房軍帆，王思思，孫海櫸，邵曉梅，梁宜，方劍喬，杜俊英*

(1. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，杭州 310005； 2. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)，杭州 310053)

Conflict of interest statement: We declare that we have no conflict of interest statement.

慢性疼痛是長期以來困擾醫(yī)學(xué)界的主要難題之一。導(dǎo)致該問題的主要原因之一，是慢性痛的產(chǎn)生機制至今尚不明確。部分疼痛研究者提出，慢性痛、急性痛和持續(xù)性疼痛三者可能具有完全不一樣的機制[1-3]。但是現(xiàn)有的大量疼痛動物模型，或為持續(xù)性疼痛動物模型，或急/慢性疼痛同時存在，難以精確確定慢性痛產(chǎn)生或轉(zhuǎn)化的時間點，限制了慢性疼痛產(chǎn)生機制的深入研究[4-5]。

動物敏化誘發(fā)(hyperalgesia priming)模型是一種較為特殊的疼痛動物模型[6- 7]。該模型通過兩次藥物干預(yù)制造慢性疼痛動物模型。該模型的特點在于，慢性疼痛的產(chǎn)生被人為控制，從而使慢性疼痛與急性疼痛分離，為研究急性痛如何向慢性轉(zhuǎn)化(痛轉(zhuǎn)化)和慢性痛的產(chǎn)生機制提供了良好的動物模型。

基于該模型，有部分研究指出，外周神經(jīng)元中蛋白酶激活受體2(proteinase-activated receptors 2，PAR2)通路的活化與痛轉(zhuǎn)化密切相關(guān)[8]，其下游物質(zhì)蛋白激酶Cε(PKCε)和蛋白激酶A(PKA)均部分參與了痛轉(zhuǎn)化的產(chǎn)生[9-10]。其中PKA可能主要參與急性痛階段，而PKCε可能主要參與慢性痛階段。本研究擬建立動物敏化誘發(fā)模型，探索抑制PAR2活化是否能同時抑制痛轉(zhuǎn)化過程中的急性痛和慢性痛，并為疼痛研究介紹新的動物模型和研究思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡、清潔級雄性健康SD大鼠30只，體重200～220 g，購自上海斯萊克實驗動物責任有限公司【SCXK(滬)2013-0016】，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)【SYXK(浙)2013-184】。飼養(yǎng)期間給予嚙齒類動物標準顆粒飼料和飲水，恒溫20～24℃，恒濕50%～70%。并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 試劑與儀器

PGE2(Sigma-Aldrich公司，P5640)；FSLLRY-NH2(Tocris公司，245329-02-6)；兔抗大鼠PAR2一抗(Proteintech公司，12160-1-AP)；兔抗大鼠PKCε一抗(Proteintech公司，20877-1-AP)；兔抗大鼠PKA一抗(Santa Cruz公司，sc-365615)；兔抗大鼠GAPDH一抗(Cell Signaling Technology公司，3683)；生物素標記山羊抗兔二抗(Abcam公司，ab6721)；PVDF膜(Milipore公司，IPVH00010)；其余試劑均為市售分析純級。

Von-Fery絲套裝(美國Stoelting公司)；多功能全波長酶標儀(美國Molecular Devices公司)；垂直電泳槽、快速半干轉(zhuǎn)印儀器(美國Bio-Red公司)；Image4000凝膠成像系統(tǒng)(美國GE公司)。

1.3 分組及處理

采用隨機數(shù)字法將實驗大鼠隨機分為空白組(control組)、假誘發(fā)組(sham model組)、誘發(fā)組(model組)、抑制劑1組(iPAR2-1組)和抑制劑2組(iPAR2-2組)，每組6只。

誘發(fā)組、抑制劑1組、抑制劑2組大鼠于左側(cè)后足足底皮下注射1%角叉菜膠0.1 mL，7 d后于相同足足背注射100 ng /25 μL PGE2[11]。

假誘發(fā)組大鼠于左側(cè)后足足底皮下注射生理鹽水0.1 mL，7 d后與相同足足背注射100 ng /25 μL PGE2?？瞻捉M大鼠于左側(cè)后足足底皮下注射生理鹽水0.1 mL，7 d后與相同組足背注射生理鹽水25 μL。抑制劑1組大鼠在PGE2注射前5 min，于造模足足背注射PAR2抑制劑FSLLRY-NH2 10 μg/25 μL。抑制劑2組大鼠在PGE2注射后5 min，于造模足足背注射PAR2抑制劑FSLLRY-NH2 10 μg/25 μL。

