠處轉(zhuǎn)移證據(jù)，則按2011年指南相應(yīng)措施規(guī)范化治療。

血常規(guī)檢測采用全自動生化分析儀及配套試劑（編號E1003）；IL-17檢測：取清晨空腹外周靜脈血5ml，EDTA 抗凝，離心機 4000r/min，離心 5min，分離血漿后，置于零下20℃冰箱凍存，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），嚴格按照試劑盒說明書操作。PD-1/PD-L1表達水平檢測：取3支專用流式管，分別加入抗人CD4-FITC抗體10μL和MouseIgG1-PE同型質(zhì)控2.5μL、抗人CD4-FITC抗體10μL和抗PD-1-PE抗體2.5μL、抗人CD-FITC抗體10μL和抗人B7-H1-PE抗體2.5μL，然后每管各加入全血50μL，混勻，避光15min后加入1mL溶血劑，室溫放置10min，1500r離心，5min棄上清，再分別加入1mL生理鹽水，混勻，1500r離心，5min棄上清，最后加入500mL生理鹽水重懸細胞，上流式細胞儀（美國BECKMANCOULTE公司）檢測。采用FS-SS參數(shù)分析基礎(chǔ)上，對全PBMC設(shè)門，設(shè)定CD4陽性細胞門，檢測CD4+T細胞上PD-L1/PD-1的表達水平，并扣除同型對照的非特異性本底值。

統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以（x±s）表示，組間計量資料比較采用t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

治療過程中治療組有3例LVEF第4周持續(xù)下降，對照組1例持續(xù)下降，1例鎖骨上淋巴結(jié)腫大而更改方案治療，最終兩組各30例入組數(shù)據(jù)分析。

3.1 兩組外周血PD-1表達水平比較 治療前兩組PD-1差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療后兩組PD-1均不同程度下降，治療48周后，治療組PD-1低于對照組，與治療前和對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表 1。

3.2 兩組外周血PD-L1表達水平比較 治療前兩組PD-L1差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療后兩組PD-L1均不同程度下降，治療48周后，治療組PDL1低于對照組，與治療前和對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表 2。

3.3 兩組WBC、RBC、PLT比較 治療前兩組患者白細胞計數(shù)（WBC）、紅細胞計數(shù)（RBC）、血小板計數(shù)（PLT）相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療后，治療組患者WBC計數(shù)與治療前相比有所升高，對照組反而稍有下降，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；兩組RBC和PLT比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表 3。

表2 兩組HER-2陽性乳腺癌患者血 PD-L1表達水平比較[例（%）]

表3 兩組HER-2陽性乳腺癌患者WBC、RBC、PLT比較（×109/L，x±s）

3.4 兩組外周血IL-17表達水平比較 治療前兩組IL-17差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療后兩組IL-17均不同程度下降，但對照組治療前后比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），治療組治療48周與治療前及對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表4 兩組HER-2陽性乳腺癌患者血IL-17表達水平比較（pg/mL，x±s）

3.5 兩組“八綱”條目比較 治療組治療前后“里虛寒”患者構(gòu)成比由36%下降到13.7%，對照組“里虛寒”構(gòu)成比由37%下降到26%，治療組療效更顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表 5。

3.6 兩組安全性指標比較 治療過程中，兩組均未見明顯不良反應(yīng)，與對照組治療后比較，兩組在心超、心電圖、B超、尿常規(guī)等方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表 6。

