舒冠男，滕夏虹，許倩倩，鄒春林

(1. 廣西醫(yī)科大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，南寧 530021； 2. 長(zhǎng)壽與老年相關(guān)疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(廣西醫(yī)科大學(xué))，南寧 530021； 3. 廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，南寧 530021； 4. 廣西醫(yī)科大學(xué)信息與管理學(xué)院，南寧 530021)

Conflict of interest statement: We declare that we have no conflict of interest statement.

1型糖尿病是一類自身免疫性疾病，胰島β細(xì)胞由于受到自身免疫系統(tǒng)的攻擊，導(dǎo)致胰島β細(xì)胞的破壞，胰島素的絕對(duì)缺乏，產(chǎn)生一系列的代謝障礙和血糖升高。目前常用的1型糖尿病動(dòng)物模型是鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)誘導(dǎo)的1型糖尿病嚙齒類動(dòng)物模型[1]， 但這種模型是利用STZ對(duì)胰島β細(xì)胞的選擇性毒性殺傷作用，誘使動(dòng)物產(chǎn)生糖尿病，這種化學(xué)誘導(dǎo)法雖然簡(jiǎn)單易操作，但與臨床上1型糖尿病病人的發(fā)病原因并不相同。非肥胖型糖尿病小鼠(NOD)是通過選擇繁殖和近親交配從Jcl:ICR小鼠中獲得的一種1型糖尿病小鼠模型，該小鼠模型通常于4～5周齡開始出現(xiàn)胰島炎，進(jìn)而破壞胰島β細(xì)胞，于12～14周齡時(shí)出現(xiàn)明顯糖尿病癥狀，到30周齡時(shí)雌性小鼠累計(jì)發(fā)病率可達(dá)到60%～80%，而雄性小鼠則不到20%～30%[2]。其與1型糖尿病患者一樣，都是由于自身免疫系統(tǒng)的攻擊導(dǎo)致胰島細(xì)胞的損壞，最終導(dǎo)致代謝紊亂和血糖升高。因此，在1型糖尿病的研究中，具備較高的研究與實(shí)用價(jià)值。目前國內(nèi)有關(guān)NOD小鼠胰島分離與純化方法的研究報(bào)導(dǎo)較少[3]，未見有對(duì)分離的NOD小鼠胰島生物學(xué)功能的詳細(xì)研究報(bào)道。本文旨在建立一種穩(wěn)定高效的NOD小鼠胰島分離方法，并對(duì)其體內(nèi)外的生物學(xué)功能進(jìn)行研究。旨在為今后利用NOD小鼠進(jìn)行胰島移植實(shí)驗(yàn)提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

7～8周齡雌性SPF級(jí)NOD小鼠23只， 體重18～20 g；13周齡雌性SPF級(jí)NOD小鼠30只，體重 22～25 g，均由北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京)2014-0004】，并已通過相關(guān)檢疫，飼養(yǎng)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK桂2014-0003】，SPF級(jí)封閉環(huán)境下，溫度： 22～24℃, 濕度：45%～80%, 光照：150～300 Lx, 12 h晝夜交替。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案已通過廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：201702007)。

1.1.2 主要試劑

膠原酶(貨號(hào)：C9263)、Ficoll PM 400(貨號(hào)：F4375)和雙硫腙 (dithizone, DTZ)(貨號(hào)：D5130) 均購自Sigma公司。小鼠Insulin ELISA試劑盒(貨號(hào)：10-1247-01)購自Mercodia公司。25 μL氣相微量進(jìn)樣針購自Hamilton公司。RPMI-1640(貨號(hào)：11875-093)和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(貨號(hào)：10099-141) 購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

同基因胰島移植胰島供體小鼠：7～8周齡血糖正常的雌性NOD小鼠。同基因胰島移植受體小鼠：13周齡的雌性NOD小鼠每周監(jiān)測(cè)兩次血糖，連續(xù)兩次血糖均>16.7 mmol/L即定義為發(fā)病小鼠，30只小鼠中共有12只發(fā)病，將發(fā)病小鼠隨機(jī)分為兩組，每組6只，一組移植組，一組為假手術(shù)組。