1.4 痛閾觀察

采用Von Frey進行痛閾測量[12]。選取0.4、0.6、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、15.0 g和26.0 g總計9種強度的Von Frey絲。將大鼠置于不銹鋼絲網(wǎng)上的有機玻璃罩內(nèi)。待大鼠安靜后，從4.0 g強度Von Frey絲開始測量。將Von Frey絲對準大鼠左后足足底(劈開足墊)，緩慢上抬Von Frey絲，至絲彎曲成S形，連續(xù)刺激8 s。如大鼠產(chǎn)生逃避則記錄為X，并降低Von Frey絲強度繼續(xù)測量。如大鼠未產(chǎn)生逃避則記錄為O，并提升Von Frey絲強度繼續(xù)測量。連續(xù)進行6次測量，每次測量最小間隔2 min，獲得一組XO組合序列。按如下公式進行痛閾計算：MWT(g)=(10[Xf + κδ])/10 000。Xf代表最后一次測量的Von Fery絲強度，κ值由“X”、“O”組合序列查表后獲得，δ約等于0.231(各強度Von Frey絲力度取對數(shù)后差值的平均值)。如最后計算結(jié)果超過Von Frey絲所含強度(>26.0 g或<0.4 g)，則取26.0 g或0.4 g作為最后結(jié)果。行為學(xué)測量時間固定在9:00-16:00，環(huán)境溫度：(23±2)℃。

1.5 免疫印跡檢測大鼠L4-L6背根神經(jīng)節(jié)(DRG)PAR2、PKA和PKCε的表達

注射角叉菜膠(生理鹽水)后7 d 24 h，完成痛閾測量后，腹腔麻醉大鼠。經(jīng)升主動脈灌注預(yù)冷0.9% NaCl溶液?？焖偃〕鲎髠?cè)L4-L6背根神經(jīng)節(jié)，置于-80℃待用。DRG放入RIPA裂解液中超聲粉碎，離心取上清液，BCA蛋白定量。取20 μg蛋白上樣，5% SDS- PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，10%脫脂奶粉封閉，分別用兔抗大鼠的PAR2、PKA、PKCε和小鼠抗大鼠GAPDH抗體孵育，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗或山羊抗小鼠二抗孵育，ECL試劑盒顯色后拍照，計算條帶的平均光密度值，GAPDH為內(nèi)部對照。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準誤表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。均以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 痛覺敏化誘發(fā)大鼠PWTs改變

角叉菜膠注射后5 h，model組大鼠PWTs明顯減低，低于同期control組(P<0.01)，該效應(yīng)一直持續(xù)到角叉菜膠注射后3 d(P<0.01)。至注射后6 d，角叉菜膠的致痛效應(yīng)徹底消退，與同期control組差異無顯著性(P>0.05)。注射生理鹽水無致痛效應(yīng)，sham model組在注射后6 d內(nèi)，大鼠PWTs與control組比差異無顯著性(P>0.05)。注射后7 d，給予model組和sham model組大鼠PGE2足背注射處理。

給予PGE2后0.5 h，model組和sham model組大鼠PWTs均快速下降，明顯低于同期control組(P<0.01)。至PGE2注射后24 h，model組大鼠PWTs一直維持在低水平，顯著低于同期control組(P<0.01)。而sham model組大鼠PWTs快速恢復(fù)正常，在PGE2注射后4 h即與control組大鼠處于同一水平，差異無顯著性(P>0.05)。以上結(jié)果提示，先后給予角叉菜膠和PGE2能誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生痛覺敏化 (圖1)。

注:與同期空白組比較：**P<0.01；與同期假誘發(fā)組比較：△△P<0.01。圖1 大鼠機械痛閾改變Note. **P<0.01，versus the control group.△△P<0.01，versus the sham model group.Fig.1 Changes of paw withdrawal thresholds in the rats

2.2 痛覺敏化誘發(fā)大鼠DRG中PAR2，PKA，PKCε表達改變

PGE2注射后24 h，model大鼠左側(cè)L4-6DRG中PAR2和PKCε表達均顯著增高(圖2 A，C)，明顯多于同期control組大鼠(P<0.01)。而sham model組大鼠PAR2和PKCε表達均無明顯改變(圖2 A，C)，與control組相比差異無顯著性(P>0.05)。PGE2注射后24 h，三組大鼠左側(cè)L4-6DRG中PKA表達處于同一水平(圖2B)，三組間比較差異無顯著性(P>0.05)。以上提示，DRG中PAR2和PKCε表達增多可能與大鼠痛覺敏化發(fā)生相關(guān)。

注: A.大鼠腰段DRG神經(jīng)元PAR2蛋白表達統(tǒng)計圖和western blot代表圖；B.大鼠腰段DRG神經(jīng)元PKA蛋白表達統(tǒng)計和western blot代表圖；C.大鼠腰段DRG神經(jīng)元PKCε蛋白表達統(tǒng)計和western blot代表圖；空白組比較：**P<0.01；與假模型組比較：△△P<0.01。圖2 大鼠腰段DRG神經(jīng)元PAR2、PKA和PKCε蛋白表達Note. A. The expression levels of PAR2 in the rat lumbar DRG neurons and a representive image of western blot. B. The expression levels of PKA in the rat lumbar DRG neurons and a representive image of western blot. C.The expression levels of PKCε in the rat lumbar DRG neurons and the representive image of western blot. **P<0.01，versus the control group；△△P<0.01，versus the sham model group.Fig.2 Expression levels of PAR2, PKA and PKCε in the rat lumbar DRG neurons

