黃統(tǒng)生，郭赟，楊陳，安寧，葉霖，唐皓璇，黃希杰，許勇芝，潘慶軍，劉華鋒

(廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腎病研究所，湛江市慢性腎臟病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湛江 524001)

Conflict of interest statement: We declare that we have no conflict of interest statement.

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是指各種原因引起的腎功能快速丟失為特點(diǎn)的臨床綜合征[1]。除具有較高的死亡風(fēng)險(xiǎn)外，AKI患者遠(yuǎn)期預(yù)后很差，常進(jìn)展成慢性腎臟病(chronic kidney disease, CKD)和終末期腎臟疾病(end stage renal disease, ESRD)[2]。由于AKI向CKD轉(zhuǎn)化的機(jī)制尚未闡明，因此針對(duì)性的改善AKI轉(zhuǎn)歸的治療方法仍十分缺乏。

目前可用于研究AKI向CKD轉(zhuǎn)化時(shí)腎臟病理生理學(xué)改變和機(jī)制的動(dòng)物模型非常少。缺血再灌注、腎毒性物質(zhì)以及膿毒血癥等刺激因素引起的AKI動(dòng)物模型大多應(yīng)用在急性期腎損傷研究，難以觀察到AKI向CKD轉(zhuǎn)化的過程。因此，需要建立一些更好地反映AKI向CKD轉(zhuǎn)化過程的動(dòng)物模型，以闡明AKI向CKD轉(zhuǎn)化機(jī)制，研發(fā)針對(duì)性治療策略。

順鉑(cisplatin)是臨床上常用的治療實(shí)體瘤的一種化療藥物,具有劑量依賴的腎毒性[3]。小鼠單次大劑量(>25 mg/kg)注射順鉑，可構(gòu)建模擬腎毒性物質(zhì)引起的AKI模型。但此模型導(dǎo)致腎損傷過于嚴(yán)重，動(dòng)物死亡率高，無法用于AKI向CKD轉(zhuǎn)化的相關(guān)研究[4]。既往報(bào)道慶大霉素可誘導(dǎo)大鼠腎小管間質(zhì)纖維化模型[5]，還有通過口服腺嘌呤[6]、腎大部切除和腎梗死制備的大鼠5/6腎切除模型[7]、單側(cè)輸尿管梗阻模型[8]等方法建立慢性腎功能不全的動(dòng)物模型。此外，Daisuke等[9]報(bào)道了順鉑可導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化。結(jié)合既往研究報(bào)道，我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)中，采用小劑量反復(fù)注射順鉑的方法，引起小鼠慢性腎功能不全的表現(xiàn)，有望為研究AKI向CKD的轉(zhuǎn)化機(jī)制提供了新的模型。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)采用SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠(8周齡，體重22～23 g)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【SCXK(粵)2013-0002】，飼養(yǎng)于廣東醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障環(huán)境中【SYXK(粵)2015-0147】，環(huán)境溫度為(25±2)℃，濕度為50%～70%，12 h光照陰暗交替。本實(shí)驗(yàn)得到廣東醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)許可(倫理審查批準(zhǔn)編號(hào)：GDY1702001)，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均按照廣東醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的操作指南執(zhí)行，并符合中華人民共和國《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.1.2 試劑

順鉑和天狼星紅染料購買于美國Sigma公司；肌酐檢測(cè)試劑盒和N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase，NAG)試劑盒購買于南京建成生物科技有限公司；山羊抗腎損傷分子1 (kidney injury molecule 1， KIM-1)抗體購買于美國R&D公司，兔抗CD3抗體和兔抗膠原Ⅰ抗體購買于美國Abcam公司，大鼠抗小鼠F4/80抗體購買于美國Bio-Rad公司 (MCA497GA)；DAB顯色試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記的驢抗山羊IgG抗體和山羊抗兔IgG抗體均購買于碧云天生物科技公司，Alexa594標(biāo)記的驢抗大鼠IgG抗體購買于美國Invitrogen公司(A-21209)，DAPI試劑購買于中國Beyotime公司(C1005)。其他試劑均購自國內(nèi)外知名試劑公司，化學(xué)試劑至少為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 反復(fù)注射順鉑造模

