（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

枸杞（Lycium barbarum L.）屬茄科枸杞屬的木本植物，又名貢血杞子、枸杞豆，為名貴的中藥材和高級滋補藥品。我國枸杞資源豐富，主要分布在寧夏、新疆、內(nèi)蒙古、河北等省區(qū)，全國年總產(chǎn)量接近1億萬噸[1]。枸杞味甘、性平，富含蛋白質(zhì)、脂肪、多糖、胡蘿卜素、維生素B1、維生素B2、多種氨基酸，具有補腎益精、養(yǎng)肝明目、潤肝止咳等功效，有降低膽固醇，減輕動脈硬化，降低血糖等作用[2]。近年來，隨著人們對養(yǎng)生保健的重視，枸杞作為我國藥食同源的一種寶貴資源深受人們喜愛，其產(chǎn)品的開發(fā)已經(jīng)成為食品加工業(yè)研究的熱點。

酵素也稱“酶”，由蛋白質(zhì)構(gòu)成，是一種生物催化劑。酵素是水果或蔬菜在多種有益菌的自然條件下發(fā)酵產(chǎn)生，含有豐富的纖維素、酶、礦物質(zhì)和次生代謝產(chǎn)物等營養(yǎng)成分，具有抗衰、抗菌消炎、凈化血液、增強機體免疫力等多種保健功能[3]。酵素幾乎參與所有的身體活動，在它的參與下人體維持正常的新陳代謝、自身免疫、修復(fù)組織等生理功能，被稱之為“活著的物質(zhì)”、“掌握所有生命活動物質(zhì)”。隨著年齡增長，體內(nèi)酵素相對減少，適當(dāng)補充酵素可維持良好的身體狀態(tài)。

本文以枸杞為主要材料，對枸杞酵素發(fā)酵過程中的發(fā)酵特性和風(fēng)味物質(zhì)進行了分析，研究了枸杞在自然發(fā)酵后總酚含量、羥自由基、還原力、DPPH自由基和超氧陰離子自由基清除能力的變化情況，為枸杞產(chǎn)品的綜合開發(fā)提供參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

寧夏農(nóng)林科學(xué)院枸杞研究所提供的寧杞1號干果[4]。氫氧化鈉、葡萄糖、3，5—二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、結(jié)晶酚、亞硫酸鈉、碘、碘化鉀、酚酞、乙醇、氯化氫、沒食子酸、福林酚試劑、碳酸鈉、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫、Tris、鄰苯三酚、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、DPPH均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

JJ300電子天平：美國雙杰（兄弟）集團有限公司；TCL-16M高速臺式冷凍離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；JYL-C010榨汁機：青島九陽世家電器有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；MP522型精密pH/電導(dǎo)率測量儀：上海三信儀表廠；PAL-1糖度計：日本愛拓公司；GCMS-QP2010 Ultral氣質(zhì)聯(lián)用儀：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞酵素的制備[5]

寧杞1號干果與水1∶5（g/mL）混合加入到無菌玻璃瓶中，密封常溫下發(fā)酵，以上步驟均在無菌操作臺中進行。發(fā)酵開始后，每5天為一階段取樣，樣品8 000 r/min冷凍高速離心10 min后進行各項指標(biāo)測定。

1.3.2 枸杞酵素pH值的測定

pH值利用pH計測得。

1.3.3 枸杞酵素可滴定酸的測定、

可滴定酸按照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》測得。

1.3.4 枸杞酵素可溶性固形物含量的測定

固形物含量利用糖度計測得。

1.3.5 枸杞酵素還原糖與總糖含量的測定

還原糖與總糖含量采用3，5-二硝基水楊酸法測得。

1.3.6 枸杞酵素揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定[6]