2.3 不同時間點注射PAR2抑制劑對大鼠PWTs的影響

不論是在PGE2注射前給予PAR2抑制劑(圖3 A)，還是在PGE2注射后給予PAR2抑制劑(圖3B)，均未能干預(yù)PGE2注射后4 h內(nèi)，大鼠PWTs的降低。給予PGE2后4 h，即角叉菜膠/生理鹽水注射后7 d 4 h，iPAR2-1和iPAR2-2組大鼠PTWs與sham model組相比差異無顯著性(P>0.05)。但是，在PGE2注射后24 h，給予PAR2抑制劑的大鼠，其PWTs均出現(xiàn)了明顯的回升，iPAR2-1和iPAR2-2組大鼠PTWs顯著高于同期sham model組(P<0.01)。其中，在PGE2注射前給予PAR2抑制劑，大鼠PWTs能完全恢復(fù)至正常水平，與同期sham model組相比差異無顯著性(P>0.05)(圖3 A)。而在PGE2注射后給予PAR2抑制劑，僅能部分恢復(fù)7 d 24 h大鼠PWTs，仍低于同期sham model組(P<0.01)(圖3B)。

注: A.PGE2注射前給予PAR2抑制劑對大鼠機械痛閾的影響；B. PGE2注射后給予PAR2抑制劑對大鼠機械痛閾的影響PGE2注射前給予PAR2抑制劑對大鼠機械痛閾的影響；與同期假誘發(fā)組比較：△△P<0.01；與同期誘發(fā)組相比：## P<0.01。圖3 PAR2抑制劑對大鼠機械痛閾改變的影響Note.A. Effect of PAR2 inhibitor on the paw withdrawal thresholds in the rats when it was administerted before PGE2 injection. B. Effect of PAR2 inhibitor on the paw withdrawal thresholds in the rats when it was administerted after PGE2 injection. △△P<0.01，versus the sham model group；## P<0.01，versus the model group.Fig.3 Effect of PAR2 inhibitor on the changes of paw withdrawal thresholds in the rats

2.4 不同時間點注射PAR2抑制劑對DRG中PKCε和PKA表達的影響

給予PAR2抑制劑，無論是在PGE2注射前還是PGE2注射后，均能明顯抑制大鼠L4-6DRG中PKCε的高表達(圖4C，D)，PGE2注射后24 h，iPAR2-1和iPAR2-2組大鼠腰段DRG中PKCε表達顯著低于同期model組大鼠(P<0.05)，與同期sham model組相比差異無顯著性(P>0.05)。但是，給予PAR2并未對PKA表達產(chǎn)生任何作用(圖4 A，B)，iPAR2-1組和iPAR2-2組大鼠腰段PKA表達與model組相比差異無顯著性(P>0.05)。

注: A.PGE2注射前給予iPAR2對大鼠腰段DRG神經(jīng)元PKA蛋白表達的影響；B.PGE2注射后給予iPAR2對大鼠腰段DRG神經(jīng)元PKA蛋白表達的影響；C.PGE2注射前給予iPAR2對大鼠腰段DRG神經(jīng)元PKCε蛋白表達的影響；D.PGE2注射后給予iPAR2對大鼠腰段DRG神經(jīng)元PKCε蛋白表達的影響；與同期假模型組相比：△△P<0.01；與同期模型組相比：#P<0.05。圖4 大鼠腰段DRG神經(jīng)元PKA和PKCε蛋白表達Note.A. The effect of iPAR2 on the expression levels of PKA in lumbar DRG neurons of the rats when it was given before PGE2 injection. B. The effect of iPAR2 on the expression levels of PKA in lumbar DRG neurons of the rats when it was given after PGE2 injection. C. The effect of iPAR2 on the expression levels of PKCε in lumbar DRG neurons of the rats when it was given before PGE2 injection. D. The effect of iPAR2 on the expression levels of PKCε in lumbar DRG neurons of the rats when it was given after PGE2 injection.△△P<0.01，versus the sham model group；# P<0.05，versus the model group.Fig.4 Expression levels of PKA and PKCε in lumbar DRG neurons of the rats

