謝東杰，王愛(ài)迪，王偉濤，張 樂(lè)，張 珊，劉寶山△

(1. 天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津 300052； 2. 天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193)

免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenic purpura, ITP)是一種由免疫異常介導(dǎo)的以血小板減少、骨髓巨核細(xì)胞成熟障礙為特性的自身免疫性疾病[1]。血小板減少所致的凝血障礙使出血風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，血小板極度減少時(shí)(<10×109/L)可出現(xiàn)多處黏膜及內(nèi)臟出血，顱內(nèi)出血可給患者帶來(lái)致命性的威脅。Notch信號(hào)通路通過(guò)影響巨核細(xì)胞的生成及免疫細(xì)胞的分化而直接參與ITP的發(fā)病進(jìn)程[2-3]。益氣養(yǎng)陰清熱化瘀方是由犀角地黃湯、當(dāng)歸補(bǔ)血湯、二至丸組合而成，長(zhǎng)期臨床實(shí)踐證明該方在治療ITP時(shí)療效確切，但其發(fā)揮作用的藥理機(jī)制并未得以充分揭示[4]。本研究以Notch信號(hào)為靶點(diǎn)，旨在探索該方在治療ITP的可能機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

BALB/c雌性小鼠60只，6～7周齡，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司(SCXK(京)2014-0004),適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 主要藥物及試劑

益氣養(yǎng)陰清熱化瘀方組成：生黃芪50 g，當(dāng)歸10 g，女貞子15 g，旱蓮草15 g，水牛角粉(先煎)30 g，生地黃25 g，白芍10 g，丹皮10 g。所有中藥均購(gòu)自天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房并由藥劑科鑒定；醋酸潑尼松片：天津力生制藥；大鼠抗小鼠CD41單克隆抗體(MWReg30單抗)：BD Biosciences 公司；RPMI1640培養(yǎng)基、PBS緩沖液：美國(guó)Gibco公司；柱式Trizd總RNA提取試劑盒：上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；Realtime PCR試劑盒：東洋紡生物科技有限公司；5%BSA 封閉液：上海碧云天生物技術(shù)公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、PVDF 膜、10×麗春紅染色液：北京索萊寶科技公司；Notch1-4、Jagged1、Jagged2單克隆抗體購(gòu)自英國(guó) Abcam 公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒：北京康為世紀(jì)生物科技公司；生物素標(biāo)記羊抗兔 IgG、DAB 顯色試劑盒：武漢博士德生物公司。

1.3 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱：美國(guó)THERMO公司；自動(dòng)平衡離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；電泳儀PS3000：美國(guó)Hoefer Scientific Instruments，RealtimePCR儀：美國(guó)Stratagene；凝膠成像儀：Biorad；恒溫水浴箱HXS-H：哈爾濱東聯(lián)公司；蒸汽壓力滅菌器：山東新華安得醫(yī)療用品公司。

2 方法

2.1 藥物制備

將干燥的藥材粉碎并過(guò)40目篩，按劑量配比稱取各飲片后加入70%乙醇(10倍量)浸泡過(guò)夜，超聲提取1 h，濾過(guò)再次提取40 min，2次濾液合并最后濃縮成濃度2 g/ml的溶液。用蒸餾水將醋酸潑尼松片(5 mg/片)配制為濃度為1 mg/ml的溶液，將制備好的各組藥液均置4 ℃冰箱中備用。

2.2 ITP模型的建立

將60只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組10只，ITP模型組50只。結(jié)合文獻(xiàn)[5]采用針對(duì)血小板表面膜糖蛋白GPIIb/IIIa的被動(dòng)免疫法，將模型組小鼠腹腔每日注射含2 μg 大鼠抗小鼠CD41單克隆抗體(MWReg30單抗)的磷酸鹽緩沖液200 μL共21 d，造成持續(xù)的血小板減少癥，建立ITP小鼠模型,正常組則注射等量生理鹽水。

2.3 血液采集

造模前及造模后第1、3、5、7天，分別通過(guò)尾靜脈取20 μL 靜脈血測(cè)量血小板數(shù)量評(píng)估造模情況。藥物干預(yù)2周后，抽取外周血檢測(cè)血小板計(jì)數(shù)，評(píng)估藥物提升血小板效果。

2.4 給藥方法

第8天將ITP小鼠模型按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、中藥(益氣養(yǎng)陰清熱化瘀方)低、中、高劑量組、西藥對(duì)照組(以醋酸潑尼松對(duì)照)各10只，并按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》中人與動(dòng)物體表面積換算公式計(jì)算所得給藥劑量進(jìn)行藥物干預(yù)。中藥低劑量組25 g/kg，中劑量組50 g/kg，高劑量組100 g/kg，西藥對(duì)照組0.2 ml/只，正常組和ITP模型組給予生理鹽水0.2 ml/只，每日2次，灌服2周。

2.5 骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNC)分離及培養(yǎng)