取5 mL樣品于萃取瓶中，60℃水浴恒溫加熱，吸附萃取40 min，進樣口解吸15 min。

Rtx-5MS30.0 m×250 μm×0.25 μm 毛細血管；程序升溫：初始溫度40℃，保持3 min，以4℃/min升至150℃，保持1 min，再以8℃/min升至250℃，保持6min。進樣口溫度250℃，進樣方式：分流，分流比：10 ∶1，載氣為 He，純度 99.99%。電離方式：EI，離子源溫度200℃，傳輸線溫度220℃；掃描方式：全掃描，掃描范圍 30～550（m/z），溶劑延遲時間 1.5 min。

檢測結(jié)果載NIST譜庫檢索，將匹配度大于80%的化合物作為暫定結(jié)果，并查閱資料進行結(jié)果比對，以確定最終檢測結(jié)果。

1.3.7 枸杞酵素總酚含量的測定[7]

取樣品0.5 mL，補蒸餾水至6 mL，加入福林酚試劑0.5 mL，搖勻靜置反應(yīng)3 min，添加20%的碳酸鈉溶液1.5 mL，充分混合后定容，30℃避光放置30 min后，在760 nm處測定吸光度，以蒸餾水為空白對照。枸杞酵素中總酚含量以沒食子酸等價物來表述，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程y=1.756 1x+0.121 2（R2=0.989 65）來計算酵素中總酚含量，其中y代表吸光度值；x代表樣品濃度。

1.3.8 枸杞酵素羥基自由基清除能力測定

采用水楊酸比色法[8]。準(zhǔn)確移取100、200、400、600、800、1 000、1 200、1 400、1 600、1 800 μL 待測樣液于10 mL試管中，用蒸餾水稀釋至2 mL。依次加入9 mmol/L硫酸亞鐵1 mL、9 mmol/L乙醇-水楊酸1 mL，混合均勻后，加入8.8 mmol/L雙氧水溶液啟動反應(yīng)，37℃水浴加熱30 min，510 nm下測定樣液的吸光度值。

式中：A0為空白對照液的吸光度；A1為樣品測定管的吸光度；A2為樣品本底管的吸光度。

1.3.9 枸杞酵素超氧自由基清除能力測定

采用鄰苯三酚自氧化法[9]。準(zhǔn)確移取100、200、400、600、800、1 000、1 200、1 400、1 600、1 800 μL待測樣液于10mL試管中，用去離子水稀釋至4.2mL。加入0.05 mol/LpH7.4Tris-HCl緩沖液4.5 mL，混合均勻后，25℃水浴加熱20 min。取出樣品，迅速加入去離子水0.3mL和60mmol/L鄰苯三酚溶液0.3mL，混合均勻后反應(yīng)5 min，在325 nm處測定吸光度，計算清除率。

式中：A0為鄰苯三酚自氧化的吸光度；A1為加入樣液后鄰苯三酚自氧化的吸光度。

1.3.10 枸杞酵素還原力測定

采用鐵氰化鉀法[10]測定還原力。準(zhǔn)確移取10、20、40、60、80、100、120、140、160、180 μL 待測樣液于10 mL試管中，用去離子水稀釋至1 mL。加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH6.6）1 mL和1%的鐵氰化鉀溶液1 mL，置于50℃水浴中反應(yīng)20 min后加入10%三氯乙酸溶液1mL，混合物在4000r/min條件下離心10min。吸取上清液2mL，加入2mL蒸餾水和0.1%三氯化鐵溶液400μL，在700nm處測其吸光度值，反應(yīng)物的吸光度值越大表明還原力越強。

1.3.11 枸杞酵素DPPH自由基清除能力測定

準(zhǔn)確稱取20mgDPPH，用無水乙醇定容于250mL容量瓶中，得到濃度為20 mmol/L的DPPH溶液。移取 10、20、40、60、80、100、120、140、160、180 μL 待測樣液于試管中，用去離子水稀釋至2 mL。將稀釋后的樣液與2 mLDPPH溶液混合后反應(yīng)30 min，待測波長517 nm吸光度的變化，對照溶劑用無水乙醇代替。