3 討論

慢性疼痛的治療一直是醫(yī)學(xué)界的難題。受限于動物模型，疼痛研究者一直難以將慢性疼痛與持續(xù)性疼痛進行分離。比如，經(jīng)典的慢性炎性痛動物模型，弗氏完全佐劑誘導(dǎo)大鼠足趾局部炎性疼痛。在該模型中，大鼠足趾局部炎癥能持續(xù)存在14 d以上，導(dǎo)致急性痛(炎癥自身誘導(dǎo))和慢性痛(炎癥導(dǎo)致神經(jīng)可塑性改變產(chǎn)生)相互混雜。又比如傳統(tǒng)的神經(jīng)病理性痛動物模型，人為造成的神經(jīng)損傷會持續(xù)存在，導(dǎo)致神經(jīng)損傷疼痛(急性痛)和神經(jīng)可塑性改變疼痛(慢性痛)混雜。這些急/慢性疼痛的混雜，必然導(dǎo)致機制的混雜。如不論在神經(jīng)病理性疼痛還是炎性疼痛中，外周神經(jīng)元PKA和PKCε的高表達，均被認為是維持慢性疼痛存在的重要機制[13-14]。但基于痛覺敏化誘發(fā)模型的研究發(fā)現(xiàn)，慢性疼痛的機制并不一定如此。

痛覺敏化誘發(fā)模型的引入，為研究者分別研究急性痛、慢性痛和痛轉(zhuǎn)化提供了可能。該模型的最大特點在于通過2次注射，精確的控制慢性疼痛的產(chǎn)生。炎癥刺激后，足底注射前列腺素2(PGE2)誘發(fā)的疼痛時間被顯著延長，被認為是痛覺過敏的產(chǎn)生。如文中圖1所示，正常情況下，PGE2僅能誘導(dǎo)不足4 h的急性疼痛。但當大鼠的神經(jīng)元發(fā)生可塑性改變后，PGE2能誘導(dǎo)出超過24 h的疼痛。這種疼痛沒有明確的誘因(如炎癥或神經(jīng)損傷)，能持續(xù)存在超過14 d，被認為是相對純凈的慢性疼痛[11]。該模型的另一特點為，在誘發(fā)慢性痛前，大鼠的痛閾處于正常狀態(tài)。即大鼠處于一種外在無明顯疼痛表現(xiàn)，而神經(jīng)元可能已存有某些改變的狀態(tài)下[15]。為研究者進一步探索慢性痛發(fā)病的病理基礎(chǔ)提供了可能。

目前，通過對該模型的研究已有部分不同于過往認識的結(jié)果。研究者發(fā)現(xiàn)，PKA和PKCε在疼痛中扮演的角色并不一樣[16]。在疼痛由急性痛向慢性痛轉(zhuǎn)化的過程中，外周神經(jīng)元中PKA的高表達參與了急性期疼痛，即PGE2刺激導(dǎo)致的疼痛。而PKCε則參與了慢性痛的產(chǎn)生，即痛覺敏化。進一步使用兩者的特異性證明，抑制外周PKA表達能有效防止PGE2誘導(dǎo)的急性疼痛(<4 h)，但不能緩解慢性疼痛。抑制外周PKCε表達能有效緩解慢性疼痛的產(chǎn)生(>24 h)，但對于急性疼痛無效。與前人研究一致，本研究中我們觀察到造模后24 h，敏化外周神經(jīng)元中PKCε的高表達，但PKA的表達沒有明確改變。以上結(jié)果提示，敏化誘發(fā)模型復(fù)制成功。

PAR2是PKA和PKCε共同的上游物質(zhì)之一，抑制PAR2能抑制PKA和PKCε的活化[17]。過往的研究表明，PAR2-PKA和PAR2-PKCε通路均參與了疼痛的產(chǎn)生和維持[18-19]。因此，注射PAR2可能能同時改善PGE2誘發(fā)的急性痛和慢性痛。本研究中，我們在PGE2注射前后分別進行注射PAR2的特異性抑制劑FSLLRY-NH2，并觀察其對敏化誘發(fā)大鼠痛閾的影響。PGE2注射前給予FSLLRY-NH2其目的在于同時抑制PKA和PKCε的高表達，而PGE2注射后給予FSLLRY-NH2其目的在于抑制PKCε的高表達，而不影響PKA。結(jié)果證明，不論在PGE2注射前還是注射后給予PAR2抑制劑，均能顯著改善由PGE2誘發(fā)的慢性疼痛，并明顯抑制PKCε在外周神經(jīng)元中的表達。但兩種注射方案，均未能改善PGE2誘導(dǎo)的急性疼痛，也未能改變造模后24 h敏化大鼠外周神經(jīng)元PKA的表達。

綜上所述，痛覺敏化誘發(fā)模型是一種適用于研究慢性痛的產(chǎn)生的疼痛動物模型。外周神經(jīng)元PAR2-PKCε通路活化介導(dǎo)了急性痛向慢性痛的轉(zhuǎn)化。但是，介導(dǎo)急性期疼痛的PKA可能并非通過PAR2活化。

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