1.2.2 小鼠胰島細(xì)胞團(tuán)的分離純化

10%水合氯醛腹腔注射麻醉胰島供體NOD小鼠，動(dòng)脈夾夾閉膽總管近膽囊端。小號(hào)頭皮針(0.45 mm×0.16 mm)于膽總管內(nèi)插管逆行注射預(yù)冷的膠原酶2～2.5 mL。分離胰腺，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，每只胰腺再加入2 mL膠原酶溶液，于37℃水浴鍋中消化18 min。消化完畢加入預(yù)冷的RPMI 1640溶液至50 mL終止消化，手搖1 min，然后通過孔徑為500 μm的不銹鋼濾網(wǎng)過濾，離心去上清(800 r/min，2 min)，并再次洗滌兩次(800 r/min, 2 min)。完全去除RPMI1640液，加入4 mL 25%的Ficoll (常溫)，渦旋數(shù)秒，待細(xì)胞液混合均勻，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管。再依次沿離心管壁緩慢加入2 mL 23%、21.5%、11.5%的Ficoll溶液和2 mL RPMI1640溶液，常溫下2 500 r /min，離心15 min，并緩慢降速。使用微量移液器小心吸取11.5%與21.5%交界層的細(xì)胞團(tuán)。轉(zhuǎn)移至15 mL離心管，加入8 mL RPMI1640溶液洗滌兩次(800 r/min，2 min)。

1.2.3 分離胰島的染色鑒定與純度分析

將分離純化后的胰島細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移至6 cm培養(yǎng)皿，加入3 mL RPMI 1640。均勻加入60 μg/mL的DTZ溶液3 mL，避光常溫下孵育15 min。倒置顯微鏡下拍照觀察。成桃紅色的即為胰島細(xì)胞團(tuán)。Image J 統(tǒng)計(jì)計(jì)數(shù)陽性胰島細(xì)胞團(tuán)。

1.2.4 分離胰島糖刺激實(shí)驗(yàn)

胰島細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)兩天后，于倒置顯微鏡下，采用20 μL的移液槍小心吸取胰島細(xì)胞團(tuán)置于1.5 mL EP管中，50個(gè)胰島/管，共3管，然后轉(zhuǎn)移至24孔板中。分別按照KRBB基礎(chǔ)液，含1.6 mmol/L 葡萄糖的KRBB低糖刺激液和含16.7 mmol/L葡萄糖的KRBB高糖刺激液的順序依次刺激1 h、1.5 h、1.5 h。收集低糖與高糖刺激上清液。采用小鼠的insulin的ELISA試劑盒檢測(cè)胰島素的分泌量。

注：a. 新鮮分離胰島；b. DTZ染色胰島；c. 培養(yǎng)2 d后胰島。bars=200 μm圖1 分離純化后胰島細(xì)胞團(tuán)Note. A. freshly isolated islets. b. DTZ-stained islets. c. islets after 2 days of culture. Scale bars=200 μm.Fig.1 Isolated and purified NOD mouse islets

1.2.5 分離胰島的移植實(shí)驗(yàn)

科學(xué)研究是建立在誠信的基礎(chǔ)上的。科學(xué)的目標(biāo)在于求真——探究自然界運(yùn)動(dòng)變化的規(guī)律，所謂“真”，即與事實(shí)相符合?？茖W(xué)家探求真理是通過“從事實(shí)出發(fā)探究其中規(guī)律”的途徑實(shí)現(xiàn)的，為此必須不斷地通過觀察實(shí)驗(yàn)而獲得大量的、確鑿的經(jīng)驗(yàn)事實(shí)和數(shù)據(jù)，并在此基礎(chǔ)上提出規(guī)律性的說明，否則“巧婦難為無米之炊”，探究自然規(guī)律就無從談起。由此，所獲經(jīng)驗(yàn)事實(shí)和數(shù)據(jù)必須真實(shí)可信，不容半點(diǎn)虛假，否則會(huì)導(dǎo)致虛假、無效的結(jié)論。

在倒置顯微鏡下收集胰島細(xì)胞團(tuán)與1.5 mL EP管中，每組收集300胰島團(tuán)左右。收集完畢于4℃冰上保存。轉(zhuǎn)運(yùn)至SPF級(jí)別的動(dòng)物房中進(jìn)行移植操作。將細(xì)胞團(tuán)于離心機(jī)中離心30 s，采用微量移液器小心吸除大部分上清。留下大概20～30 μL上清液。10%的水合氯醛腹腔注射麻醉受體小鼠， 將小鼠正面放置于手術(shù)臺(tái)，并將四肢固定。取脊柱旁切口暴露左側(cè)腎臟，并輕輕將其擠壓出體外。于腎臟中部將腎被膜切開一小口，通過該切口應(yīng)用玻璃剝離子將腎被膜下腔隙擴(kuò)張分離至腎上極，然后通過PE50管將胰島細(xì)胞團(tuán)緩慢注入腎被膜下(假手術(shù)組僅移植注射PBS)，同時(shí)在移植過程中采用生理鹽水始終保持腎被膜的濕潤(rùn)狀態(tài)，并使用玻璃剝離子將胰島細(xì)胞團(tuán)推至遠(yuǎn)離切口處，將腎重新納入腹腔內(nèi)，縫合針縫合腹膜及皮膚。將小鼠置于熱源燈光下復(fù)溫1 h，待小鼠呼吸平穩(wěn)，神經(jīng)反射恢復(fù)，方可放回鼠籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。在手術(shù)后的兩周內(nèi)，每天檢測(cè)小鼠非空腹血糖和體重，兩周之后每周檢測(cè)兩次。