24只C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組(CON組)、順鉑低劑量組(LD 組)、順鉑中劑量組(MD 組)以及順鉑高劑量組(HD 組)，共4組，每組6只小鼠。順鉑組按體重采用腹腔注射順鉑，低劑量為5 mg/kg，中劑量為7 mg/kg，高劑量為10 mg/kg，每周1次，連續(xù)注射4周。于每周注射后3 d收血液和尿液標(biāo)本備檢。于第4次注射后3 d處死小鼠，留取血液、尿液以及腎組織標(biāo)本待檢。

1.2.2 尿液收集和相關(guān)檢測(cè)

小鼠置代謝籠中收集24 h尿液標(biāo)本。尿液經(jīng)4000 r/min離心15 min，去除尿沉渣，-20℃保存。采用Bradford法檢測(cè)小鼠尿液蛋白水平，結(jié)合尿量計(jì)算小鼠24 h尿蛋白排泌量。利用試劑盒檢測(cè)小鼠尿液NAG水平。

1.2.3 血肌酐的檢測(cè)

采用尾靜脈采血每周收集小鼠少量血液標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)采血方法：動(dòng)物麻醉后，心臟取血約1 mL，4℃靜置于EDTA-Na2抗凝管30 min后, 4000 r/min離心15 min,分離出血漿，-80℃保存。按照血肌酐檢測(cè)試劑盒說明書的步驟，檢測(cè)小鼠血漿肌酐濃度。

1.2.4 腎臟病理染色

腎組織經(jīng)甲醛固定24 h后，梯度脫水，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋并切片。石蠟切片經(jīng)PAS染色(periodic acid-Schiff staining)后,在顯微鏡下觀察并進(jìn)行腎小管損傷評(píng)分。損傷指標(biāo)包括壞死細(xì)胞、刷狀緣脫落、管型及小管擴(kuò)張。按照每個(gè)200倍鏡視野下,損傷指標(biāo)所占面積百分比評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為0分：0～5 %，1分：5%～10%，2分：11%～25 %，3分：26%～45 %，4分：46%～75 %；5分：>76 %。采用雙盲隨機(jī)分析方法，取5個(gè)視野平均值進(jìn)行評(píng)估分析[10]。

1.2.5 免疫組化染色

檢測(cè)腎組織中KIM-1、膠原Ⅰ和CD3的表達(dá)。石蠟切片脫蠟水化后，利用枸櫞酸修復(fù)液進(jìn)行高壓抗原修復(fù)，然后過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶；接著用含正常血清的磷酸鹽緩沖液封閉切片，再滴加抗KIM-1抗體(按1∶100稀釋)或抗CD3抗體(按1∶50稀釋)或抗膠原Ⅰ抗體(按1∶100稀釋)，4℃過夜，用磷酸鹽緩沖液代替一抗做空白對(duì)照。第二天，切片清洗后，滴加相應(yīng)二抗(按1∶200稀釋)，DAB顯色，梯度酒精脫水、封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。KIM-1、膠原Ⅰ和CD3抗體檢測(cè)在腎組織中出現(xiàn)棕黃色染色為陽性。每張切片于200倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，用Image J軟件照相并對(duì)KIM-1和膠原Ⅰ免疫組化染色進(jìn)行分析，以面積表示KIM-1和膠原Ⅰ陽性表達(dá)的相對(duì)含量。每張切片于200倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)CD3表達(dá)陽性的T細(xì)胞數(shù)。