式中：A1為2 mLDPPH溶液與2 mL提取液的吸光度；A2為2 mL提取液與2 mL無水乙醇的吸光度；A3為2mLDPPH溶液與2mL無水乙醇的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞發(fā)酵過程中的理化指標(biāo)測定

2.1.1 發(fā)酵過程中pH值的變化

pH值表示樣品中呈離子狀態(tài)的氫離子的濃度，pH值的變化可以反應(yīng)發(fā)酵過程是否正常見圖1。從圖1可以看出，在0～20 d，發(fā)酵液pH值隨著發(fā)酵時間的延長而逐漸降低，pH值從4.98降到3.63。到25 d稍有回升，之后趨于平穩(wěn)。由于枸杞本身具有檸檬酸等酸性物質(zhì)，枸杞液初始pH值為酸性。酵液中的微生物利用自身代謝使枸杞中的碳水化合物成有機酸、二氧化碳等物質(zhì)，使得酵液pH值降低[11]。隨著發(fā)酵進入緩慢發(fā)酵階段，酵液中微生物對枸杞蛋白的降解利用，使得pH值稍有回升。

圖1 發(fā)酵過程中pH的變化Fig.1 Changes of pH during fermentation

2.1.2 發(fā)酵過程中可滴定酸的變化

酸度是衡量枸杞發(fā)酵成熟度的主要指標(biāo)，同時也是反應(yīng)枸杞發(fā)酵液品質(zhì)的重要理化指標(biāo)見圖2。從圖2可以看出，在發(fā)酵前期微生物通氣發(fā)酵階段，代謝生成的二氧化碳和有機酸使得可滴定酸逐步升高。在發(fā)酵20 d后，發(fā)酵液的可滴定酸快速升高，由于在溶氧不足的情況下，微生物將酒精轉(zhuǎn)化為乙酸，己糖轉(zhuǎn)化為乳酸等有機酸[12]。這些有機酸既提高了枸杞發(fā)酵液的營養(yǎng)物質(zhì)，又形成了枸杞發(fā)酵液獨特的風(fēng)味，還具有一定的抑菌效果，對枸杞發(fā)酵液的生產(chǎn)具有重要影響。

圖2 發(fā)酵過程中可滴定酸的變化Fig.2 The change of titratable acid during fermentation

2.1.3 發(fā)酵過程中可溶性固形物的變化

碳水化合物是微生物生長的重要營養(yǎng)因子見圖3。由圖3可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，可溶性固形物含量呈現(xiàn)不斷下降的趨勢。由于發(fā)酵液營養(yǎng)充分，環(huán)境適宜，微生物快速繁殖，不斷消耗碳水化合物，使得發(fā)酵液中可溶性固形物逐漸減少[13]。

圖3 發(fā)酵過程中可溶性固形物的變化Fig.3 the change of soluble solids in the fermentation process

2.1.4 發(fā)酵過程中糖含量的變化

糖是微生物發(fā)酵重要的碳源，發(fā)酵過程中糖含量的變化見圖4。如圖4所示，在發(fā)酵0～5 d內(nèi)，還原糖呈上升趨勢，隨后緩慢下降，在發(fā)酵35 d后趨于穩(wěn)定，而總糖在發(fā)酵過程中逐漸減少，在10 d～15 d下降最快，在35 d后趨于平穩(wěn)。從圖4中分析，發(fā)酵初期優(yōu)勢菌種在轉(zhuǎn)化酶作用下將糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖、果糖，發(fā)酵液中的還原糖增加。到發(fā)酵中期其中一部分微生物將糖轉(zhuǎn)化為有機酸，還原糖逐漸減少。從圖中可以看出，總糖含量始終高于還原糖，說明在枸杞液中含有非還原性的多糖[14]。發(fā)酵35 d后，總糖和還原糖均處于最低水平，說明發(fā)酵已經(jīng)結(jié)束。