1.2.6 移植后小鼠腹腔糖耐量實(shí)驗(yàn)

分別于移植實(shí)驗(yàn)前一周，移植后兩周行糖耐量實(shí)驗(yàn)。通過腹腔注射葡萄糖溶液(葡萄糖注射量為2.0 g/kg)，然后分別測(cè)定0、15、30、60、90、120 min和180 min的血糖結(jié)果。通過計(jì)算血糖曲線的曲線下面積(AUC)來判斷小鼠胰島β細(xì)胞功能和機(jī)體對(duì)血糖的調(diào)節(jié)作用。

1.2.7 腎被膜下移植物的免疫組化染色

移植側(cè)小鼠腎組織經(jīng) 4%多聚甲醛固定，石蠟包埋， 切成 5 μm 厚的切片，石蠟切片經(jīng)二甲苯和乙醇脫蠟，5%正常封閉用驢血清于室溫下封閉1 h， 然后加入rabbit anti-insulin antibody(1∶100，Cell Signaling Technology)4℃孵育過夜，0.01 mol/L PBS 漂洗(5 min×3次)，轉(zhuǎn)入Alexa Fluor 555 donkey anti-rabbit IgG (H+L)(1∶400，Thermo Fisher Scientific)室溫孵育1.5 h， 0.01 mol/L PBS 漂洗(5 min×3 次)，然后DAPI復(fù)染細(xì)胞核5 min，0.01 mol/L PBS 漂洗(5 min×3 次)，最后用含10%甘油的PBS封片，并于Olympus BX53熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 分離胰島的鑒定與純度

胰島細(xì)胞團(tuán)經(jīng)分離純化后，鏡下可見包膜完整、大小不一的細(xì)胞團(tuán)(圖1 a)。平均每只小鼠可分離得到(116±12)個(gè)胰島團(tuán)，胰島細(xì)胞團(tuán)經(jīng)DTZ特異性染色后，呈現(xiàn)鮮艷的亮紅色(圖1b)，經(jīng)Image J計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞團(tuán)，結(jié)果顯示，亮紅色的胰島細(xì)胞團(tuán)占細(xì)胞團(tuán)總數(shù)的90%以上，表明分離純化后的胰島細(xì)胞團(tuán)純度>90%。且該胰島細(xì)胞團(tuán)經(jīng)培養(yǎng)2 d以后，相較于未培養(yǎng)前，形態(tài)更為光滑，包膜更為完整(圖1c)。

2.2 血糖正常NOD小鼠胰島與KM小鼠胰島糖刺激胰島素釋放水平的比較

注：NOD小鼠胰島與KM小鼠胰島比較,***P<0.001。圖2 NOD小鼠與KM小鼠胰島素釋放量比較Note.NOD mouse islets vs.KM mouse islets,***P<0.001.Fig.2 Comparison of the insulin secretion in NOD mice and KM mice

2.3 胰島移植對(duì)糖尿病發(fā)病NOD小鼠血糖的影響

如圖3所示，假手術(shù)組小鼠在兩周左右陸續(xù)死亡，且血糖一直維持在20 mmol/L以上，而相對(duì)于假手術(shù)組，胰島移植組小鼠在移植了(300±23)個(gè)胰島后，血糖有了明顯的降低(P<0.001)。有66%的老鼠在兩周以內(nèi)將血糖維持在10～15 mmol/L。兩周后血糖逐步上升。而有33%的小鼠在移植后50 d仍然能夠?qū)⒀强刂圃?0 mmol/L左右。

圖3 胰島移植后血糖變化Fig.3 Blood glucose levels at different times after islet transplantation

2.4 胰島移植對(duì)糖尿病發(fā)病NOD小鼠體重的影響

如圖4所示，在移植后，我們分別檢測(cè)了假手術(shù)組和胰島移植組小鼠的體重變化，移植組在移植后半個(gè)月體重變化不明顯，與術(shù)前比較體重基本在0.5 g上下浮動(dòng)，而假手術(shù)組小鼠在術(shù)后第5天和第7天體重較術(shù)前有明顯減輕,其下降幅度分別為(4.68±0.55) g和(2.14±0.56) g，與移植組的體重變化幅度比較，差異有顯著性(P<0.001和P<0.01)。

