楊娜，劉豐林

開封市中醫(yī)院，河南 開封 475001

糖尿病的病因多種多樣，飲食不節(jié)、腎虛、情志失調均可導致發(fā)病，其病機核心以燥熱為害，燥熱耗損津液，水精代謝失調，氣血循環(huán)阻滯，痰濁內生，體液暗耗而成消渴，基本病機是陰虛燥熱[1]。中醫(yī)藥防治糖尿病有著悠久的歷史，經(jīng)過幾千年的實踐，積累了大量寶貴的經(jīng)驗，并逐漸形成了獨特的學術體系[2]。在前人治療糖尿病的基礎上，依據(jù)辨證論治的原則，總結開發(fā)出十一味益腎降糖方，該制劑由黃芪、生地黃、白術、山茱萸、益母草、山藥等中藥組成，具有益氣健脾、補腎降糖、利水消腫之功效，是開封市中醫(yī)院的院內制劑，獲得河南省食品藥品監(jiān)督管理局制劑批文(豫藥制字Z04020164)，治療糖尿病、腎病具有較好療效[3]。本研究探討十一味益腎降糖方對2型糖尿病(NIDDM)大鼠的降血糖作用以及對腎臟Wnt/β-catenin信號通路表達的影響，現(xiàn)將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠60只，雌雄各半，體質量(200±20)g，購自北京維通利華動物實驗中心，許可證號：SCXK(京)2014-0016。在河南大學實驗動物中心溫度為(23±2)℃、濕度為(50±10)%、12 h光照交替的環(huán)境中飼養(yǎng)，動物實驗通過動物倫理委員會的審批。

1.2 藥品與試劑 十一味益腎降糖方由本院藥劑科自制，濃縮成1.5 g生藥/mL水煎劑的濃度。達格列凈片(AstraZeneca公司)，鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司產(chǎn)品，批號：B64927)；糖化血紅蛋白(HbA1c)測試盒(美國 Roche 公司)；胰島素(FINS)酶聯(lián)免疫(ELISA)法測試盒(瑞典 Mercodia 公司)；Wnt/βcatenin抗體(美國Abcam公司)；檸檬酸、檸檬酸三鈉均購自天津化學試劑有限公司。

1.3 實驗儀器 TBA-40FR(ACCUTE)全自動生化分析儀(日本東芝公司)；Microcl17微量離心機(美國Thermo公司)；Heraeus Biofuge Stratos冷凍離心機(德國Heraeus公司)；Power Wave 340酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Bio-TeR公司)；雅培安妥超越型血糖儀(美國Abbott公司)及安妥超越血糖試紙。

1.4 模型的建立、分組及干預 60只SD大鼠隨機均分為6組，即正常對照組、模型組、達格列凈組與十一味益腎降糖方低、中、高劑量組，每組10只。大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，除正常對照組給予普通顆粒飼料外，其余5組大鼠給予高糖高脂飼料，喂養(yǎng)4周后，禁食12 h后腹腔注射STZ 50 mg/kg，1周后空腹血糖(FBG)≥11.1 mmol/L為模型復制成功[4]。達格列凈組每天灌胃達格列凈片1 mg/(kg·d)，十一味益腎降糖方低、中、高劑量組分別灌胃十一味益腎降糖方水煎液2、4、16 g/(kg·d)，正常對照組和模型組灌胃等量的生理鹽水，每天給藥1次，連續(xù)給藥7周。給藥期間正常對照組大鼠仍以普通顆粒飼料喂養(yǎng)，其余大鼠繼續(xù)以高糖高脂飼料喂養(yǎng)。

1.5 指標的測定 分別于給藥前及給藥7周后，各組大鼠禁食12 h，取全血，4℃下3 000 r/min離心10 min，分離得血清和血漿，分別測定大鼠FBG水平、HbA1c水平和FINS水平，采用以下公式計算胰島素抵抗指數(shù)(IRI)：IRI＝FBG×FINS/22.5。采用血糖儀和血糖試紙測定大鼠FBG水平；采用全自動生化分析儀，按照HbA1c測試盒說明書檢測大鼠HbA1c水平；采用酶聯(lián)免疫檢測儀，按照FINS酶聯(lián)免疫(ELISA)法測試盒說明書檢測大鼠FINS水平。