腎組織切片進(jìn)行天狼星紅染色，梯度酒精脫水、封片，顯微鏡下觀察。每張切片于200倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，用Image J軟件拍照并對(duì)天狼星紅染色進(jìn)行分析，以面積表示天狼星紅染色陽性的的相對(duì)含量。

1.2.6 免疫熒光染色法

冰凍組織切片經(jīng)磷酸鹽緩沖液清洗后，用含2.5%牛血清白蛋白的緩沖液封閉30 min，滴加抗F4/80抗體(按1∶100稀釋)，4℃過夜。次日清洗后，滴加熒光二抗(按1∶100稀釋)，孵育1 h后，滴加DAPI染核，用抗熒光淬滅劑封片。利用磷酸鹽緩沖液替代一抗做空白對(duì)照。熒光顯微鏡鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況

順鉑高劑量組有1只小鼠死亡，其余各組小鼠均生存至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。對(duì)照組小鼠體重平穩(wěn)，而順鉑各劑量組小鼠體重較給藥前均有下降。與注射順鉑前相比，順鉑高劑量組小鼠體重從第2周始至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)顯著下降，差異有顯著性(P<0.001)(圖1)。此外，高劑量組小鼠一般情況較其他組差，表現(xiàn)為精神萎靡，毛發(fā)缺少光澤，及行動(dòng)遲緩。

注：A.各組小鼠血漿肌酐濃度；B.各組小鼠24 h尿蛋白水平。與對(duì)照組比較，* P<0.05；*** P<0.001。CON代表對(duì)照組，LD代表順鉑低劑量組，MD代表順鉑中劑量組，HD代表順鉑高劑量組。圖2 反復(fù)注射順鉑對(duì)各組小鼠血漿肌酐濃度和尿蛋白水平的影響Note. A: plasma creatinine. B: 24-hour urinary protein.Compared with the control group, * P<0.05.*** P<0.001. CON: Control group. LD: Low-dose cisplatin group. MD: Medium-dose cisplatin group. HD: High-dose cisplatin group.Fig.2 Effects of repeated administration of cisplatin on plasma creatinine and 24-hour urinary protein in the mice

注：與對(duì)照組比較， ***P<0.001。CON代表對(duì)照組，LD代表順鉑低劑量組，MD代表順鉑中劑量組，HD代表順鉑高劑量組。W代表周數(shù)。圖1 反復(fù)注射順鉑對(duì)各組小鼠體重的影響Note. Compared with the control group, *** P<0.001. CON: control group. LD: low-dose cisplatin group. MD: medium-dose cisplatin group. HD: high-dose cisplatin group.W:weeks.Fig.1 Effect of repeated administration of cisplatin on body weight in the mice

2.2 各組小鼠血漿肌酐濃度和尿蛋白水平

與對(duì)照組相比，反復(fù)注射不同劑量順鉑均能引起小鼠血漿肌酐濃度上升和增加小鼠24 h尿蛋白排泌。其中順鉑高劑量組血漿肌酐濃度和24 h尿蛋白排泌量升高最為顯著，與對(duì)照組相比差異有顯著性(P<0.05)(圖2)。

2.3 各組小鼠腎臟病理學(xué)變化情況

對(duì)照組小鼠腎臟組織腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)正常。腎小管細(xì)胞上皮細(xì)胞連接緊密、形態(tài)規(guī)則、排列整齊、邊緣完整，細(xì)胞間隙未見水腫和炎癥浸潤。低劑量組病變較輕，偶見腎小管上皮細(xì)胞脫落；而中劑量組的腎組織皮質(zhì)局部可見有腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣的脫落，基底膜部分裸露，炎性細(xì)胞浸潤。高劑量組腎臟病變最重，腎組織皮質(zhì)、皮髓交界可見大面積上皮細(xì)胞壞死，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、刷狀緣消失、基底膜裸露、上皮細(xì)胞脫落及管型形成。