4 討論

根據(jù)乳腺癌發(fā)病的四診內(nèi)容，參考歷代醫(yī)家文獻，乳腺癌可以歸于“乳巖”、“乳石癰”、“石榴”、“乳栗”等病證，歷代醫(yī)家對乳巖的病因、病機、癥候及證治具有獨到的見解?！峨y經(jīng)》曰：“積者，陰氣也，其始發(fā)有常處，其痛不離其部，上下有所終始，左右有所窮處。”《黃帝內(nèi)經(jīng)》曰：“任脈為病，女子帶下癓瘕?！盵7]任脈在女子諸病尤其是積病上至關(guān)重要。《金匱要略·婦人雜病脈證并治》言：“婦人年五十，暮即發(fā)熱，少腹急，腹?jié)M，手掌煩熱，唇口干燥，何也？師曰：此病屬帶下，瘀血在少腹不去，當(dāng)以溫經(jīng)湯主之?！盵8]溫經(jīng)湯亦主婦人少腹寒，久不受胎；兼取崩中去血，或月水來過多，及至期不來。該方是一張調(diào)任脈的祖方，堪稱女科第一方，此“帶下”之病機乃屬地道不通，厥陰虛寒，水不生木，任脈失交與陽明土和厥陰木，故主任脈也。“溫經(jīng)湯”方意可理解為合“吳茱萸湯”、“桂枝湯”、“膠姜湯”、“麥門冬湯”、“桂枝茯苓丸”而成一方。“桂枝湯”為群方之冠，外調(diào)營衛(wèi)氣血，內(nèi)調(diào)七情之雜病，桂枝湯為升厥陰肝木的第一要法。肝藏血，血得溫乃升，桂枝性溫，白芍濡養(yǎng)肝木，當(dāng)歸助肝藏血。地道不通，水生木，腎水竭，補天道生水，故真水只能由脾胃生化而來，因此用了吳茱萸湯和麥門冬湯，這便是“一氣周流”。厥陰肝木不能升達，少陽相火不降，則陽明不能降，是故手掌心熱，所以用半夏，麥冬來降陽明土。相火下耗腎水，上則口干口苦，發(fā)枯經(jīng)閉，精血橫溢，月經(jīng)淋漓不盡，不得有子，少腹急，厥陰肝木不能達，小腹?jié)M，脾氣不能升達。女子以血為主，任脈、厥陰肝都是以血濡養(yǎng)的經(jīng)脈，陽明經(jīng)亦是多血多氣之經(jīng)，而任脈下系肝腎上系陽明，三經(jīng)皆布散于口唇，因此嘴唇干癟干燥，是女子血虧的第一表現(xiàn)。正如《內(nèi)經(jīng)》言：“二八女子，唇紅齒白?！睔庋溆且病亟?jīng)湯，溫的是任脈的經(jīng)血，故溫經(jīng)湯有培補先天以滋后天，凱旋升降，交通左右之功?！秲?nèi)經(jīng)》認為陰陽乃浮沉生死之門，左右為其道路，水火為其征兆，故調(diào)陰陽之法門在于其“左右、浮沉、水火”六字，這也是溫經(jīng)湯調(diào)和女子陰陽第一主方之原由，正所謂，陰平陽秘，精神乃治。

表5 兩組HER-2陽性乳腺癌患者“八綱”條目比較[例（%）]

表6 兩組HER-2陽性乳腺癌患者一般安全性指標比較（例）

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為，HER-2受體是人類表皮生長因子受體EGFR家族的第2個成員，由位于17號染色體q21上，編碼分子質(zhì)量185k的跨膜蛋白表達，有抑制腫瘤細胞凋亡和促進腫瘤細胞生長等作用，因此對于HER-2陽性的乳腺癌患者，機體免疫功能紊亂更為復(fù)雜。HER-2陽性的乳腺癌患者通過體內(nèi)HER1/HER3/HER4與相應(yīng)配體結(jié)合后，與HER-2形成異二聚體，磷酸化膜內(nèi)酪氨酸激酶，生長因子受體結(jié)合蛋白及其相關(guān)銜接蛋白通過SH2結(jié)構(gòu)域連接到HER2的C端激活蛋白SOS，促進Ras釋放GDP進而使MEK磷酸化，最終激活MAPK[9]，參與腫瘤的生長、分化、炎癥、凋亡等機制。曲妥珠單抗是靶向HER-2 的抗體，臨床研究[10]顯示，譬如 NCCTG、N9831、HERA、BCIRG006、I-SPY2等均可以明顯提高HER-2陽性的乳腺癌患者無病生存期（DFS）和總生存（OS）。HER-2陽性的乳腺癌患者與機體細胞免疫功能低下密切相關(guān)，乳腺癌微環(huán)境中免疫細胞及細胞因子可有效促進和抑制腫瘤的生長，以T淋巴細胞為主，取決于抗原呈遞細胞（antigen-presenting cell，APC）和T細胞之間3類分子信號的綜合作用。其中輔助性細胞T（Th）是參與機體免疫應(yīng)答的一類重要的免疫調(diào)節(jié)細胞，而輔助性T細胞17（Thl7）和調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）在炎癥及免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮了重要的作用[11]。Th17細胞通過其特異性產(chǎn)生的效應(yīng)因子IL-17發(fā)揮致炎作用；IL-17頻率增加，抑制活性升高，減弱特異性T淋巴細胞反應(yīng)，導(dǎo)致腫瘤細胞生長[12-13]。