圖4 發(fā)酵過程中糖含量的變化Fig.4 Changes in sugar content during fermentation

2.2 發(fā)酵前后枸杞液風(fēng)味物質(zhì)的測定

未發(fā)酵枸杞液GC-MS總離子流色譜見圖5，枸杞酵素GC-MS總離子流色譜見圖6，未發(fā)酵枸杞的揮發(fā)性

成分的GC-MS分析結(jié)果見表1，枸杞酵素的揮發(fā)性成分的GC-MS分析結(jié)果見表2。

圖5 未發(fā)酵枸杞液GC-MS總離子流色譜Fig.5 GC-MS total flow chromatography of non fermented Lycium barbarum L.liquid

圖6 枸杞酵素GC-MS總離子流色譜Fig.6 Total GC-MS ion chromatography of Lycium barbarum L.

表1 未發(fā)酵枸杞的揮發(fā)性成分的GC-MS分析結(jié)果Table 1 GC-MS analysis results of volatile components in non fermented Lycium barbarum L.

表2 枸杞酵素的揮發(fā)性成分的GC-MS分析結(jié)果Table 2 GC-MS analysis results of volatile components in Lycium barbarum L.enzyme

續(xù)表2 枸杞酵素的揮發(fā)性成分的GC-MS分析結(jié)果Continue table 2 GC-MS analysis results of volatile components in Lycium barbarum L.enzyme

續(xù)表2 枸杞酵素的揮發(fā)性成分的GC-MS分析結(jié)果Continue table 2 GC-MS analysis results of volatile componentsin Lycium barbarum L.enzyme

香氣成分是構(gòu)成發(fā)酵產(chǎn)品風(fēng)味的主要指標(biāo)，是多種揮發(fā)性物質(zhì)共同作用的結(jié)果。采用固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用的技術(shù)分析研究枸杞發(fā)酵前后的風(fēng)味物質(zhì)。從表1可以看出，未發(fā)酵枸杞液中共檢測出32種成分，1種酯類、12種醛類、8種酮類、11種醇類。未發(fā)酵的枸杞液醇類、醛類物質(zhì)含量高，對未發(fā)酵枸杞液的風(fēng)味貢獻大。如壬醛具有強烈的油脂氣味和甜橙氣息，己醛具有天然的水果香氣及青草、油脂氣味。1-戊烯-3-醇、己醇、1-辛醇、1-壬醇、3-甲基-1-丁醇賦予枸杞一種令人愉快的氣味，如1-戊烯-3-醇是存在于橙子、草莓、番茄等水果中的一種果香。酮類使枸杞液表現(xiàn)出獨特的風(fēng)味，如2，3-丁二酮具有濃郁的奶油味。

由表2可以看出，天然發(fā)酵后得到的枸杞酵素利用GC-MS分離鑒定出64種化合物，主要的揮發(fā)物質(zhì)包括20種酯類、9種醛類、6種酮類、23種醇類、3種酸類、3種芳香雜環(huán)類。

共檢測出的酯類物質(zhì)含量達25.25%。酯類物質(zhì)具有成熟果香味或堅果味，對酵素的整體風(fēng)味具有促進作用。如乙酸乙酯賦予花香和果香味，正癸酸乙酯具有椰子香型香氣，月桂酸乙酯是良好的食用香精香料添加劑。

共檢測出的醛類物質(zhì)含量達9.9%。醛類是枸杞酵素的主要風(fēng)味成分，賦予酵素獨特的花香、果香味。如苯乙醛能夠賦予發(fā)酵飲料甜香和果味，壬醛具有強烈的油脂氣味和甜橙氣息。3-甲基丁醛具有蘋果香味，苯甲醛具有特殊的杏仁氣味，都是食用香料。

共檢測出的酮類物質(zhì)含量達3.18%。酮類物質(zhì)經(jīng)過不飽和脂肪酸或氨基酸氧化、降解或是在發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)生，賦予酵素獨特的風(fēng)味。如3-羥基-2-丁酮具有濃郁的奶油味，3-辛烯-2-酮具有植物芳香的氣味。

