李曉樂，楊瑞麗，張玉瑩，豆榮，李武，*

（1.海南大學食品學院，海南海口570100；2.廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室/華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東廣州510642）

多酚（polyphenols）是一類具有多酚羥基的化合物，其廣泛地分布在水果、蔬菜和谷物中[1]，具有抗氧化、抗腫瘤、預防心腦血管疾病等活性作用[2-4]。天然存在的多酚以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種形式存在于食物基質(zhì)中，前者是水或極性溶劑可溶性酚類物質(zhì)，后者是溶劑不能直接萃取而以酯鍵、糖苷鍵等形式與糖類或蛋白質(zhì)等物質(zhì)結(jié)合的酚類物質(zhì)。目前對樣品多酚含量的評價，主要是采用溶劑直接萃取后進行定量分析，此類方法可以反映樣品中的游離酚含量，而不能對其中的結(jié)合酚進行分析[1]。最近的研究顯示，多酚對健康的促進作用不僅與其游離酚有關，而且與其結(jié)合酚的含量與組成也密切相關[5-6]。研究表明，食物中不能被小腸消化吸收的結(jié)合酚，通過與結(jié)腸微生物的作用釋放發(fā)揮生理活性作用[7-8]，結(jié)合態(tài)多酚逐漸成為多酚研究的熱點。

在日常飲食中，果蔬是人體攝入多酚的主要來源之一。研究顯示，由于日照和高溫等生長環(huán)境特點，熱帶水果含有相對較高的多酚類物質(zhì)。近年來，研究者對一些熱帶水果中的酚類物質(zhì)、抗氧化活性進行了研究。Septembre等[9]比較了法國6種熱帶水果的抗氧化活性，分析了其多酚提取物對紅細胞和脂肪細胞的保護作用。周曉敏等[10]分析了番石榴的酚類物質(zhì)組成，發(fā)現(xiàn)番石榴主要含有沒食子酸、兒茶素、槲皮素等酚類成分。但是對于熱帶水果游離酚和結(jié)合酚中單體酚的比較性分析還十分有限。本文對我國6種熱帶特色水果的游離酚、結(jié)合酚含量，單體酚組成以及其抗氧化活性進行了分析，旨在為我國熱帶水果的開發(fā)利用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

番石榴（Psidium guajava Linn.珍珠，廣東）、楊桃（Averrhoa carambola L.廣東）、芒果（Mangifera indica L.大金煌芒，海南）、荔枝（Litchi chinensis Sonn.桂味，廣東）、檸檬（Citrus limon（L.）Burm.f.廣東）、龍眼（Dimocarpus longan Lour.儲良，廣東）：海南省?？谑小?/p>

福林酚（Folin-cioaclteu）：國藥集團化學試劑有限公司；2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-Diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl)hydrazyl，DPPH）：上海麥克林生化科技有限公司；2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2，2'-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt，ABTS）：山東西亞化學工業(yè)有限公司；Trolox（水溶性維生素E）：東京化成工業(yè)株式會社；沒食子酸、槲皮素、蘆丁、原兒茶酸、對羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、高丁香酸、香草醛、對香豆酸、阿魏酸：成都瑞芬思生物科技有限公司（純度＞98%）；甲醇、乙腈（色譜純）：TEDIA 公司；其他試劑：廣州化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

FSH-2A可調(diào)高速均質(zhì)機：江蘇常州國旺儀器制造有限公司；IKA-RV8旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國IKA有限公司；723可見光分光光度計：上海奧譜勒有限公司；Agilent 1260高效液相色譜儀：安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 游離酚的提取

游離酚提取參照Wolfe等[11]的方法：挑選成熟度一致水果，自來水洗凈后用蒸餾水沖洗一遍。取水果可食用部分，25 g（3個平行）加入100 mL預冷的80%丙酮，均質(zhì)機均質(zhì)提取6 min（3.0 min×2停頓30 s），紗布過濾，果渣復提1次，合并濾液，45℃真空濃縮后用蒸餾水定容至25 mL，-80℃冰箱保存待測。

1.3.2 結(jié)合酚的提取

結(jié)合酚的提取采用NaOH消化法，參照Lin等[12]的方法。將1.3.1中提取殘渣用雙蒸水除去有機試劑，加入 4 mol/L NaOH（1 g∶15 mL），室溫磁力攪拌提取2.0 h后用4 mol/L鹽酸調(diào)整pH值至2.0。乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液，45℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用甲醇定容后儲存于-80℃冰箱待測。