通過統(tǒng)計(jì)腎小管損傷評(píng)分發(fā)現(xiàn)，隨著注射的順鉑濃度增加，腎小管損傷評(píng)分逐漸升高；高劑量組小管損傷顯著高于對(duì)照組，差異有顯著性 (P<0.01)(圖3)。

注：A. 各組小鼠腎組織PAS染色(PAS×400, bar=50 μm)；B. 各組小鼠腎小管損傷評(píng)分與對(duì)照組比較，**P<0.01；與低劑量組比較，#P<0.01。CON代表對(duì)照組，LD代表順鉑低劑量組，MD代表順鉑中劑量組，HD代表順鉑高劑量組。圖3 各組小鼠腎組織病理情況Note. A. PAS staining, bar=50 μm. B. Tubulo-interstitial damage score(±s). Compared with the control group, **P<0.01. Compared with the low-dose cisplatin group, #P<0.01. CON: Control group. LD: Low-dose cisplatin group. MD: Medium-dose cisplatin group. HD: High-dose cisplatin group.Fig.3 Pathological changes of kidney tissues in the mice

2.4 各組小鼠腎小管損傷標(biāo)記物KIM-1表達(dá)和尿液NAG水平

通過免疫組化檢測(cè)腎小管損傷標(biāo)記物KIM-1的表達(dá)以及試劑盒檢測(cè)尿液NAG的活性，進(jìn)一步明確各組小鼠腎小管損傷情況。如圖4所示，與對(duì)照組相比，隨著順鉑注射濃度的增加，腎臟組織中KIM-1陽性腎小管數(shù)量逐漸增多，且順鉑高劑量組顯著多于對(duì)照組，差異有顯著性(P<0.05)。尿NAG水平的升高可以反應(yīng)小管損傷情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，僅順鉑高劑量組小鼠尿NAG活性有所提升，但差異無顯著性。

注：A.各組小鼠腎組織免疫組化KIM-1染色(IHC×400, bar=50 μm，黑色箭頭為KIM-1的陽性表達(dá)腎小管；B.各組小鼠尿液NAG的活性與對(duì)照組比較，*P<0.05。CON代表對(duì)照組，LD代表順鉑低劑量組，MD代表順鉑中劑量組，HD代表順鉑高劑量組。圖4 各組小鼠腎小管損傷情況Note. A. Expression of KIM-1 in the kidney tissue in each group (immunohistochemistry staining，× 400, bar=50 μm. Black arrows: KIM-1 positive expression in the tubules. B: KIM-1 positive expression area (%). C: Urinary NAG activity(±s). Compared with the control group, *P<0.05. CON represents the control group, LD represents low-dose cisplatin group, MD represents the medium-dose cisplatin group, and HD represents the high-dose cisplatin group.Fig.4 Changes of tubulo-interstitial damage of the mice in each group

2.5 各組小鼠腎臟CD3陽性T細(xì)胞和F4/80陽性巨噬細(xì)胞的浸潤情況

免疫組化法檢測(cè)各組小鼠腎組織CD3陽性T細(xì)胞和F4/80陽性巨噬細(xì)胞的浸潤情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，反復(fù)注射不同劑量順鉑均能引起小鼠腎組織浸潤的CD3陽性T細(xì)胞和F4/80陽性巨噬細(xì)胞增多(巨噬細(xì)胞主要分布在腎小管-間質(zhì)周圍，紅色熒光，形態(tài)為狹長條形)，但差異無顯著性(圖5)。上述結(jié)果提示，反復(fù)注射順鉑引起T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤可能參與腎臟病變進(jìn)程。