1.6 Western blot法測定腎組織蛋白表達 取腎皮層組織以RIPA裂解液提取蛋白，再以Lowry法測定蛋白濃度。上述蛋白進行10%的SDS-PAGE電泳分離后，在200 mA條件下轉移到PVDF膜上(2 h)，以5%的脫脂奶粉封閉液封閉1 h后，加入TBST稀釋的一抗(Wnt4稀釋比例為1∶1000；β-catenin稀釋比例為1∶1000；內參β-actin稀釋比例為1∶5000)，4℃搖床孵育過夜。再以熒光二抗(1∶5000)37℃搖床避光孵育1 h后洗膜，用紅外激光掃描儀拍照并分析熒光條帶的灰度值，以目的條帶與β-actin灰度值的比值來表示蛋白表達量。顯色后分析膠片中的Western blot熒光條帶的灰度值[5]。

1.7 統(tǒng)計學方法 統(tǒng)計分析采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以(±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內前后比較采用配對t檢驗。

2 結果

2.1 各組大鼠FBG水平比較 見表1。與正常對照組比較，模型組大鼠FBG水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。給藥后，與模型組比較，達格列凈組、十一味益腎降糖方中、高劑量組大鼠FBG水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與給藥前比較，達格列凈組、十一味益腎降糖方高劑量組大鼠FBG水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠FBG水平比較(±s) mmol/L

表1 各組大鼠FBG水平比較(±s) mmol/L

與正常對照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與給藥前比較，③P＜0.05

組 別正常對照組模型組達格列凈組十一味益腎降糖方低劑量組十一味益腎降糖方中劑量組十一味益腎降糖方高劑量組n 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0給藥前5.1 4±0.3 2 1 9.7 5±1.8 9 1 9.8 1±1.9 2 1 9.7 6±1.9 1 1 9.8 8±1.9 0 1 9.9 2±1.8 0給藥后5.1 2±8.2 9 2 0.1 6±2.1 2①1 2.8 9±1.8 5②③1 8.3 8±2.1 3 1 7.9 3±1.9 2②1 6.3 8±1.8 9②③

2.2 各組大鼠HbA1c水平比較 見表2。與正常對照組比較，模型組大鼠HbA1c水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。給藥后，與模型組比較，達格列凈組、十一味益腎降糖方中、高劑量組大鼠HbA1c水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與給藥前比較，達格列凈組、十一味益腎降糖方中、高劑量組大鼠HbAlc水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.3 各組大鼠FINS、IRI水平比較 見表3。與正常對照組比較，模型組大鼠FINS水平升高，IRI升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。給藥后，與模型組比較，達格列凈組、十一味益腎降糖方中、高劑量組大鼠FINS水平降低，IRI顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與給藥前比較，達格列凈組、十一味益腎降糖方中、高劑量組大鼠FINS水平降低，IRI顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

表2 各組大鼠HbA1c水平比較(±s)

表2 各組大鼠HbA1c水平比較(±s)

與正常對照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與給藥前比較，③P＜0.05

組 別正常對照組模型組達格列凈組十一味益腎降糖方低劑量組十一味益腎降糖方中劑量組十一味益腎降糖方高劑量組n H b A 1 c 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0給藥前3.7 8±0.4 2 8.5 3±0.7 4 8.5 7±0.8 0 8.5 5±0.8 9 8.6 2±0.8 4 8.5 8±0.7 9給藥后3.8 4±0.4 0 8.6 6±0.3 7①6.1 6±0.5 8②③8.2 3±0.3 9 7.6 7±0.4 0②③7.1 2±0.3 6②③

表3 各組大鼠FINS、IRI水平比較(±s)

表3 各組大鼠FINS、IRI水平比較(±s)

與正常對照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與給藥前比較，③P＜0.05

組 別n F I N S(U/m L) I R I正常對照組模型組達格列凈組十一味益腎降糖方低劑量組十一味益腎降糖方中劑量組十一味益腎降糖方高劑量組1 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 0給藥前2.3 7±0.1 8 8.1 4±0.5 9 8.1 8±0.4 3 8.1 7±0.4 0 8.1 6±0.3 7 8.2 1±0.3 9給藥后2.3 5±0.2 2 8.1 8±0.4 1①6.5 5±0.3 4②③8.0 4±0.3 4 7.3 7±0.4 3②③6.8 1±0.4 0②③給藥前0.5 6±0.0 6 8.7 8±0.6 0 8.7 2±0.6 5 8.7 3±0.5 8 8.7 4±0.6 3 8.7 4±0.6 3給藥后0.5 5±0.0 7 8.8 4±0.6 8①6.6 4±0.4 9②③8.3 5±0.6 2 7.7 8±0.5 5②③7.1 6±0.4 4②③

