林 牧，韓曉靜，唐 竹，陳云華，陶 雪，石國(guó)霰

(貴州航天醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563000)

氯吡格雷是一種臨床應(yīng)用廣泛的抗凝藥物，無(wú)論是用于降低急性腦梗死的致殘致死率，還是用于急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)抗血栓形成，都有顯著療效[1-2]。但該藥物發(fā)揮抗血小板凝集的藥理作用前，必須經(jīng)過(guò)肝臟細(xì)胞色素P450 2C19(cytochrome P450 2C19，CYP2C19)的代謝[3]。CYP2C19存在著一定的基因多態(tài)性，不同基因型的抗血小板作用也不盡相同，亞洲人群中CYP2C19的變異主要為CYP2C19*2和CYP2C19*3兩種基因型，通過(guò)以上等位基因的突變降低CYP2C19的酶活性，進(jìn)而影響氯吡格雷的療效[4-5]。因此，國(guó)內(nèi)外諸多臨床用藥指南均建議為需服用氯吡格雷抗血小板治療的患者行CYP2C19基因測(cè)定，從而更好地選擇抗血小板藥物的種類[6-7]。本研究對(duì)141例于我院就診的冠狀動(dòng)脈綜合征行PCI術(shù)和突發(fā)缺血性腦卒中的患者予以CYP2C19基因型檢測(cè)，通過(guò)比較以上患者服用氯吡格雷前后血小板聚集率和多種高危因素的差異，探討該基因多態(tài)性與氯吡格雷療效的關(guān)系，綜合評(píng)價(jià)CYP2C19基因多態(tài)性與氯吡格雷在PCI術(shù)后療效的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1病例選擇：選取2016年1月～2016年12月就診于貴州航天醫(yī)院,因冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病并行PCI手術(shù)或因缺血性腦卒中服用氯吡格雷抗血小板治療的患者141例為研究對(duì)象，其中男105例，女36例；年齡42～81歲，平均64.1歲。以上患者均排除標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)重心力衰竭和肝腎功能損害，無(wú)阿司匹林或氯吡格雷治療禁忌證，生命體征平穩(wěn)，依從性好，并簽署知情同意書(shū)。行PCI手術(shù)患者，術(shù)前每天常規(guī)采用氯吡格雷300 mg和阿司匹林300 mg雙聯(lián)抗血小板治療，術(shù)后長(zhǎng)期服用氯吡格雷維持劑量75 mg/d[8]；缺血性腦卒中患者先予以氯吡格雷首劑負(fù)荷劑量300 mg/d，后給予氯吡格雷75 mg/d維持劑量治療[9]。

1.2常用試劑及儀器：血液基因組DNA提取試劑盒購(gòu)置于北京天根生化科技有限公司；人類CYP2C19基因檢測(cè)試劑盒(PCR熒光探針?lè)?購(gòu)置于武漢友芝友醫(yī)療科技有限公司；CYP2C19基因檢測(cè)試劑盒及DNA微陣列芯片識(shí)讀儀等，均購(gòu)置于上海百傲科技股份有限公司；real time Quantitative - PCR儀7500型購(gòu)置于美國(guó)ABI公司；普利生LBY-NJ4 血小板聚集率測(cè)試儀(外送至江蘇蘇博生物醫(yī)學(xué)股份有限公司代為檢測(cè))。

1.3研究方法

1.3.1CYP2C19基因型檢測(cè)

1.3.1.1PCR檢測(cè)法：抽取2 ml待檢患者術(shù)前(服藥前)當(dāng)日的空腹血樣本2 ml于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中， 4℃ 冰箱內(nèi)保存并于24 h 內(nèi)提取DNA；采用血液基因組DNA提取試劑盒提取待檢患者DNA樣本(DNA的A260/A280在1.8～2.0之間，濃度在5～15 ng/μl之間)，-20℃冰箱保存并于24 h內(nèi)檢測(cè)；取2 μl DNA樣本加入到分裝好的CYP2C19基因檢測(cè)PCR反應(yīng)管中(CYP2C19* 2上游引物:5′-ATF ACA ACC AGA GCT TGG C-3′，下游引物5′ -AGC AIT ACT CCT TGA CCT GTT-3′；CYP2C19* 3 上游引物：5′-CCA TTA TTT AAC CAG CTA GGC-3′，下游引物5′-AAT GTA CTT CAG GGC TTG G-3′)，按要求上機(jī)檢測(cè)(AB 7500)。