圖4 移植后體重變化量Fig.4 Changes of body weight of the mice after transplantation

2.5 移植前后糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了評(píng)價(jià)移植胰島在體內(nèi)的生物學(xué)功能，本研究分別于移植前和移植后兩周，對(duì)胰島移植組小鼠進(jìn)行腹腔糖耐量實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖5所示，胰島移植組小鼠的糖耐量在移植后明顯改善，并通過比較糖耐量曲線下面積(area under the curve, AUC)，結(jié)果如圖6所示，移植前AUC值為(3784.2±435) mmol/L×180 min，移植后AUC值為(2489.2±389.3) mmol/L×180 min，差異有顯著性(P<0.05)。

注：a. 在殘存移植胰島細(xì)胞團(tuán)(白色虛線框出)周圍存在大量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(紅色箭頭所指)；b. 腎被膜下可見胰島素抗體免疫熒光染色陽性的細(xì)胞團(tuán)(紅色熒光)，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，bar=200 μm。圖7 移植后腎被膜下移植部位的HE染色和胰島素抗體免疫熒光染色Note. Extensive lymphocyte infiltration (red arrows) surrounding the transplanted islet (outlined by a white line)(HE staining). B. Insulin-positive cells (red fluorescence) in an subcapsularly transplanted islet. The blue fluorescence indicates cell nuclei. Immunofluorescence DAPI staining. Scale bar=200 μm.Fig.7 Histology of an islet transplanted under the renal capsule

圖5 糖耐量實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Results of IPGTT in the transplant recipients

注：移植前與移植后比較，*P<0.05。圖6 移植前和移植后糖耐量曲線下面積比較Note.Before vs.after transplantation,*P<0.05.Fig.6 Comparison of the areas under the curve (AUC) before and after islet transplantation

2.6 腎被膜下移植胰島組織形態(tài)學(xué)觀察

為了證實(shí)移植胰島在受體小鼠體內(nèi)的存活情況，本研究對(duì)移植側(cè)小鼠腎臟進(jìn)行HE染色和免疫熒光染色，結(jié)果顯示腎被膜下可見胰島素抗體免疫熒光染色陽性的細(xì)胞團(tuán)，表明該細(xì)胞團(tuán)確為移植入腎被膜下的胰島細(xì)胞團(tuán)(圖7b)，并且在殘存移植胰島細(xì)胞團(tuán)周圍存在大量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖7a)。

3 討論

1型糖尿病是一種由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的以免疫性胰島炎和選擇性胰島β細(xì)胞損傷為特征的自身免疫性疾病。在胰腺或胰島移植術(shù)后，移植物胰島內(nèi)免疫細(xì)胞的積聚導(dǎo)致胰島炎，是糖尿病復(fù)發(fā)的主要原因。 有研究報(bào)道1型糖尿病病人接受白細(xì)胞抗原相同的非糖尿病正常胰腺移植后，發(fā)生了針對(duì)移植物內(nèi)胰島的單核細(xì)胞浸潤(rùn)，胰島結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致糖尿病復(fù)發(fā)[4]。提示即使同基因胰島細(xì)胞移植同樣有可能遭到1型糖尿病宿主自身免疫反應(yīng)的攻擊，而使移植的胰島細(xì)胞被破壞。而NOD小鼠也是一種自身免疫性1型糖尿病小鼠模型。T細(xì)胞攻擊胰島細(xì)胞團(tuán)導(dǎo)致胰島素的分泌不足是其發(fā)病主要原因[5]。因此，NOD小鼠是一種研究如何保護(hù)移植胰島免受自身免疫反應(yīng)攻擊的理想動(dòng)物模型，而如何獲得高質(zhì)量的NOD小鼠胰島以及對(duì)它們進(jìn)行生物學(xué)功能進(jìn)行分析是這方面研究的基礎(chǔ)，目前有關(guān)這方面的研究報(bào)道不多。本文旨在建立一種高效穩(wěn)定的NOD小鼠胰島分離純化方法，并對(duì)分離純化的NOD小鼠胰島進(jìn)行生物學(xué)功能研究。