2.4 各組大鼠腎臟Wnt4、β-catenin蛋白表達比較見表4。與正常對照組比較，模型組大鼠Wnt4、β-catenin蛋白的表達量均明顯增多，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與模型組比較，達格列凈組、十一味益腎降糖方中、高劑量組大鼠Wnt4、β-catenin蛋白的表達量均明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

3 討論

糖尿病是臨床常見的內分泌代謝疾病，發(fā)病率僅次于腫瘤和心血管疾病，其病因和發(fā)病機制異常復雜，并發(fā)癥多且嚴重，死亡率高。糖尿病是當前威脅全球人類健康的最重要的非傳染性疾病之一，根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟統(tǒng)計，2011年全球糖尿病患者人數(shù)已達3.7億，其中80%在發(fā)展中國家，估計到2030年全球將有近5.5億糖尿病患者[6]。

表4 各組大鼠腎臟Wnt4、β-catenin蛋白表達比較(±s)

表4 各組大鼠腎臟Wnt4、β-catenin蛋白表達比較(±s)

與正常對照組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05

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中醫(yī)藥是抗糖尿病藥物開發(fā)的重要來源。已經(jīng)有大量實驗研究了中藥或植物藥以及其有效成分對糖尿病及相關并發(fā)癥的治療作用[2]。中醫(yī)理論認為人的機體與環(huán)境密切相關，陰陽處于相對平衡狀態(tài)，但飲食不節(jié)、腎虛和情志失調等因素可導致五臟虛弱、積熱傷津、郁火傷陰和腎精虧損等，產(chǎn)生中醫(yī)消渴的癥狀。中醫(yī)藥在治療糖尿病方面具有藥效溫和，作用持久，緩解并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展，不良反應少，改善糖耐量等優(yōu)點，作用機理表現(xiàn)出多靶點、多向性、多層面特點，具有不可比擬的優(yōu)勢，因此，從傳統(tǒng)中醫(yī)藥中研究開發(fā)新型抗糖尿病中藥制劑具有重要的意義和廣闊的前景[7]。

糖尿病腎病發(fā)生時，伴隨足細胞Wnt/β-catenin通路的激活、Wnt信號活化及β-catenin核易位表達的增加，該機制參與了腎細胞損傷的進展。在該通路中Wnt4蛋白對腎小管的形成及腎臟纖維化導致的腎小球硬化及損傷具有重要意義。β-catenin作為經(jīng)典Wnt信號通路的核心蛋白，參與細胞代謝的增殖、分化和凋亡過程，具有介導細胞間黏附和參與基因表達的功能[8]。

十一味益腎降糖方是依據(jù)辨證論治的原則，通過長期實驗篩選總結開發(fā)出的中藥復方，該制劑由黃芪、生地黃、白術、山茱萸、益母草、山藥等中藥組成，具有益氣健脾、補腎降糖、利水消腫之功效，方中黃芪、山藥補中益氣；生地黃、山茱萸止咳生津養(yǎng)陰。諸味藥合用，可發(fā)揮健脾益氣、清熱養(yǎng)陰之功效。本研究發(fā)現(xiàn)，十一味益腎降糖方中、高劑量組可使2型糖尿病模型大鼠FBG和HbA1c水平與FINS、IRI降低(P＜0.05)，并具有一定的劑量依賴性。Wnt/β-catenin信號通路介導了糖尿病腎損傷動物模型的腎臟纖維化，作為細胞內重要的信號通路來調控系膜細胞功能。實驗結果顯示，模型組大鼠腎臟Wnt/β-catenin通路的表達明顯升高，由此驗證該通路的激活參與了2型糖尿病模型大鼠腎損傷的病程進展。十一味益腎降糖方可在一定程度上抑制大鼠腎臟Wnt/β-catenin通路的表達，對2型糖尿病所誘發(fā)的腎臟損傷具有一定的保護作用。

綜上所述，十一味益腎降糖方具有降低2型糖尿病模型大鼠血糖的作用，并通過改善胰島素抵抗、增加胰島素敏感性產(chǎn)生一定的保護作用，具有一定的開發(fā)前景。

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