1.3.1.2基因芯片檢測(cè)法：DNA樣本提取同PCR檢測(cè)法(DNA的A260/A280在1.5～2.0之間，濃度在10～60 ng/μl之間)；取5 μl DNA樣本加入到分裝好的CYP2C19 PCR擴(kuò)增反應(yīng)管中，進(jìn)行特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物與DNA 微陣列芯片一同放入全自動(dòng)雜交儀中雜交，在通過(guò)BE-2.0 DNA微陣列生物芯片識(shí)讀儀掃描芯片后進(jìn)行圖像分析處理并確定基因型。

1.3.2血小板聚集率檢測(cè)：抽取待檢患者術(shù)前(服藥前)當(dāng)日的空腹血樣本行血小板聚集率檢測(cè)，并在PCI術(shù)后(服藥后)氯吡格雷治療一周(劑量為75 mg/d)采血復(fù)測(cè)。采用二磷酸腺苷( Adenosine diphosphate，ADP)(劑量為5 μmol/ L)誘導(dǎo)的光學(xué)比濁法對(duì)血小板聚集率進(jìn)行檢測(cè)，再根據(jù)CYP2C19不同基因型所產(chǎn)生的不同代謝類型對(duì)以上患者進(jìn)行分組，比較術(shù)前(服藥前)與術(shù)后(服藥后)氯吡格雷治療一周后血小板聚集率的變化，進(jìn)而判斷CYP2C19基因多態(tài)性與氯吡格雷療效的相關(guān)性。

1.3.3高危因素相關(guān)性分析：對(duì)納入患者行血糖、血壓、三酰甘油(Triacylglyceride，TG)、低密度脂蛋白(Low density lipoprotein ，LDL-C)、總膽固醇(Total cholesterol ，CHOL)、B型腦尿鈉肽(B type natriuretic peptide，BNP)、肌紅蛋白(Myoglobin ，MYO )和肌鈣蛋白(troponin，Trop1)等檢測(cè)，以判斷不同代謝類型的患者與以上高危因素的相關(guān)性。

1.3.4不同性別、民族的相關(guān)性分析：對(duì)納入患者的性別、民族進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以了解不同性別和民族與CYP2C19不同代謝類型之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1CYP2C19基因分型檢測(cè)結(jié)果：熒光PCR檢測(cè)法與基因芯片檢測(cè)法的結(jié)果完全一致，根據(jù)CYP2C19的不同基因位點(diǎn)(*1/*1、*1/* 2、* 1/*3、*2/*2、*2/*3、*3/*3)將以上患者分為快代謝型(EM)、中間代謝型(IM)和慢代謝型(PM)。見(jiàn)表1、圖1。

注：A為*1/*1 (636GG,681GG)；B為*1/*2 (636GG,681GA)；C為*1/*3 (636GA,681GG)；D為*2/*2 (636GG,681AA)；E為*2/*3 (636GA,681GA)圖1 基因芯片法所確定的基因位點(diǎn)

表1CYP2C19基因型和代謝類型分布情況[例(%)]

基因型分布情況代謝類型?1/?1(636GG，681GG)59(4184)快代謝型(EM)?1/?2(636GG，681GA)52(3688)中間代謝型(IM)?1/?3(636GA，681GG)10(709)中間代謝型(IM)?2/?2(636GG，681AA)15(1064)慢代謝型(PM)?3/?3(636AA，681GG)0(0)慢代謝型(PM)?2/?3(636GA，681GA)5(355)慢代謝型(PM)

2.2CYP2C19 基因多態(tài)性與血小板聚集率：根據(jù)CYP2C19代謝類型的結(jié)果進(jìn)行分組，比較術(shù)前(服藥前)與術(shù)后(服藥后)氯吡格雷治療一周后血小板聚集率檢測(cè)結(jié)果，含有* 2 或* 3 等位基因的患者，冠心病PCI術(shù)后和缺血性腦卒中服藥一周后血小板聚集率雖高于野生純合型，但無(wú)論是快代謝型(即*1/*1基因型)、中間代謝型(即*1/*2*和1/*3基因型)或慢代謝型(即*2/*2和*2/*3基因型)血小板聚集率的比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為0.374，0.116和0.067)。見(jiàn)圖2。