注：A. 各組小鼠腎臟CD3陽性T細(xì)胞的表達(dá)；B. 各組小鼠F4/80陽性巨噬細(xì)胞的表達(dá)；C. CD3陽性T細(xì)胞的數(shù)量(IHC，×400，bar=50 μm)黑色箭頭為CD3陽性細(xì)胞表達(dá)，黃色箭頭為F4/80陽性細(xì)胞表達(dá)。CON代表對(duì)照組，LD代表順鉑低劑量組，MD代表順鉑中劑量組，HD代表順鉑高劑量組。圖5 各組小鼠腎小管-間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤情況Note. A. Expressions of CD3 positive T cells in the kidney tissues (immunohistochemical staining). B. Expressions of F4/80 positive macrophages in the kidney tissues (immunofluorescence staining). C. Numbers of CD3 positive T cells (IHC, ×400，bar=50 μm，black arrows indicate CD3 positive cells, yellow arrows indicate F4/80 positive cells). CON represents the control group, LD represents the low-dose cisplatin group, MD represents the medium-dose cisplatin group, and HD represents the high-dose cisplatin group.Fig.5 Changes of tubulo-interstitial inflammatory cells in the mice of each group

2.6 各組小鼠腎臟纖維化情況

天狼星紅染色可將腎組織的膠原蛋白染成亮紅色，是檢測(cè)器官纖維化的常用染色方法之一。如圖6所示，對(duì)照組腎小管-間質(zhì)可見少量天狼星紅染色陽性的膠原組織。而與對(duì)照組相比，隨著順鉑注射濃度的增加，腎臟組織中天狼星紅染色陽性面積逐漸增多，且順鉑高劑量組顯著多于對(duì)照組，差異有顯著性 (P<0.001)。進(jìn)一步利用免疫組化檢測(cè)各組小鼠腎臟膠原I的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，隨著注射的順鉑濃度增加，腎臟組織中膠原I染色陽性區(qū)域逐漸增多，且順鉑中劑量和高劑量組顯著多于對(duì)照組，差異有顯著性(P<0.05和P<0.01)。不僅如此，與對(duì)照組相比，隨著注射的順鉑濃度增加，腎臟組織中表達(dá)肌成纖維細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA的細(xì)胞數(shù)量顯著增加，高劑量組顯著多于對(duì)照組，差異有顯著性(P<0.01)。上述結(jié)果提示，反復(fù)注射順鉑可以引起小鼠腎臟發(fā)生纖維化。

注：A. 腎組織天狼星紅染色；B. 腎組織膠原I免疫組化染色；C. 腎組織α-SMA免疫組化染色；D. 天狼星紅染色的陽性表達(dá)面積；E. collagen I的陽性表達(dá)面積；F. α-SMA的陽性表達(dá)面積與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與低劑量組比較，# P<0.05，###P<0.001；與中劑量組比較，&&P<0.01。CON代表對(duì)照組，LD代表順鉑低劑量組，MD代表順鉑中劑量組，HD代表順鉑高劑量組。(IHC×400，黑色箭頭為陽性表達(dá)，bar=50 μm)圖6 各組小鼠的腎組織纖維化改變Note. A. Sirius red staining. B. Expression of collagen I. C. Expression of α-SMA. D. Sirius red positive expression. E. Collagen I positive expression. F. α-SMA positive expression.(±s).Compared with the control group, *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001; Compared with the low-dose cisplatin group, # P<0.05，###P<0.001; compared with the medium-dose cisplatin group, &&P<0.01. CON: Control group. LD: Low-dose cisplatin group. MD: Medium-dose cisplatin group. HD: High-dose cisplatin group.(immunofluorescence staining, ×400, black arrows indicate positive expression of tubulo-interstitial changes，bar=50 μm)Fig.6 Tubulo-interstitial fibrosis in the kidney tissue of the mice in each group