共檢測出的醇類物質(zhì)含量達25.83%。乙醇是枸杞天然發(fā)酵的主要風(fēng)味物質(zhì)之一，正己醇具有果子香氣，1-辛烯-3-醇具有蘑菇、薰衣草、玫瑰和甘草香氣，苯乙醇具有清甜的玫瑰樣花香。

共檢測出的酸類物質(zhì)含量達26.38%。4-甲基-2-氧代戊酸是枸杞天然發(fā)酵的主要風(fēng)味之一，賦予香甜的口感，是一種重要的食用香料。

共檢測出的雜環(huán)類物質(zhì)含量達7.74%。呋喃類化合物主要是糖與氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)，具有水果香、焦糖香、烤香味，是發(fā)酵產(chǎn)品的重要風(fēng)味物質(zhì)。2-乙?；秽市尤?、堅果、酵香、牛奶和甜的焦糖似香氣，2-正戊基呋喃呈豆香、果香、類似蔬菜的香氣，4-乙基苯酚呈強烈木-酚氣息，有輕微香甜香氣。

其余成分是烷烴類物質(zhì)，相對含量較少。烷烴類的香氣較弱，對酵素風(fēng)味貢獻不大。

2.3 枸杞酵素抗氧化性測定

2.3.1 發(fā)酵前后的枸杞液總酚含量的測定結(jié)果

枸杞中的酚類物質(zhì)是一類重要的抗氧化物質(zhì)，按照上述方法測定，對發(fā)酵前后枸杞液的總酚含量進行了測定見圖7。如圖7所示，未發(fā)酵枸杞液的總酚含量為（1.738±0.035）mg/mL，發(fā)酵后枸杞酵素的總酚含量為（1.926±0.042）mg/mL，發(fā)酵后總酚含量明顯增加。枸杞自然發(fā)酵后，微生物快速繁殖，酚類物質(zhì)隨著碳源氮源的消耗而釋放出，枸杞中復(fù)雜的大分子酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成小分子酚類物質(zhì)，使得總酚含量增加[15]。

圖7 發(fā)酵前后的枸杞液總酚含量的測定結(jié)果Fig.7 Determination of total phenolic content in Lycium barbarum L.liquid before and after fermentation

2.3.2 發(fā)酵前后的枸杞液羥基自由基清除能力測定結(jié)果

發(fā)酵前后的枸杞液羥基自由基清除能力測定結(jié)果見圖8。

圖8 發(fā)酵前后的枸杞液羥基自由基清除能力測定結(jié)果Fig.8 Determination results of hydroxyl radical scavenging ability of Lycium barbarum L.liquid before and after fermentation

從圖 8可知，樣液體積在 100 μL～800 μL 內(nèi)，發(fā)酵前后的枸杞液對羥基自由基清除能力隨樣液濃度增加而增強。樣液體積為1 000 μL時，枸杞酵素對羥基自由基的清除率為（91.12±0.78）%，未發(fā)酵枸杞液為（81.87±3.35）%。枸杞酵素對羥基自由基的清除能力明顯提高。之后隨濃度的增加，未發(fā)酵枸杞液和枸杞酵素對羥基自由基清除能力無明顯提升。分析原因可能是微生物在發(fā)酵過程中產(chǎn)生了一些例如SOD等抗氧化酶類，清除活性氧，使得發(fā)酵后的枸杞液的抗氧化能力提高[16]。

2.3.3 發(fā)酵前后的枸杞液超氧自由基清除能力測

發(fā)酵前后的枸杞液超氧自由基清除能力測見圖9。

圖9 發(fā)酵前后的枸杞液超氧陰離子自由基清除能力測定結(jié)果Fig.9 Determination results of superoxide anion radical scavenging ability of Lycium barbarum L.liquid before and after fermentation