治療結(jié)束后，采用頸椎脫臼法處死小鼠分離出雙側(cè)股骨，剪斷股骨兩端，用2 ml的血清反復(fù)沖洗骨髓腔，將收集到的骨髓細(xì)胞離心，上清液置于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 Pg/ml鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，再分別加入T淋巴細(xì)胞活化劑PHA和不加PHA2組，充分混勻后在37 ℃、 5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)48 h，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，細(xì)胞濃度調(diào)整為5.0×105/ml備用。

2.6 Real-time PCR檢測(cè)Notch信號(hào)分子基因的表達(dá)

表1顯示，按TRIzol說(shuō)明提取BMMNS的總RNA，用轉(zhuǎn)錄試劑盒將200 ng RNA 按逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系合成cDNA，并通過(guò)ABI 7900 qPCR 體系對(duì)cDNA定量；PCR 擴(kuò)增體系20 μL，其中所測(cè)目的基因的引物序列；擴(kuò)增條件為：預(yù)變性：95 ℃，2 min；變性：94 ℃，20 s；退火：65 ℃， 20 s；延伸：72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH 作為內(nèi)參，基于Ct值來(lái)確定目的基因的相對(duì)表達(dá)量(基因的表達(dá)量RQ=2—△△Ct)。

表1 Notch信號(hào)分子引物序列

2.7 Western blot檢測(cè)Notch信號(hào)分子蛋白的表達(dá)

使用裂解液將BMMNS 裂解獲取總蛋白樣本，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE分離蛋白，電泳、轉(zhuǎn)膜，用5%BSA封閉液封閉1 h，加入一抗4 ℃反應(yīng)過(guò)夜，TBST洗滌3次，加入二抗孵育1 h，TBST洗膜，ECL法顯影，使用Quantity one軟件處理，以GAPDH 為內(nèi)參分析目的條帶的光密度值。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 ITP模型的建立

圖1顯示，正常組血小板水平波動(dòng)無(wú)顯著性變化；與正常組比較，ITP模型組在注射CD41單克隆抗體(MWReg30單抗)1 d后便引起血小板顯著減少，3 d后下降趨勢(shì)逐漸平穩(wěn)，第7天達(dá)到最低水平，符合ITP模型鼠的血小板特征。

圖1 ITP小鼠模型的建立

3.2 益氣養(yǎng)陰清熱化瘀方對(duì)ITP模型鼠血小板的影響

表2顯示，治療結(jié)束后外周血血小板計(jì)數(shù)顯示，與ITP模型組比較，中藥各劑量組血小板數(shù)值均有不同幅度的升高(P<0.05))，其中中藥中、高劑量組效果接近西藥對(duì)照組，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 治療結(jié)束后各組小鼠PLT計(jì)數(shù)比較

注：與正常組比較：△P<0.05；與模型組比較：☆P<0.05，☆☆P<0.01；與西藥對(duì)照組比較：*P<0.05

表3 各組小鼠Notch分子基因表達(dá)水平比較

注：與正常組比較：△△P<0.01；與模型組比較：☆☆P<0.01

表4 各組小鼠Notch分子蛋白表達(dá)水平比較

注：與正常組比較：△P<0.05；與模型組比較：☆P<0.05

3.3 益氣養(yǎng)陰清熱化瘀方對(duì)Notch信號(hào)分子基因表達(dá)的影響

表3顯示，模型組Jagged1、Jagged2、Notch1、Notch2、Notch3、Notch4的基因表達(dá)與正常組比較均異常升高(P<0.01)；與模型組比較，各治療組基因表達(dá)水平均有不同程度的降低(P<0.01)，其中中藥中劑量組的降低趨勢(shì)與高、低劑量組比較更加明顯。

3.4 益氣養(yǎng)陰清熱化瘀方對(duì)Notch信號(hào)分子蛋白表達(dá)的影響

表4顯示，為進(jìn)一步驗(yàn)證Notch分子基因轉(zhuǎn)錄的改變最終導(dǎo)致翻譯水平的變化，Western blot用于檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平。與Notch分子基因表達(dá)變化相一致，模型組Notch1-4和Jagged1 2蛋白水平與正常組比較異常增高(P<0.05)；經(jīng)藥物干預(yù)后，各治療組的蛋白表達(dá)水平與模型組比較均降低(P<0.05),其中中藥中劑量組與高、低劑量組比較降低程度較為顯著。

4 討論

作為一種異質(zhì)性疾病，ITP從癥狀到治療反應(yīng)都表現(xiàn)出較大的差異性[6]。目前治療可選擇的藥物也較單一，糖皮質(zhì)激素作為ITP標(biāo)準(zhǔn)的一線治療方案，能快速提升血小板，減少出血傾向。然而一旦停藥復(fù)發(fā)率高，且長(zhǎng)期服藥帶來(lái)的一系列并發(fā)癥可能超過(guò)其治療本身[1]。脾切除也要面臨終生的感染風(fēng)險(xiǎn)，甚至增加腫瘤的患病幾率[7]；其他治療如利妥昔單抗、TPO-RA由于多種原因，在臨床使用中也存在較大的局限性。考慮到西藥治療面臨的多種問(wèn)題，從中醫(yī)理論中探索新的治療方法則具有較大的優(yōu)勢(shì)。