圖2 不同代謝型患者血小板聚集率之間的比較

2.3高危因素對(duì)遵義地區(qū)人群CYP2C19 遺傳多態(tài)性的影響：隨著生活節(jié)奏的不斷加快，心腦血管疾病成為損害人類健康的重要原因，高血壓、高血脂和高血糖等都是引發(fā)心腦血管疾病的危險(xiǎn)因素。為了探索以上因素與CYP2C19基因多態(tài)性的相關(guān)性，本研究根據(jù)不同基因型所產(chǎn)生的代謝類型進(jìn)行分組。見(jiàn)表2。

2.4性別、民族與CYP2C19 基因多態(tài)性的相關(guān)性：納入的141名患者中，按性別分類男105例，女36例；按民族分類漢族114例、苗族7例、侗族5例、仡佬族8例、土家族5例、布依族2例。根據(jù)不同性別、民族進(jìn)行代謝類型比較分析，發(fā)現(xiàn)其等位基因突變類型間均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2PCI術(shù)后患者不同代謝型相關(guān)危險(xiǎn)因素的比較[例(%)]

項(xiàng)目快代謝型中間代謝型慢代謝型P值χ2值高血壓31(2199)31(2199)11(780)07260819高血糖26(1843)28(1986)11(780)03630577LDL-C19(1348)16(1135)6(426)06970827CHOL19(1348)18(1277)6(426)04260131TG18(1277)23(1631)6(426)01130194BNP9(638)12(851)3(213)06730248

3 討論

氯吡格雷通過(guò)阻斷血小板膜蛋白上的P2Y12受體與ADP的結(jié)合抑制血小板聚集，發(fā)揮較好的抗血小板作用而在臨床廣泛應(yīng)用于預(yù)防心腦血管事件的發(fā)生[11-12]。但最近的研究結(jié)果表明，其療效受多種因素影響，其中CYP2C19基因多態(tài)性是最重要因素，在人群中涉及約25個(gè)位點(diǎn)，而減弱氯吡格雷療效的主要為*2和*3等位基因[13]，以上位點(diǎn)在亞洲人群中發(fā)生率較高，分別為29%～35%和2%～9%[14-15]。本研究采用PCR和基因芯片檢測(cè)對(duì)2016年于我院心內(nèi)科行PCI手術(shù)和神經(jīng)內(nèi)科的缺血性腦卒中患者共141例，結(jié)果一致。得出遵義地區(qū)人群中發(fā)生雜合突變的基因型以*1/*2(636GG,681GA)發(fā)生率最高，*3/*3(636AA,681GG)發(fā)生率最低的基因分布情況，與張愛(ài)玲等人對(duì)亞洲健康人群CYP2C19基因型發(fā)生率的研究結(jié)果[10]相符。

通過(guò)ADP誘導(dǎo)的光學(xué)比濁法對(duì)不同代謝類型的患者進(jìn)行血小板聚集率檢測(cè)，該方法作為血小板聚集率檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”被廣泛應(yīng)用，趙冠人等的研究結(jié)果[16]表明，CYP2C19*2或CYP2C19*3位點(diǎn)的突變可降低ADP對(duì)血小板的誘導(dǎo)，發(fā)揮抑制血小板聚集的作用。通過(guò)觀察服藥前和服用一周氯吡格雷(劑量為75 mg/d)的血小板反應(yīng)性，發(fā)現(xiàn)含有*2或*3等位基因的患者，服藥后的血小板聚集率雖高于野生純合型，但不同代謝類型間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這可能與服用氯吡格雷的時(shí)間較短和樣本量較少有關(guān)，為進(jìn)一步研究這種臨床療效的差別，仍需納入更多樣本和考慮更多因素加以判斷。

本研究還通過(guò)多種心血管病高危因素(如高血壓、高血脂和高血糖等)的科學(xué)統(tǒng)計(jì)分析，以及多因素(如性別、民族等)綜合考慮，全面了解CYP2C19基因多態(tài)性可能存在的相關(guān)因素。雖實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)以上因素與該基因多態(tài)性無(wú)直接相關(guān)性，但該結(jié)果可能與不同地區(qū)、不同民族之間的等位基因分布不同有關(guān)，且樣本量較小對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也存在一定影響。研究結(jié)果提示，對(duì)心血管性疾病的高發(fā)人群，除需要在服藥后進(jìn)行的血小板聚集率的檢測(cè)外，CYP2C19 基因型的檢測(cè)對(duì)臨床也有一定的指導(dǎo)意義，可為患者的聯(lián)合用藥方案或用藥計(jì)量調(diào)整提供參考，能夠更為精準(zhǔn)地使用抗血小板藥物進(jìn)行臨床治療。

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