程序性死亡因子-1是近年來發(fā)現(xiàn)的一類能夠顯著抑制T細胞活化和調(diào)節(jié)T細胞免疫應(yīng)答的CD28/B7家族成員。PD-1分子主要在活化的T細胞上表達，PD-1受體可通過與APC表面的配體PD-L1結(jié)合而發(fā)揮抑制T細胞反應(yīng)的作用。PD-1可通過與配體PD-L1結(jié)合可通過阻斷CD28，激活介導(dǎo)的PI3K途徑而抑制T細胞的增殖和分化[14]。在有效激活T細胞的信號途徑中，負向的協(xié)同共刺激分子PD-1及其配體PD-L1的信號途徑是最新認為與腫瘤疫苗、雙特異性抗體、檢查點抑制劑及共刺激分子激動劑等腫瘤免疫治療方面很有治療前景的靶點[15-16]。本研究通過中醫(yī)調(diào)節(jié)整體“陰陽”平衡觀察HER-2陽性的乳腺癌術(shù)后患者免疫紊亂情況。治療48周后，治療組“里虛寒”構(gòu)成比較治療前下降，且與對照組相比有明顯差異，顯示“溫經(jīng)湯”可以通過“溫里、暖肝、運氣、活血”來調(diào)節(jié)人整體的陰陽狀態(tài)，使偏頗的“表里寒熱虛實”趨向平和，達到增強正氣、運行氣血、通調(diào)任脈的作用，即“正氣存內(nèi)，邪不可干”之意。治療48周后，治療組外周血PD-1、PD-L1頻數(shù)均低于對照組同期水平，與基線相比也明顯下降。相關(guān)研究[17]發(fā)現(xiàn)，三陰型乳腺癌中PD-1在HER-2陽性腫瘤表達較高，也有報道[18]稱PD-1表達與HER-2的表達呈正相關(guān)，與ER表達呈負相關(guān)，與PR表達無關(guān)，在不同的乳腺癌亞型中無明顯差異；而治療組IL-17頻數(shù)較對照組明顯升高，白細胞也較對照組數(shù)目增多，機體整體的免疫功能增強。結(jié)果顯示“溫經(jīng)湯”治療對患者已紊亂的免疫內(nèi)環(huán)境有趨向再建平衡作用，可能是通過調(diào)節(jié)IL-17和PD-1/PD-L1的分泌改善機體免疫功能，或可為乳腺癌綜合防治及免疫治療瓶頸提供較有前景的靶點和方向。

［1］李榮國，趙悅，馬曉.乳腺癌免疫治療的研究進展［J］.中國普通外科雜志，2013，22（11）：1484-1489.

［2］ Torre LA，Bray F，Siegel RL，et al.Global cancer statistics，2012［J］.CA Cancer J Clin，2015，65（2）：87-108.

［3］Cleator S，Heller W，Coombes RC.Triple-negative breast cancer：HERapeutic options［J］.Lancet Oncol，2007，8（6）：235-244.

［4］ Slamon DJ，Leyland-Jones B，Shak S，et al.Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for metastatic breast cancer that overexpresses HER2［J］.N Eng J Med，2011，344（11）：783-791.

［5］中國抗癌協(xié)會乳腺癌專業(yè)委員會，中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范（2011版）［J］.中國癌癥雜志，2011，21（5）：367-405.

［6］國家中醫(yī)藥管理局.中醫(yī)病證診斷療效標準［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2012：131-132.

［7］王國辰，王慧等，會編.黃帝內(nèi)經(jīng)［M］.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2009：180-195.

［8］范永升，姜德友.金匱要略［M］.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2012：310.

［9］Arteaga CL，Sliwkowski MX，Osborne CK，et al.Treatment of HER2-positive breast cancer:current status and future perspectives［J］.Nat Rev Clin Oncol，2011，9（5）：16-32.

［10］ T-DM1 Combo graduates from I-SPY2［J］.Cancer Discov，2016，6（6）：OF5.

［11］Weaver CT，Harrington LE，Mangan PR，et al.Th17：an effector CD4 Tcell lineage with regulatory T cell ties［J］.Immunity，2006，24（6）：677-688.

［12］ Gaffen SL.Structure and signaling in the IL-17 receptor family［J］.Nat Rev immunol，2009，9（8）：556-566.

［13］Wang L，Yi T，Korty lewski M，et al.IL-17 can promote tumor growth through an IL-6statsis gnaling pathway［J］.J Exp Med，2009，206（7）：1455-1457.

［14］ Maier H，Isogawa M，F(xiàn)reeman GJ，et al.PD-1：PD-L1 interactions contribute to the functional suppression of virus-specific CD8+T lymphocytes in the liver［J］.J Immunol，2007，178（5）：2716-2719.

［15］Xing Wu Zhu，Lori A Mulcahy.IL-17expression by breastcancer associated macrophages:IL-17 promotes invasiveness of breast cancer cell lines［J］.Breast cancet Res，2008，10（6）：94-98.

［16］ HERbst RS，Soria JC，Kowanetz M，et al.Predictive correlates of response to the anti-PD-L1 antibody MPDL3280A in cancer patiennts［J］.Nature，2014，515（7528）：563-567.

［17］CiminiMathews A，Thompson E，Taube JM，et al.PD-1 expression and the immune tumor micro environ men tinprimary and emtastatic breast carcinomas［J］.Human Pathol，2016，47（1）：52-63.

［18］Muenst S，Schaerli AR，Gao F，et al.Expression of programmed death ligand1 is associated with poor prognosisin human breast cancer［J］.Breast cancer Res，2014，146（1）：15-22.