1.3.3 多酚含量的測定

參照Wolfe等[11]的方法，取125 μL稀釋至一定濃度的提取物，加入0.5 mL去離子水和125 μL的Folin-Ciocalteu試劑，混勻后反應 6 min，再加入1.25 mL 7%Na2CO3溶液和1 mL蒸餾水，混勻，避光反應90 min后于760 nm測定其吸光值，空白使用125 μL溶劑代替提取物。結(jié)果以每100克新鮮果肉所含的沒食子酸當量表示（mg GAE/100 g FW）。

1.3.4 單體酚類物質(zhì)含量測定

單體酚色譜條件參照Subba等[13]方法并稍作修改，色譜柱型ZorbaxSB-C18（4.6mm×250mm，5.0μm）；流動相 A：0.4%冰醋酸，B：乙腈；流速 1.0 mL/min；柱溫30℃；檢測波長280 nm；梯度洗脫程序：0～40 min B 5%～35%；40 min～45 min ，B 35%～50%；45 min～50 min，B 50%～80%。進樣量5.0 μL。將不同濃度的混標按照上述色譜條件進行分析，根據(jù)樣品與標準品的保留時間定性，采用峰面積外標法進行定量。以峰面積為縱坐標，對照品濃度為橫坐標繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算樣品中目標物質(zhì)含量。

1.3.5 水果提取物抗氧化活性

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力

參照Ma等[14]的方法并略作修改，取0.2 mL稀釋到一定濃度的樣品，加入2 mL去離子和2 mL 0.2 mmol/L的DPPH自由基醇溶液，室溫避光反應30 min后于517 nm處測定吸光度，空白用蒸餾水代替。結(jié)果以每100克鮮重中Trolox當量（μmol TE/100 g FW）表示結(jié)果。

1.3.5.2 ABTS+自由基清除能力

采用張金宏[15]的方法。配制7.0 mmol/L ABTS儲備液，140 mmol/L K2S2O8溶液。取5 mL 7 mmol/L ABTS溶液與88 μL 140 mmol/L K2S2O8溶液于離心管中，混勻，室溫下避光反應12 h即為ABTS工作液（現(xiàn)配現(xiàn)用），將ABTS工作液在734 nm處的吸光度用無水乙醇調(diào)整到0.700±0.020后備用。取25 μL稀釋至一定濃度的樣品加入2 mL ABTS工作液，混勻后室溫避光反應6 min，于734 nm處測定吸光值。結(jié)果以每100克鮮重中Trolox當量（μmol TE/100 g FW）表示。

1.3.6 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標準差表示，實驗數(shù)據(jù)的顯著性檢驗運用DPS統(tǒng)計軟件的ANOVA（以p＜0.05為差異顯著）進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 游離酚與結(jié)合酚含量

游離酚與結(jié)合酚含量見圖1。

6種水果提取物中的游離酚如圖1（a）所示，不同的水果之間多酚的含量差異較大，變異系數(shù)為74.32%。其中游離酚含量由高到低依次為楊桃[（342.85±8.38）mgGAE/100 g FW]、番石榴[（282.69±1.41）mg GAE/100 g FW]、荔枝[（91.82±2.09）mg GAE/100 g FW]、檸檬[（88.00±1.67）mg GAE/100 g FW]、龍眼[（85.13±0.51）mg GAE/100 g FW]、芒果[（36.20±0.37）mg GAE/100 g FW]。其中楊桃的游離酚含量是芒果的9.47倍。

圖1 6種熱帶水果的游離酚和結(jié)合酚含量Fig.1 Free and bound phenolics content in six tropical fruits

6種水果結(jié)合酚[圖1（b）]由高到低依次為楊桃[（23.19±2.52）mg GAE/100 g FW]、番石榴[（16.42±1.19）mg GAE/100 g FW]、荔枝[（3.82±0.99）mg GAE/100 g FW]、龍眼[（1.16±0.29）mg GAE/100 g FW]、檸檬[（0.92±0.06）mg GAE/100 g FW]、芒果[（0.80±0.10）mg GAE/100 g FW]，楊桃與番石榴顯著高于其他 4 種水果（p＜0.05），荔枝、龍眼、檸檬、芒果結(jié)合酚含量無顯著差異（p＞0.05）。