由于在血糖正常NOD小鼠的胰腺內(nèi)，胰島周圍已有一定的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，因此本研究發(fā)現(xiàn)，在分離NOD小鼠胰島的操作過程中，存在許多與之前其他研究報(bào)道的小鼠胰島分離方法的不同之處：(1)消化酶濃度的的選擇不同：有文獻(xiàn)報(bào)道，小鼠胰腺多采用0.5～1 mg/L膠原酶[6-9]，但本研究發(fā)現(xiàn)，NOD小鼠采用過高濃度的膠原酶消化，會(huì)對(duì)分離的胰島團(tuán)造成損害，破壞胰島包膜的完整性，且會(huì)產(chǎn)生大量的死細(xì)胞，分泌許多粘性物質(zhì)，影響胰島團(tuán)的純化，因此在分離過程中，我們選擇采用0.3 mg/mL的V型膠原酶進(jìn)行灌注消化。不僅能夠保持包膜的完整性，得到較高的產(chǎn)率，而且基本不產(chǎn)生粘性物質(zhì)，不會(huì)影響后續(xù)的純化移植。(2)靜止消化時(shí)間上的不同：合適時(shí)間對(duì)于胰島團(tuán)的得率至關(guān)重要，但消化時(shí)間與所選擇消化酶的種類和濃度密切相關(guān)，以小鼠胰島分離中常用的collagenase P和collagenase V為例， 3 mg/mL的collagenase P消化時(shí)間一般為6～7 min，collagenase V一般為10 min[10]，但在本實(shí)驗(yàn)中，由于降低了膠原酶的濃度，因此本研究選取了幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)作為比較：10、15、18 min和20 min，本研究發(fā)現(xiàn)10 min與15 min的細(xì)胞得率極低，18 min與20 min均能夠得到純度高，包膜完整的細(xì)胞團(tuán)，因此本研究最終選擇18 min作為消化時(shí)間，不僅節(jié)約了時(shí)間，而且提高了胰島分離的產(chǎn)率。(3)分離純化后NOD小鼠胰島的體外培養(yǎng)：由于在胰島分離純化過程中，胰島會(huì)受到許多外界壓力的損傷，例如失巢凋亡[11]、缺氧和受損胰腺外分泌細(xì)胞所釋放蛋白酶的損傷作用等[12-13]。 因此，通過體外培養(yǎng)過程，有利于所分離胰島活性和功能的修復(fù)。此外，由于胰腺外分泌部細(xì)胞在體外懸浮培養(yǎng)條件下不易存活，也有利于排除胰島分離過程中受損的胰腺外分泌細(xì)胞。本研究之所以選擇葡萄糖濃度為11.1 mmol/L的RPMI 1640培養(yǎng)基，是由于有研究顯示，當(dāng)培養(yǎng)基的葡萄糖濃度低于11 mmol/L時(shí)，胰島細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)糖代謝的基因表達(dá)將下調(diào)，而當(dāng)葡萄糖濃度高于11 mmol/L時(shí)，將導(dǎo)致培養(yǎng)胰島細(xì)胞的損傷[14]。

在胰島生物學(xué)功能研究方面，本研究在體外的糖刺激實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，血糖正常NOD小鼠胰島的刺激指數(shù)(SI=高糖刺激胰島素分泌量/低糖刺激胰島素分泌量比值)僅為1.33，遠(yuǎn)低于KM小鼠。這表明由血糖正常NOD小鼠分離的胰島細(xì)胞團(tuán)，其胰島素分泌功能已經(jīng)受損。這與NOD小鼠在4到5周出現(xiàn)胰島炎的報(bào)道相一致。在NOD小鼠同基因異體的移植實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)胰島移植后所有NOD糖尿病小鼠的血糖水平明顯降低，表明移植胰島在受體小鼠體內(nèi)能夠分泌胰島素調(diào)節(jié)宿主血糖，但移植胰島在改善受體小鼠高血糖狀態(tài)時(shí)間長(zhǎng)短方面?zhèn)€體差異較大，有的受體小鼠在移植后，高血糖逆轉(zhuǎn)僅能維持15 d，有的可維持50 d以上。由于是同基因小鼠間的移植，因此不存在同種異體排斥反應(yīng)，出現(xiàn)上述移植胰島不能在受體小鼠體內(nèi)長(zhǎng)期存活的原因，可能是已發(fā)生糖尿病的受體NOD小鼠自身免疫系統(tǒng)對(duì)移植胰島的破壞所造成。本研究體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，在移植后期，在殘存移植胰島的周圍存在大量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。綜上所述，本研究為今后利用NOD小鼠同基因異體胰島移植模型，探討1型糖尿病胰島移植治療中如何保護(hù)移植胰島免受自身免疫系統(tǒng)攻擊，提供了一定的研究基礎(chǔ)和借鑒。

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