3 討論

小鼠單次大劑量(20～40 mg/kg)注射順鉑可誘導(dǎo)嚴(yán)重的AKI模型，常用于研究AKI急性期病理學(xué)改變和機(jī)制，但由于腎損傷過重，小鼠易死亡，不適用于研究順鉑慢性腎毒性作用以及AKI向CKD轉(zhuǎn)化相關(guān)研究。低劑量反復(fù)多次注射順鉑，更符合臨床癌癥化療指南推薦的劑量和療程，能模擬順鉑所致的腎臟長期慢性毒副作用，且小鼠死亡率低。本實(shí)驗(yàn)中，小鼠每周注射一次10 mg/kg的順鉑，連續(xù)注射4周，可誘導(dǎo)腎功能、病理生理改變均較符合臨床CKD患者腎臟狀態(tài)的CKD模型。

既往研究中，常利用大鼠作為順鉑誘導(dǎo)腎小管-間質(zhì)纖維化模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，但由于機(jī)制研究需要轉(zhuǎn)基因操作，而大量現(xiàn)存的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物以小鼠最多。因此，近年有課題組嘗試在小鼠上構(gòu)建此種模型。此前曾有報(bào)道C57BL/6背景小鼠不易產(chǎn)生纖維化[11]，而本實(shí)驗(yàn)所采用的方法成功誘導(dǎo)C57BL/6背景小鼠腎臟發(fā)生纖維化，表現(xiàn)為肌成纖維細(xì)胞數(shù)量增多和腎小管-間質(zhì)膠原沉積增加，提示反復(fù)注射順鉑在C57BL/6背景小鼠上誘導(dǎo)慢性腎功能不全模型是可行的。此外，我們的模型也可以適用于小鼠的腫瘤模型使用順鉑長期治療后的腎毒性研究。

順鉑所致AKI的主要受累的是近端小管的上皮細(xì)胞，引起細(xì)胞凋亡、壞死，此過程涉及T 細(xì)胞，T reg細(xì)胞，巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的浸潤[12]。本實(shí)驗(yàn)中，反復(fù)注射10 mg/kg順鉑的模型組小鼠出現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、刷狀緣消失、基底膜裸露、上皮細(xì)胞脫落及管型形成等病理學(xué)改變。慢性腎病的組織學(xué)特點(diǎn), 例如:小管-間質(zhì)纖維化、小管萎縮或擴(kuò)張,小球結(jié)構(gòu)基本完整，這些病變?cè)诒緦?shí)驗(yàn)中均可見。目前認(rèn)為，順鉑可引起腎小管上皮細(xì)胞線粒體功能障礙、DNA損傷、反應(yīng)氧簇生成增多、凋亡、壞死等病變[13]，誘導(dǎo)腎小管-間質(zhì)炎癥反應(yīng)，造成小管細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)則直接引起小鼠腎衰竭，甚至死亡。而損傷輕微時(shí)(如小劑量單次注射順鉑)，殘存的小管細(xì)胞通過去分化、增殖、再分化的途徑補(bǔ)充受損小管細(xì)胞，完成腎臟修復(fù)。有研究指出一旦小管細(xì)胞受到超出修復(fù)能力的持續(xù)打擊，小管上皮細(xì)胞則停滯在細(xì)胞周期的G2/M期，產(chǎn)生促纖維化因子，如TGF-β增多，從而分泌膠原I和α-SMA等，誘導(dǎo)腎臟纖維化[14]。因此，腎小管上皮細(xì)胞損傷和修復(fù)是影響AKI轉(zhuǎn)歸的核心環(huán)節(jié)[15]。