本文楊桃游離酚的含量與李群梅等報道[16]的不同品種楊桃游離酚含量（285 mg GAE/100 g FW～672 mg GAE/100 g FW）相當，結(jié)合酚的含量略高于Pang等的報道[17]（6.4 mg GAE/100 g FW～19.7 mg GAE/100 g FW）。荔枝游離酚和結(jié)合酚的含量低于Su等的報道[18]。番石榴游離酚的含量高于李武等的報道[（192.46±6.17）mg GAE/100 g FW][19]。芒果和檸檬的游離酚含量略低于早期的報道[19-20]，目前未見芒果和檸檬結(jié)合酚含量的報道。早期的研究發(fā)現(xiàn)，水果的產(chǎn)地、品種對其多酚含量具有顯著的影響[20]。本文水果多酚的含量與文獻報道存在一定差異，可能與提取溶劑、水果的產(chǎn)地、品種等因素有關。

2.2 單體酚組成分析

6種熱帶水果游離酚的組成和含量如表1所示。結(jié)果顯示，番石榴主要含有鞣花酸、沒食子酸和苯甲酸；楊桃主要含有蘆丁、苯甲酸和鞣花酸，荔枝主要含有沒食子酸和蘆丁，龍眼主要含有沒食子酸和高香草酸，檸檬主要含有蘆丁、高香草酸、沒食子酸和香草酸。其中，楊桃的苯甲酸、鞣花酸和阿魏酸的含量顯著高于其他5種水果；龍眼的沒食子酸的含量顯著高于其他5種水果；檸檬的蘆丁、高香草酸和香草酸的含量相對較高。

表1 6種水果游離酚中主要單體酚組成與含量Table 1 Quantification of the individual free phenolics in six fruits mg/100 g FW

本文番石榴、楊桃和荔枝單體酚組成和含量的結(jié)果與其他研究者的報道相近[17-18,21-22]。對比前期的報道[21,23]，本文首次在龍眼中檢測到丁香酸；在芒果中檢測到對香豆酸和香草酸。

6種熱帶水果結(jié)合酚的組成和含量如表2所示。番石榴結(jié)合酚中主要含有蘆丁、鞣花酸、苯甲酸和香草酸，且均顯著高于其他5種水果（p＜0.05）。與游離酚相比，番石榴結(jié)合酚中的香草酸、對香豆酸、蘆丁的含量增加了3.47倍～8.00倍；楊桃結(jié)合酚中的原兒茶酸的含量增加了4.39倍，且顯著高于其他5種水果（p＜0.05）。與游離酚相比，在4種水果的結(jié)合酚中檢測到新的酚類組分，荔枝中檢測到槲皮素和苯甲酸；龍眼中檢測到苯甲酸；芒果中檢測到鞣花酸；檸檬中檢測到對香豆酸和鞣花酸。本文荔枝槲皮素含量的結(jié)果與Su等的報道[18]相一致，對其他5種水果結(jié)合酚的組成還鮮有報道。

表2 6種水果結(jié)合酚中主要單體酚組成與含量Table 2 Quantification of the individual bound phenolics in six fruits mg/100 g FW

2.3 抗氧化能力

6種水果游離酚與結(jié)合酚提取物的清除DPPH自由基清除能力見圖2。

圖2 6種水果游離酚與結(jié)合酚提取物的清除DPPH自由基清除能力Fig.2 DPPH radical scavenging activity of free and bound phenolic extracted from six fruits

如圖2（a）所示，6種水果游離酚提取物的DPPH自由基抗氧化值的變幅在261.07μmolTE/100gFW至3561.12μmolTE/100gFW之間，變異系數(shù)為104.81%。由高到低依次為楊桃（3 561.12±26.59）μmol TE/100 g FW、番石榴（3 471.72±25.17）μmol TE/100 g FW、荔枝（492.05±7.13）μmol TE/100 g FW、檸檬（375.07±11.03）μmol TE/100 g FW、龍眼（345.01±1.27）μmol TE/100 g FW、芒果（261.07± 2.72）μmol TE/100 g FW。其中，最高楊桃的DPPH自由基抗氧化值是芒果的13.64倍，檸檬與龍眼的抗氧化值無顯著性差異（p＞0.05）。

6種水果結(jié)合酚[如圖2（b）]提取物的DPPH自由基抗氧化值由高到低依次為楊桃（110.90±1.88）μmol TE/100 g FW、番石榴（61.08±2.46）μmol TE/100 g FW、荔枝（17.42±2.15）μmol TE/100 g FW、龍眼（6.34±1.14）μmolTE/100gFW、檸檬（4.59±1.22）μmol TE/100 g FW、芒果（4.59±0.24）μmol TE/100 g FW。其中，最高楊桃的DPPH自由基抗氧化值是最低芒果的24.16倍。