ITP屬于中醫(yī)學(xué)“紫癜”“血證”范疇，其病機(jī)可概括為“熱、虛、瘀”三端，是以“氣陰兩虛為本，熱毒瘀血為標(biāo)”的虛實(shí)錯(cuò)雜性疾病。本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜、瘀血貫穿于始終是本病的病理特點(diǎn)[8]。根據(jù)法隨證立、方從法出的治則，確定益氣養(yǎng)陰、清熱化瘀為其治療大法。本實(shí)驗(yàn)以戴錫孟多年經(jīng)驗(yàn)效方為基礎(chǔ)，選用當(dāng)歸補(bǔ)血湯、二至丸及犀角地黃湯組合為益氣養(yǎng)陰清熱化瘀方，方中以當(dāng)歸補(bǔ)血湯合二至丸補(bǔ)氣養(yǎng)陰和血，以針對(duì)ITP發(fā)病之本虛，犀角地黃湯清熱涼血化瘀，治其血熱瘀滯之標(biāo)實(shí)，三方合用標(biāo)本兼顧，共奏益氣養(yǎng)陰、清熱化瘀之功，同時(shí)效《血證論》之補(bǔ)血、止血、凝血、消瘀的治血四大原則。本研究通過(guò)MWReg30單抗成功誘導(dǎo)出ITP小鼠模型，經(jīng)益氣養(yǎng)陰清熱化瘀方治療后血小板水平持續(xù)升高，且中、高劑量與西藥比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明該方有確切的升血小板作用。

總的來(lái)說(shuō)，血小板產(chǎn)生減少和破壞增加是ITP血小板持續(xù)減少的兩大原因。Notch信號(hào)在分化上高度保守，廣泛存在于機(jī)體的多種細(xì)胞中，由Notch受體、Notch配體、CSL蛋白和細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)分子組成。在哺乳動(dòng)物中，Notch受體包含Notch1-Notch4 4種類型；Notch配體分屬2個(gè)家族，即Delta like 家族(Delta-like1，3，4)和Jagged家族(Jagged1-2)。Notch信號(hào)通過(guò)經(jīng)典和非經(jīng)典途徑對(duì)細(xì)胞各個(gè)階段、多種功能(細(xì)胞增殖、分化、激活、凋亡)進(jìn)行調(diào)控[9]。在造血系統(tǒng)中，Notch信號(hào)能夠在造血干/祖細(xì)胞水平影響巨核細(xì)胞分化，從而與血小板的生成直接相關(guān)[2]；另一方面在免疫系統(tǒng)中，Notch信號(hào)通過(guò)與其他通路間的“cross-talk”，可對(duì)多種免疫細(xì)胞的分化與功能起重要的調(diào)節(jié)作用，特別是能控制活化CD4+T細(xì)胞的效應(yīng)表型，從而調(diào)控著機(jī)體的免疫狀態(tài)[3]。病理狀態(tài)下，Notch 信號(hào)的異?；罨c多種自身免疫性疾病及血液疾病密切相關(guān)[10-11]。先前的研究已經(jīng)顯示出ITP患者Notch分子呈現(xiàn)出異常的表達(dá)[12]。本研究顯示，ITP模型組Notch分子-受體Notch1-4和配體Jagged1-2 的基因與蛋白表達(dá)水平均異常升高?？梢钥闯?，Notch信號(hào)通路參與ITP的發(fā)病進(jìn)程，上調(diào)的Notch信號(hào)可能通過(guò)直接影響巨核細(xì)胞的成熟或造成機(jī)體免疫失衡而使血小板生成減少、破壞增加，最終導(dǎo)致血小板減少癥。本試驗(yàn)顯示，益氣養(yǎng)陰清熱化瘀方連續(xù)治療2周后可使異常增高的Notch信號(hào)分子顯著下降。另外，Notch分子下降的幅度與增加的血小板計(jì)數(shù)呈顯著相關(guān)性，表明益氣養(yǎng)陰清熱化瘀方可能通過(guò)影響Notch信號(hào)的表達(dá)而起到升血小板作用。

綜上所述，Notch信號(hào)通路參與ITP的病理進(jìn)程，益氣養(yǎng)陰清熱化瘀方能夠影響ITP小鼠Notch受體、配體的表達(dá)，而抑制Notch信號(hào)的過(guò)度激活，進(jìn)一步調(diào)節(jié)巨核細(xì)胞的成熟及多種免疫細(xì)胞的分化和功能，最終影響血小板的生成與破壞，對(duì)ITP 產(chǎn)生積極的治療作用。

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