本實(shí)驗(yàn)所采取的反復(fù)注射適量順鉑會(huì)引起小管細(xì)胞反復(fù)損傷，可能通過誘導(dǎo)其發(fā)生不恰當(dāng)修復(fù)，參與慢性腎功能不全的病變進(jìn)程。而反復(fù)注射順鉑引起腎小管上皮細(xì)胞高表達(dá)的KIM-1，可能是參與此過程的關(guān)鍵分子之一。研究發(fā)現(xiàn)，KIM-1可以促進(jìn)順鉑的腎毒性病情發(fā)展[16]。在本實(shí)驗(yàn)中，反復(fù)注射10 mg/kg順鉑可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞KIM-1表達(dá)顯著升高。大量的文獻(xiàn)證實(shí)，正常情況下，腎臟組織幾乎不表達(dá)KIM-1蛋白，但是在腎臟損傷后數(shù)小時(shí)內(nèi)的表達(dá)水平即顯著升高，且其表達(dá)量隨腎小管損傷范圍的增加明顯升高。KIM-1可誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞持續(xù)分泌多種促炎癥因子，使腎臟處于活化的前炎癥反應(yīng)狀態(tài)，進(jìn)而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞及T細(xì)胞遷徙入腎間質(zhì)，大量活化的炎癥細(xì)胞促發(fā)腎臟炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致腎間質(zhì)炎癥損傷及進(jìn)行性纖維化加重[17-18]。我們對(duì)各組模型的腎臟組織進(jìn)行CD3和F4/80染色，可以看到，模型組皮質(zhì)和皮髓交界處有很明顯的KIM-1表達(dá)，且小管間質(zhì)可見CD3陽性T細(xì)胞和F4/80陽性巨噬細(xì)胞的浸潤，提示反復(fù)注射順鉑引起小管細(xì)胞高表達(dá)的KIM-1可能是介導(dǎo)模型慢性炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵分子。

眾所周知，腎小管-間質(zhì)纖維化是各種原因引起的CKD的共同的病理學(xué)變化，其損害程度與腎功能毀損程度密切相關(guān)是加速腎功能衰竭的主要驅(qū)動(dòng)力。本實(shí)驗(yàn)中，反復(fù)注射順鉑引起小鼠腎臟肌成纖維細(xì)胞數(shù)量增多和腎小管-間質(zhì)膠原沉積增加的纖維化病變。表達(dá)α-SMA的肌成纖維細(xì)胞是公認(rèn)的強(qiáng)力產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腎臟纖維化的關(guān)鍵細(xì)胞，其來源很廣。有報(bào)道稱，發(fā)生不恰當(dāng)修復(fù)的可通過Twist和Snail介導(dǎo)的上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化途徑(epithelial-mesenchymal transition，EMT)轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞[19]，分泌大量膠原等細(xì)胞外基質(zhì)，參與腎小管-間質(zhì)纖維化[20]。此外，最近研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠梗阻腎模型中，巨噬細(xì)胞通過轉(zhuǎn)分化成肌成纖維細(xì)胞，參與腎臟纖維化[21-22]。而在體外實(shí)驗(yàn)，最近報(bào)道了M2型巨噬細(xì)胞可以協(xié)同成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)順鉑條件下的腎小管上皮細(xì)胞EMT，促進(jìn)腎小管-間質(zhì)纖維化的進(jìn)展[23]。本實(shí)驗(yàn)中，反復(fù)注射順鉑引起大量巨噬細(xì)胞浸潤腎臟，極可能通過此途徑參與后續(xù)腎小管-間質(zhì)纖維化進(jìn)程，可能還有更多的免疫細(xì)胞參與到這個(gè)過程，但尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，這為研究AKI向CKD轉(zhuǎn)化的治療提供了靶點(diǎn)。

本研究通過在C57BL/6小鼠上反復(fù)注射順鉑，引起小鼠腎小管損傷、腎臟T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤增多以及腎小管-間質(zhì)纖維化病變，進(jìn)而造成小鼠血肌酐上升和尿蛋白排泌增多，引起腎功能下降，炎癥，纖維化等慢性腎功能不全的表現(xiàn)，有望為后續(xù)研究AKI向CKD的轉(zhuǎn)化過程提供新的工具。此研究有一定的應(yīng)用價(jià)值，可進(jìn)行慢性腎功能不全的實(shí)驗(yàn)研究，如何保護(hù)腎功能、延緩甚至逆轉(zhuǎn)腎功能的進(jìn)展等熱點(diǎn)。

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