6種水果游離與結(jié)合酚提取物的清除ABTS+自由基能力見圖3。

圖3 6種水果游離與結(jié)合酚提取物的清除ABTS+自由基能力Fig.3 ABTS+radical scavenging activity of free and bound phenolics extracted from six fruits

如圖3（a）所示，6種水果游離酚提取物的ABTS+自由基抗氧化值抗氧化值的變幅在48.74 μmol TE/100 g FW至240.72 μmol TE/100 g FW之間，變異系數(shù)為64.96%。由高到低依次為楊桃（240.72±10.21）μmol TE/100 g FW、番石榴（217.39±1.57）μmol TE/100 g FW、荔枝（87.50±6.16）μmol TE/100 g FW、龍眼（80.29±2.12）μmol TE/100 g FW、芒果（48.91±6.28）μmol TE/100 g FW、檸檬（48.74±1.02）μmol TE/100 g FW。其中，荔枝與龍眼以及芒果與檸檬之間無顯著差異（p＞0.05）。

如圖3（b）所示，結(jié)合酚提取物的ABTS+自由基抗氧化值由高到低依次為楊桃（135.87±1.81）μmol TE/100 g FW、番石榴（93.87±6.68）μmol TE/100 g FW、荔枝（19.75±3.67）μmol TE/100 g FW、龍眼（5.66±1.48）μmol TE/100 g FW、芒果（4.83±0.12）μmol TE/100 g FW、檸檬（2.22±0.07）μmol TE/100 g FW。

比較兩種抗氧化測定方法的結(jié)果顯示，龍眼、芒果和檸檬抗氧化活性的相對強弱在不同測定方法中存在一定的差異，這一結(jié)果與趙謀明等的報道[21]相一致。多酚提取物的抗氧化活性在不同測定方法中呈現(xiàn)的差異性，可能與方法的測定原理以及樣品所含酚類物質(zhì)的組成不同有關[24-25]。

3 結(jié)論

6種水果的游離酚含量為36.20 mg GAE/100 g FW～342.85 mg GAE/100 g FW，結(jié)合酚的含量為0.80 mg GAE/100 g FW～23.19 mg GAE/100 g FW；楊桃游離酚主要含有蘆丁[（8.74±0.90）mg/100 g FW]、苯甲酸[（6.63±0.48）mg/100 g FW]、鞣花酸[（4.47±0.10）mg/100 g FW]，結(jié)合酚主要含有原兒茶酸[（3.07±0.50）mg/100 g FW]；番石榴游離酚主要含有鞣花酸[（1.57±0.30）mg/100 g FW]、沒食子酸[（1.53±0.42）mg/100gFW]、苯甲酸[（1.39±0.10）mg/100gFW]，結(jié)合酚主要含有鞣花酸[（1.69±0.14）mg/100 g FW]、苯甲酸[（1.44±0.10）mg/100 g FW]、香草酸[（1.44±0.13）mg/100 g FW]；荔枝游離酚主要含有沒食子酸[（5.18±0.04）mg/100gFW]、蘆丁[（3.09±0.72）mg/100gFW]，結(jié)合酚主要含有原兒茶酸[（0.39±0.15）mg/100gFW]；龍眼游離酚主要含有沒食子酸[（10.71±0.37）mg/100 g FW]、高香草酸[（2.04±0.01）mg/100 g FW]，結(jié)合酚主要含有鞣花酸[（0.44±0.03）mg/100 g FW]；檸檬游離酚主要含有蘆丁[（9.34±0.43）mg/100 g FW]、高香草酸[（6.65±0.35）mg/100g FW]、沒食子酸[（6.29±0.20）mg/100 g FW]；芒果游離酚主要含有沒食子酸[（3.23±0.63）mg/100 g FW]、苯甲酸[（1.45±0.47）mg/100 g FW]，結(jié)合酚主要含有鞣花酸[（0.16±0.01）mg/100gFW]。6種水果游離酚和結(jié)合酚的DPPH自由基清除能力分別為261.07 μmol TE/100 g FW～3561.12μmolTE/100gFW 和 4.59 μmolTE/100gFW～110.90μmolTE/100gFW；ABTS+自由基清除能力分別為 48.74 μmolTE/100gFW～240.72μmolTE/100gFW和2.22μmolTE/100gFW～135.87μmolTE/100gFW。

[1]顏才植,葉發(fā)銀,趙國華.食品中多酚形態(tài)的研究進展[J].食品科學,2015,36(15):249-354

[2]Cirillo G,Curcio M,Vittorio O.Polyphenol Conjugates and Human Health:A Perspective Review[J].Critical Reviews in Food Science and Nutrition,2016,56(2):326-337