從圖9可以得出，發(fā)酵前后的枸杞液對超氧陰離子自由基有一定的清除能力，隨樣液濃度的增加而增強。樣液體積為180 μL時，枸杞酵素對超氧自由基清除率為（89.95±3.32）%，未發(fā)酵枸杞液為（39.57±2.77）%。結(jié)果表明未發(fā)酵枸杞液與枸杞酵素的超氧自由基清除率隨濃度的增加而增加，枸杞酵素的抗氧化能力明顯提高。枸杞酵素之所以能夠清除超氧陰離子自由基主要因為多酚類物質(zhì)分子中含有大量的酚羥基，能提供活潑的氫，從而終止自由基連鎖反應(yīng)，起到抗氧化的作用。

2.3.4 發(fā)酵前后的枸杞液還原力測定結(jié)果

發(fā)酵前后的枸杞液還原力測定結(jié)果見圖10。

圖10 發(fā)酵前后的枸杞液還原力測定結(jié)果Fig.10 Results of force determination of Lycium barbarum L.before and after fermentation

從圖 10 可知，樣液體積在 100 μL～1 200 μL內(nèi)，未發(fā)酵枸杞液與枸杞酵素的還原力隨樣液的濃度增加而增強。樣液體積為1 400 μL時，枸杞酵素在700 nm處的吸光度為1.425±0.089，未發(fā)酵枸杞液為1.164±0.101。枸杞酵素的還原力顯著提高。之后隨著樣液濃度的增加，還原力均無明顯提高[17]。

2.3.5 發(fā)酵前后的枸杞發(fā)酵液DPPH自由基清除能力測定結(jié)果

發(fā)酵前后的枸杞發(fā)酵液DPPH自由基清除能力測定結(jié)果見圖11。

圖11 發(fā)酵前后的枸杞液DPPH自由基清除能力測定結(jié)果Fig.11 Determination results of DPPH free radical scavenging ability of Lycium barbarum L.liquid before and after fermentation

DPPH自由基是一種以氮源子為中心能穩(wěn)定存在的自由基，通過檢測樣品對DPPH自由基的清除能力表示其抗氧化性的強弱。從圖11可知，DPPH自由基清除能力隨著樣液濃度的增加而提高。未發(fā)酵枸杞液的DPPH自由基清除率達到64.31%±1.65%，枸杞酵素的DPPH自由基清除率為92.34%±1.84%，枸杞酵素的DPPH清除能力提高較多，清除率提高了28.03%。枸杞發(fā)酵過程中逐漸釋放出酚類物質(zhì)，酚類物質(zhì)具有較強的抗氧化性，使得枸杞酵素抗氧化性增強[18]。

3 結(jié)論

本研究以枸杞為原料，經(jīng)過枸杞自身固有的多種有益菌自然條件下發(fā)酵45 d。檢測枸杞發(fā)酵過程中的pH值、可滴定酸、可溶性固形物、還原糖和總糖的含量，利用固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用的技術(shù)分析發(fā)酵前后風(fēng)味物質(zhì)成分，以及對枸杞酵素主要抗氧化物質(zhì)含量進行檢測。結(jié)果表明：pH值一直降低，最后保持在3.6～3.9之間；可滴定酸一直增加，發(fā)酵結(jié)束后達到8.14%；可溶性固形物不斷減少，最后保持8.0～8.5之間；總糖逐漸減少，還原糖先升后降，最后均低于0.5%。枸杞經(jīng)天然發(fā)酵后，風(fēng)味物質(zhì)發(fā)生明顯變化，在有益菌轉(zhuǎn)換下生成了20種酯類、9種醛類、6種酮類、23種醇類、3種酸類、3種芳香雜環(huán)類，賦予了酵素特殊的發(fā)酵香氣。枸杞酵素具有良好的抗氧化性，總酚含量、羥基自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力、還原力、DPPH自由基清除能力均明顯高于未發(fā)酵枸杞，且隨酵素濃度增加而增強。本研究可為枸杞發(fā)酵產(chǎn)品的研發(fā)提供一定的數(shù)據(jù)參考。為枸杞酵素的多功能開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

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