[3]Burton-Freeman BM,Sandhu AK,Edirisinghe I.Red Raspberries an d Their Bioactive Polyphenols:Cardiometabolic and Neuronal Health Links[J].Advances in Nutrition,2016,7(1):44-65

[4]Mileo AM,Miccadei S.Polyphenols as Modulator of Oxidative Stress in Cancer Disease:New Therapeutic Strategies[J].Oxidative Medicine and Cellular Longevity,2016,2016(7):6475624-6475642

[5]Liyana-Pathirana CM,Shahidi F.Importance of Insoluble-bound Phenolics to Antioxidant Properties of Wheat[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2006,54(4):1256-1264

[6]Chandrasekara A,Shahidi F.Content of Insoluble Bound Phenolics in Millets and Their Contribution to Antioxidant Capacity[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2010,58(11):6706-6714

[7]Ozdal T,Sela DA,Xiao Jianbo.The Reciprocal Interactions Between Polyphenols and Gut Microbiota and Effects on Bioaccessibility[J].Nutrients,2016,8(2):1-36

[8]Williamson G,Clifford MN.Colonic Metabolites of Berry Polyphenols:the Missing Link to Biological Activity[J].British Journal of Nutrition,2010,104(3):S48-S66

[9]Septembre-Malaterre A,Stanislas G,Douraguia E,et al.Evaluation of nutritional and antioxidant properties of the tropical fruits banana,litchi,mango,papaya,passion fruit and pineapple cultivated in Réunion French Island[J].Food Chemistry,2016,212:225-233

[10]周曉敏,付麗,盧文青,等.三種熱帶水果多酚物質(zhì)的檢測及其體外抗菌活性測定[J].中國熱帶醫(yī)學,2017,17(1):36-40

[11]Wolfe K,Wu X,Liu R H.Antioxidant activity of apple peels[J].Journal of Agricultural&Food Chemistry,2003,51(3):609-614

[12]Lin X,Zhou L,Li T,et al.Phenolic content,antioxidant and antiproliferative activities of six varieties of white sesame seeds(Sesamum indicum L.)[J].Rsc Advances,2017(10):5751-5758

[13]Subba Rao M V,Muralikrishna G.Evaluation of the antioxidant properties of free and bound phenolic acids from native and malted finger millet(ragi,Eleusine coracana Indaf-15).[J].Journal of Agricultural&Food Chemistry,2002,50(4):889-892

[14]Ma X,Wua H,Liua L,et al.Polyphenolic compounds and antioxidant properties in mango fruits[J].Scientia Horticulturae,2011,129(1):102-107

[15]張金宏.蘋果渣中游離酚和結(jié)合酚的提取及其功能特性的研究[D].咸陽:西北農(nóng)林科技大學,2016:21-22

[16]李群梅.楊桃果實多酚及其抗氧化活性的研究[D].南寧:廣西大學,2010:30-44

[17]Pang D,You L,Li T,et al.Phenolic profiles and chemical-or cellbased antioxidant activities of four star fruit(Averrhoa carambola)cultivars[J].Rsc Advances,2016,6(93):90646-90653

[18]Su D,Zhang R,Hou F,et al.Comparison of the free and bound phenolic profiles and cellular antioxidant activities of litchi pulp extracts from different solvents[J].BMC Complementary and Alternative Medicine,2014,14(1):9-20

[19]李武,李艷君,楊瑞麗.熱帶水果多酚提取物的抗氧化和抗增殖活性研究[J].現(xiàn)代食品科技,2013(10):2383-2387

[20]陳冠林,陳松根,趙穎瑩,等.33種水果的總酚含量及其抗氧化能力研究[J].食品工業(yè),2014(9):264-268

[21]趙謀明,董紅竹,林戀竹.八種水果多酚定量分析與抗氧化活性研究[J].現(xiàn)代食品科技,2017(10):1-12

[22]Zhang R,Zeng Q,Deng Y,et al.Phenolic profiles and antioxidant activity of litchi pulp of different cultivars cultivated in Southern China.[J].Food Chemistry,2013,136(3-4):1169-1176

[23]石駿,廖森泰,張名位,等.干制加工對龍眼果肉多酚組成及抗氧化活性的影響[J].華南師范大學學報(自然科學版),2011(4):111-115

[24]楊瑞麗,陸俊豐,高歌,等.不同方法測定40種常見果蔬抗氧化活性的比較研究[J].廣東農(nóng)業(yè)科學,2011,38(8):72-74